蛋白质组学精选PPT.ppt

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1、关于蛋白质组学第1页，讲稿共102张，创作于星期三背背 景景基因数量有限性和基因结构的相对稳定性 VS 生命现象的复杂性和多变性 从genomic到proteome第2页，讲稿共102张，创作于星期三n对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。第3页，讲稿共102张，创作于星期三nTheeraofomics-basedsciencenGenomics（基因组学）nPost-genomicscience（后基因组时代）nFunctionalgenomics（功能基因组学）Transcriptomics（转录组学）Proteomics

2、（蛋白质组学）Metabolomics（代谢组学）nStructuralgenomics（结构基因组学）Aim-3Dstructuresofallproteinfolds!第4页，讲稿共102张，创作于星期三 第一节第一节 蛋白质组学的概念及发展进展蛋白质组学的概念及发展进展 第二节第二节 蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法 第三节第三节 蛋白质组功能模式的研究方法蛋白质组功能模式的研究方法 主要内容主要内容第5页，讲稿共102张，创作于星期三 第一节第一节 蛋白质组学的概念蛋白质组学的概念及发展进展及发展进展第6页，讲稿共102张，创作于星期三蛋白质组（蛋白质组（prote

3、ome）：）：PROTEins+genOME，意思是，意思是Proteins expressed by a genome（基因组表达的所有蛋白（基因组表达的所有蛋白质）。质）。1994年由年由Williams和和Wilkins提出，是一个动态的概念，指提出，是一个动态的概念，指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质。的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质。蛋白质组和蛋白质组学的概念蛋白质组和蛋白质组学的概念第7页，讲稿共102张，创作于星期三n对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。局限于一个或几个蛋白质。n同一基因组在不同细胞、

4、不同组织中的表达情同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同况各不相同。n在空间和时间上动态变化着的整体。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组：蛋白质组：第8页，讲稿共102张，创作于星期三蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)(proteomics)指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞质之间的相互作用与联系

5、，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。生命活动规律。第9页，讲稿共102张，创作于星期三主要研究内容主要研究内容 了解某种特定的细胞、组织了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；或器官制造的蛋白质种类；明确各种蛋白质分子是如明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；何形成类似于电路的网络的；描绘蛋白质的精确三维结构，揭示描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。且决定其活性的部位。第10页，讲稿共102张，创作于星期三表达蛋白组学表达蛋白组学The study of global changes in pr

6、otein expressionProteomics蛋白质组功能模式蛋白质组功能模式The systematic study of protein-protein interactions through the isolation of protein complexes蛋白质组研究包括两个方面：蛋白质组研究包括两个方面：第11页，讲稿共102张，创作于星期三第12页，讲稿共102张，创作于星期三 基因组基因组 转录组转录组 蛋白组蛋白组The study of proteins expressed by genomesCompletion of the sequencing of the

7、1st draft of human genome indicates there are approximately 250,000 proteins in the human genomeOnly 2-5%of proteins in human genome have been identified第13页，讲稿共102张，创作于星期三第14页，讲稿共102张，创作于星期三功能蛋白质组学功能蛋白质组学(functional proteomics)的提出的提出 n功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。现象相关的所有蛋白质。n介

8、于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。第15页，讲稿共102张，创作于星期三n从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。n将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的命细胞的“全部蛋白质全部蛋白质”的蛋白质组图谱。的蛋白质组图谱。第16页，讲稿共102张，创作于星期三发展进展发展进展各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：19961996年澳大利亚建立了世

9、界上第一个蛋白质组研年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（究中心（Australia Proteome Analysis Australia Proteome Analysis FacilityFacility，APAFAPAF）第17页，讲稿共102张，创作于星期三美国国立癌症研究院（美国国立癌症研究院（NCINCI）投资）投资1 0001 000万美元万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。数据库。NCINCI和和FDAFDA共同投资共同投资数百万数百万美元建立癌症不同阶段美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。的蛋白质组数据库。英国

10、建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。第18页，讲稿共102张，创作于星期三CeleraCelera公司投资上亿美元独自启动了全面公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。质表达数据库的工作。第19页，讲稿共102张，创作于星期三1997年召开了第一次国际年召开了第一次国际“蛋白质组学蛋白质组学”会议会议1998年在美国

11、旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议1999年年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议 第20页，讲稿共102张，创作于星期三我国也于我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会性的蛋白质组学研讨会 第21页，讲稿共102张，创作于星期三2003成成 立立 了了 中中 国国 人人 类类 蛋蛋 白白 质质 组组 组组 织织（CHHUPO），并并 分分 别别 于于 2003年年 9月月、2004年年8月月

12、以以及及2005年年8月月召召开开了了中中国国蛋蛋白白质质组组学学首首届届、第第二二届届及及第第三三届届学学术术大大会会，2004年年10月月在在中中国国北北京京召召开开了了第第三三届届国国际际蛋白质组学会议。蛋白质组学会议。第22页，讲稿共102张，创作于星期三n 科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划计划项目和项目和“863”计划项目计划项目；国家自然科学基金委员会也国家自然科学基金委员会也将将“蛋白质组研究蛋白质组研究”列为重点项目。列为重点项目。n我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了

13、较大的进展究方面取得了较大的进展。第23页，讲稿共102张，创作于星期三第二节第二节蛋白质组表达模式的研究方法蛋白质组表达模式的研究方法第24页，讲稿共102张，创作于星期三n研究蛋白质组组成成分、差异和功能主要研究目标 第25页，讲稿共102张，创作于星期三（一）蛋白质组研究中的样品制备（一）蛋白质组研究中的样品制备 n通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。进行蛋白质组分析。n也可以进行样品预分级，即将细胞或组织也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。研究。第26页，

14、讲稿共102张，创作于星期三样品预分级的主要方法样品预分级的主要方法n蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等n蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等n蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等第27页，讲稿共102张，创作于星期三 样品预分级主要作用在于提高低样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。第28页，讲稿共102张，创作于星期三组织水平上的蛋白质组样品制备组织水平上的蛋白质组样品制备 临床样本都是各种细胞或组织混杂，而临床样本都是各种细

15、胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。与血管、基质细胞等混杂。第29页，讲稿共102张，创作于星期三激光捕获显微切割激光捕获显微切割(laser capture(laser capture microdissectionmicrodissection，LCM)LCM)可直接在显微镜下从组织切片中精确可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。分离特定的细胞或细胞群。第30页，讲稿共102张，创作于星期三（二）蛋白质组研究中的样品分离n双向凝胶电泳双向凝胶电泳two-dimensional electr

16、ophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。白质的方法。第31页，讲稿共102张，创作于星期三第32页，讲稿共102张，创作于星期三第33页，讲稿共102张，创作于星期三特特 点点n可分离可分离10100 kD分子量的蛋白质分子量的蛋白质n高灵敏度和高分辨率高灵敏度和高分辨率n便于计算机进行图像分析处理便于计算机进行图像分析处理 n与质谱分析匹配与质谱分析匹配 第34页，讲稿共102张，创作于星期三2-DE技术的缺点技术的缺点 极极酸酸、极极碱碱性性蛋蛋白白质质，疏疏水水性性蛋蛋白

17、白质质，极极大大蛋蛋白白质质、极极小小蛋蛋白白质质以以及及低低丰丰度度蛋蛋白白质质用用此此种技术难于有效分离。种技术难于有效分离。胶胶内内酶酶解解过过程程费费时时、费费力力，难难于于与与质质谱谱联联用用实现自动化。实现自动化。第35页，讲稿共102张，创作于星期三新型非凝胶技术新型非凝胶技术 液相色谱法液相色谱法liquid chromatography，LC毛细管电泳毛细管电泳capillary electrophoresis，CE第36页，讲稿共102张，创作于星期三 （三）常见蛋白质显色技术（三）常见蛋白质显色技术 考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色第37页，讲稿共102张，创作于星期三常见显

18、色方法比较第38页，讲稿共102张，创作于星期三考染和考染和银染的比较银染的比较第39页，讲稿共102张，创作于星期三第40页，讲稿共102张，创作于星期三第41页，讲稿共102张，创作于星期三有机染料和银染有机染料和银染n考染灵敏度为30100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。n胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为810ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。n胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。n银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析

19、造成影响。n这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。第42页，讲稿共102张，创作于星期三负负 染染n能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。n结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。n速度快（515min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。n它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。n该技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用。第43页，讲稿共102张，创作于星期三胶体扩散染料胶体扩散染料n主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。n最好的胶体

20、金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。n这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。第44页，讲稿共102张，创作于星期三有机荧光团染料有机荧光团染料n包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等荧光染料。n这三种染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约3060min完成，灵敏度为210ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。n这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。n在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白

21、质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。第45页，讲稿共102张，创作于星期三金属螯合染料金属螯合染料n这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。n其中SYPRORuby也是一种基于钌的金属发光染料。第46页，讲稿共102张，创作于星期三（四）凝胶的图像处理分析和胶内酶切（四）凝胶的图像处理分析和胶内酶切n凝胶图像的扫描：n图像加工：n斑点检测和定量：n

22、凝胶配比：n数据分析：n数据呈递和解释：n2-DE数据库的建立：第47页，讲稿共102张，创作于星期三第48页，讲稿共102张，创作于星期三n目前有多种图像分析软件可用于胶的图像分析:MelanieII(BioRad),PDQuest(BioRad),Phoretix2DFull,(AmershamPharmaciaBiotech)ImageMaster2dPlatinumn这些软件可以完成蛋白质点的识别、匹配等，具有很强的分析功能，但其缺点是需要很多的图像手工校对，第49页，讲稿共102张，创作于星期三第50页，讲稿共102张，创作于星期三第51页，讲稿共102张，创作于星期三正常肝细正常肝

23、细胞和肝癌胞和肝癌细胞的蛋细胞的蛋白质组双白质组双向电泳差向电泳差异表达谱异表达谱园点标记园点标记的点为两的点为两者的差异者的差异蛋白蛋白数字号码数字号码为蛋白质为蛋白质点在参考点在参考胶中的索胶中的索引号引号第52页，讲稿共102张，创作于星期三蛋白质的胶内酶切包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程第53页，讲稿共102张，创作于星期三第54页，讲稿共102张，创作于星期三（五）质谱分析（五）质谱分析样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定分子量定性定性定量定量质谱质谱m/z离子化离子化第55页，讲稿共102张，创作于星期三原理n质谱分析

24、是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。第56页，讲稿共102张，创作于星期三2020世纪初世纪初世纪初世纪初2020世纪世纪世纪世纪4040年代年代年代年代2020世纪世纪世纪世纪6060年代年代年代年代2020世纪世纪世纪世纪8080年代年代年代年代J.J.Thomson制成第一台质谱仪制成第一台质谱仪主要是用来进行同位素测定和无机元素分析主要是用来进行同位素测定和无机元素分析开始用于有机物分析开始用于有机物分析出现了气相色谱出现了气相色谱-质谱联用仪质谱联用仪成为有机物分析的重要仪器成为有机物分析的重要仪器质谱新技术：电喷雾电离源，大

25、气压化学电离源质谱新技术：电喷雾电离源，大气压化学电离源液相色谱液相色谱-质谱联用仪质谱联用仪感应耦合等离子体质谱仪感应耦合等离子体质谱仪质谱技术发展过程第57页，讲稿共102张，创作于星期三Sir Joseph John Thomson-1906年诺贝尔物理奖年诺贝尔物理奖主要贡献：气态下离子导电的理论和实验探索Frederick Soddy-1921年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖主要贡献：使我们对放射活性物质的认识大大提高，另外他对同位素的起源和性质也作了出色工作。Francis William Aston-1922年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖主要贡献：使用质谱方法大规模的研究非放射性元素的

26、同位素；提出整数规则。Hans G.Dehmelt and Wolfgang Paul-1989年同获诺贝尔物理奖年同获诺贝尔物理奖主要贡献：开发了离子阱质谱技术。Robert F.Curl Jr.&Sir Harold W.Kroto&Richard E.Smalley-1996年年分享诺贝尔化学奖分享诺贝尔化学奖主要贡献：使用质谱发现富洛伦尼斯（C60-C80，足球烯）John Fenn and Koichi Tanaka with Kurt Wuthrich-2002年分享诺贝尔化学奖年分享诺贝尔化学奖主要贡献：发展了可用于分析生物大分子的软电离方法。质质谱谱相相关关工工作作的的成成就就

27、第58页，讲稿共102张，创作于星期三离子源（离子源（Ion source）n质谱仪的离子源种类主要有：n化学电离源化学电离源(Chemical Ionization,CI)n快原子轰击源（快原子轰击源（Fast Atomic bombardment,FAB）n电喷雾源电喷雾源(Electron spray Ionization，ESI)n大气压化学电离源大气压化学电离源(Atmospheric pressure chemical Ionization,APCI)n大气压光学电离源（大气压光学电离源（Atmospheric pressure photoionization,APPI）n基质辅助

28、的激光解吸基质辅助的激光解吸电离源电离源（MALDI-TOF）n电子电离源电子电离源(Electron Ionization EI)第59页，讲稿共102张，创作于星期三每一种电离方法都有一定的分子量检测范围 EI/CIESI/FABAPPIAPCIMW100,00010,000100010010PolarityVery PolarNonpolar第60页，讲稿共102张，创作于星期三n电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期的两项轨电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol的水平

29、上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，并得到迅速的发展。n被称做是“软”电离技术，因为：他们在离子化过程中不会破坏分子结构，能实现分子量大于10,000质量单位的生物大分子的质量分析第61页，讲稿共102张，创作于星期三横坐标为离子的质核比，纵坐标为离子相对强度或相对横坐标为离子的质核比，纵坐标为离子相对强度或相对丰度。丰度。乙醇的如下：乙醇的如下：质谱图质谱图第62页，讲稿共102张，创作于星期三（六）蛋白质序列测定（六）蛋白质序列测定主要有两种方法：数据库搜索(Sequence database search):从头算法(De novo interpretation)第6

30、3页，讲稿共102张，创作于星期三两种方法各自的特点n数据库搜索算法将实验质谱与由数据库中的肽序列得到的理论质谱相关联,得到候选肽序列,它对质谱质量n要求不高,能够鉴定复杂的蛋白质样品,前提是待鉴定蛋白质样品的序列存在于数据库中.n从头算法利用实验质谱中谱峰之间的质量差直接计算出肽序列,不需要数据库的辅助,能够鉴定数据库中不存在的新序列,n但是它需要相对高质量的质谱数据第64页，讲稿共102张，创作于星期三瑞士的瑞士的SWISS-PROT数据数据库拥有目前库拥有目前世界上最大世界上最大、种类最多、种类最多的蛋白质的蛋白质组数据组数据蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标蛋白质组数据库是蛋白质组研

31、究水平的标志和基础志和基础 第65页，讲稿共102张，创作于星期三Mascot Search Engine第66页，讲稿共102张，创作于星期三Mascot MS/MS Ions Search第67页，讲稿共102张，创作于星期三第68页，讲稿共102张，创作于星期三第69页，讲稿共102张，创作于星期三第70页，讲稿共102张，创作于星期三第71页，讲稿共102张，创作于星期三第72页，讲稿共102张，创作于星期三第73页，讲稿共102张，创作于星期三第74页，讲稿共102张，创作于星期三第75页，讲稿共102张，创作于星期三第76页，讲稿共102张，创作于星期三第三节第三节 蛋白质组功能模

32、式的蛋白质组功能模式的研究方法研究方法第77页，讲稿共102张，创作于星期三n揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。主要研究目标 第78页，讲稿共102张，创作于星期三（一）蛋白质翻译后修饰的研究（一）蛋白质翻译后修饰的研究翻译后修饰翻译后修饰糖糖基基化化乙乙酰酰化化甲甲基基化化羧羧基基化化二二硫硫键键第79页，讲稿共102张，创作于星期三（二）蛋白质相互作用研究技术（二）蛋白质相互作用研究

33、技术n生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用序和协同作用 n新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现作用实现 n细胞信号转导及病原体感染和免疫反应细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 第80页，讲稿共102张，创作于星期三n1989年年Field 和和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。质相互作用的方法。n以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。1酵母双杂交系统（酵母双杂交系统（yeast

34、two-hybrid system）第81页，讲稿共102张，创作于星期三 转录激活因子转录激活因子GAL4的特点的特点nN N端含端含NLSNLS和与酵母和与酵母GAL1GAL1基因启动子上游激活基因启动子上游激活序列序列(UASG)(UASG)结合的结构域结合的结构域nC C端含端含GAL1GAL1转录激活结构域转录激活结构域 第82页，讲稿共102张，创作于星期三n功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性方式结合在一起才具有完整的转录因子活性 第83页，讲稿共102张，创作于星期三系系 统统 构构 建建n分别构建含

35、分别构建含GAL4 BD 和和AD 的两个酵母的两个酵母融合蛋白表达载体；融合蛋白表达载体；n建立含建立含特殊基因型特殊基因型、适用于双杂交体分析适用于双杂交体分析的酵母菌株的酵母菌株第84页，讲稿共102张，创作于星期三第85页，讲稿共102张，创作于星期三酵母双杂交技术的基本原理酵母双杂交技术的基本原理第86页，讲稿共102张，创作于星期三主要特点和优势主要特点和优势n使蛋白质表现型和基因型相联系使蛋白质表现型和基因型相联系n筛选筛选cDNA文库文库n真实反应体内蛋白质间相互作用情况真实反应体内蛋白质间相互作用情况n不需分离靶蛋白不需分离靶蛋白n敏感性高敏感性高 第87页，讲稿共102张，

36、创作于星期三缺缺 点点1.1.假阳性结果假阳性结果 2.2.假阳性结果假阳性结果 3.3.限于核内表达的蛋白质的相互作用限于核内表达的蛋白质的相互作用 第88页，讲稿共102张，创作于星期三 2基于质谱的蛋白质相互作用研究方法基于质谱的蛋白质相互作用研究方法n靶蛋白制备靶蛋白制备n蛋白质复合体的纯化蛋白质复合体的纯化n蛋白质复合体的质谱鉴定蛋白质复合体的质谱鉴定 基本步骤：基本步骤：第89页，讲稿共102张，创作于星期三（1）亲和层析耦联质谱技术）亲和层析耦联质谱技术 n基本原理：基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的（

37、如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋白的结）鉴定靶蛋白的结合蛋白。合蛋白。第90页，讲稿共102张，创作于星期三先决条件先决条件 n得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵（为诱饵（bait）n获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋获得足够量、纯度高的与

38、诱饵相互作用的蛋白质白质 第91页，讲稿共102张，创作于星期三主要优点主要优点 n灵敏度高：高浓度靶蛋白灵敏度高：高浓度靶蛋白 n候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等n检测多亚基蛋白质之间的相互作用检测多亚基蛋白质之间的相互作用第92页，讲稿共102张，创作于星期三（2）免疫共沉淀耦联质谱技术）免疫共沉淀耦联质谱技术 n原理：原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）纯化靶蛋白纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴

39、定靶免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。蛋白的结合蛋白。第93页，讲稿共102张，创作于星期三研究鼻咽癌细胞系中的研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白相互作用蛋白n抗抗p53抗体与抗体与HNE1和和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀总蛋白进行免疫共沉淀nSDS-PAGE分离免疫沉淀复合物分离免疫沉淀复合物n切取切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的肽序列标签）分析，得到相应的肽序列标签 n搜索数据库搜索数据库 第94页，讲稿共102张，创作于星期三特特 点点 生理条件下蛋白质之间的相互作

40、用生理条件下蛋白质之间的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用 第95页，讲稿共102张，创作于星期三局局 限限 性性A.灵敏性不高灵敏性不高 B.假阳性假阳性C.受免疫球蛋白的干扰较大受免疫球蛋白的干扰较大 第96页，讲稿共102张，创作于星期三（3）串联亲和纯化耦联质谱技术）串联亲和纯化耦联质谱技术 n基本原理：在靶蛋白一端或中部嵌入蛋白质标记（TAP Tag），经过特异性的两步亲和纯化，在生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质便可洗脱下来，然后用质谱技术对得到的蛋白质复合体进行鉴定。第97页，讲稿共10

41、2张，创作于星期三主要流程主要流程 双重分子标签构建到靶蛋白双重分子标签构建到靶蛋白 表达融合蛋白表达融合蛋白 制备细胞裂解液制备细胞裂解液 IgG柱纯化柱纯化 TEV蛋白酶的洗脱液洗脱蛋白质复合体蛋白酶的洗脱液洗脱蛋白质复合体 第98页，讲稿共102张，创作于星期三 耦联钙调素的亲和柱纯化耦联钙调素的亲和柱纯化 洗脱洗脱 含含EGTA的洗脱液洗脱的洗脱液洗脱 质谱鉴定结合蛋白质质谱鉴定结合蛋白质 续：续：第99页，讲稿共102张，创作于星期三特特 点点n获得生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质获得生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质 n鉴定出在空间上非直接物理相互作用的蛋白鉴定出在空间上非直接物

42、理相互作用的蛋白质质n适用于大规模蛋白质相互作用研究适用于大规模蛋白质相互作用研究 第100页，讲稿共102张，创作于星期三基基本本原原理理：将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。3.蛋白质芯片（蛋白质芯片（protein chips，protein array）技术）技术第101页，讲稿共102张，创作于星期三感感谢谢大大家家观观看看第102页，讲稿共102张，创作于星期三