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1、关于血红蛋白的提取和分离PPT(3)第1页，讲稿共33张，创作于星期三1.1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同的方法分离具有不同物理或化学性质的物理或化学性质的生物大分子生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种类不同种类的蛋白质。的蛋白质。基础
2、知识基础知识第3页，讲稿共33张，创作于星期三基础知识（一）基础知识（一）凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或琼脂糖琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。根据被分离的蛋白质根据被分离的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小，利用具的大小，利用具有有网状结构网状结构的凝胶的的凝胶的分子筛分子筛作用，来进行分离。作用，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量
3、较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;而相对而相对分子量较大分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝凝胶外部胶外部移动，路程移动，路程较短较短，移动速度，移动速度较快较快。相对分子质量不同相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。的蛋白质分子因此得以分离。依据的特性是：依据的特性是：依据的特性是：依据的特性是：蛋白质分子蛋白质分子蛋白质分子蛋白质分子量的大小。量的大小。量的大小。量的大小。第4页，讲稿共33张，创作于星期三4.4.凝胶色谱法分离蛋白质分离蛋白质的原理和具体
4、过程具体过程第5页，讲稿共33张，创作于星期三凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示第6页，讲稿共33张，创作于星期三 （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 1.1.概念概念:在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强外加少量强酸或强碱酸或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混不变的混合溶液。合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响，值的影响，维持维持PHPH基本不变基本不变。2.2.作用作用:3.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于
5、水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。4.4.4.4.提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是:_:_:_:_,其目的是其目的是其目的是其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的血红蛋白的正常结构和功能正常结构和功能，便于观察，便于观察(红色红色红色红色)和科和科 学研究学研究(活性活性活性活性)磷酸缓冲液磷酸缓冲液第7页，讲稿共33张，创作于星期三
6、 （三）（三）电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些基下，这些基团会带上正电或负电。团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质带电性质的差异以的差异以及及分子本身的大小，形状分子本身的大小，形状的不同
7、，使带电分子产生的不同，使带电分子产生不同的不同的迁移速度迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离，从而实现样品中各种分子的分离。3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。第8页，讲稿共33张，创作于星期三 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动所带电荷相反的电极移动所带电荷相反的电极移动所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图第9页，讲稿共33张，创作
8、于星期三 1.1.1.1.用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNADNADNA，用哺乳动物的红细胞提取血，用哺乳动物的红细胞提取血，用哺乳动物的红细胞提取血，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？红蛋白的原因是什么？红蛋白的原因是什么？红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞鸡的红细胞鸡的红细胞鸡的红细胞具有细胞核，具有细胞核，具有细胞核，具有细胞核，含有含有含有含有DNADNADNADNA，便于进行，便于进行，便于进行，便于进行DNADNADNADNA的提的提的提的提取；取；取；取；人的人的人的人的红细胞无细胞核红细胞无细胞核红细胞无细胞核红细胞无细胞核，结构
9、简单，结构简单，结构简单，结构简单，血红蛋白含量丰富血红蛋白含量丰富血红蛋白含量丰富血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。便于提取血红蛋白。便于提取血红蛋白。便于提取血红蛋白。二、实验操作二、实验操作实验材料的选择实验材料的选择实验材料的选择实验材料的选择第15页，讲稿共33张，创作于星期三1.1.红细胞的洗涤红细胞的洗涤2.2.血红蛋白的释放血红蛋白的释放3.3.分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液4.4.透析透析离心去除血浆离心去除血浆加蒸馏水涨破加蒸馏水涨破离心处理离心处理除去小分子杂质除去小分子杂质凝胶色谱法进行分离和纯化，将分子凝胶色谱法进行分离和纯化，将分子量较大的杂质蛋白除去量较大的杂
10、质蛋白除去SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量，和纯度鉴定对分子质量，和纯度鉴定样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤第16页，讲稿共33张，创作于星期三 二、实验操作二、实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定1.1.1.1.样品处理：样品处理：样品处理：样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。动物的血液来分离血红蛋白。(1)(
11、1)(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤:洗涤目的洗涤目的洗涤目的洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，分离纯化，洗涤次数不可过少洗涤次数不可过少。洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作：1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间低速短时间离心（速离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）达不到分离的效果）3 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为盐水洗涤：用五倍体积的
12、质量分数为0.90.9的氯化钠的氯化钠溶液洗溶液洗涤。涤。5 5、低速离心（低速短时间）、低速离心（低速短时间）6 6、重复、重复4 4、5 5步骤三次，直步骤三次，直至上清液中已至上清液中已没有黄色没有黄色，表明洗涤干净。，表明洗涤干净。第17页，讲稿共33张，创作于星期三初次离心后的结果3次洗涤后的结果次洗涤后的结果第18页，讲稿共33张，创作于星期三(2)(2)(2)(2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加再加4040体体积的积的甲苯甲苯 ，置于置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1010分钟分钟（加速加
13、速细胞破裂细胞破裂）,细胞破裂释放出细胞破裂释放出血红蛋白。血红蛋白。(3)(3)(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：过程：过程：过程：过程：将搅拌好混合液转移到离心将搅拌好混合液转移到离心管内，以管内，以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 min10 min。试管中溶液层次：试管中溶液层次：试管中溶液层次：试管中溶液层次：第第1 1层（最上层）：甲苯层层（最上层）：甲苯层（无色透明无色透明）；第）；第2 2层（中上层）：脂溶性物层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（质沉淀层（白色薄层固体白色薄层固体）；第）；第3 3层（中下
14、层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液红色透明液体体）；第）；第4 4层（最下层）：杂质沉淀层（层（最下层）：杂质沉淀层（暗红暗红色色）。）。分离：分离：分离：分离：用滤纸过滤，除去脂溶性用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的下层的红色透明液体红色透明液体。二、实验操作二、实验操作第19页，讲稿共33张，创作于星期三(4)(4)(4)(4)透析：透析：透析：透析：过程：过程：过程：过程：取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中，将透析中，将透析袋放入盛有袋放入盛有300ml3
15、00ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲磷酸缓冲液液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。透析目的：透析目的：透析目的：透析目的：除去样品中除去样品中分子量较小的杂质分子量较小的杂质。二、实验操作二、实验操作原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。留在袋内。留在袋内。留在袋内。第20页，讲稿共33张，创作于星期三透析过程动画演示透析过程动画演示第21页，讲稿共33张，创作于星期三利用透
16、析袋透析第22页，讲稿共33张，创作于星期三凝胶色谱操作凝胶色谱操作:（1 1 1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。两端需用砂纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，覆盖尼龙网，再用再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的目尼龙纱包好，插到玻璃管的一一端端。注意事项注意事项注意事项注意事项：底塞中插入底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会的玻璃管的上部不得超出
17、橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃安装玻璃管管。组装：组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他安装其他附属结构。附属结构。第23页，讲稿共33张，创作于星期三（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填 凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：A A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。B B、代表意义：、代表意义：“G G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围离范
18、围。7575表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.57.5克。克。凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：A A、固定：、固定：将色谱柱装置固将色谱柱装置固定在支架上。定在支架上。B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻
19、敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。第24页，讲稿共33张，创作于星期三装配好的凝胶柱第25页，讲稿共33张，创作于星期三 洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：装填完毕后，立装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操高的操作压下，用作压下，
20、用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷磷酸缓冲液（酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平充分洗涤平衡衡1212小时小时。注意：注意：注意：注意：1 1、液面不要液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡低于凝胶表面，否则可能有气泡混入混入，影响液体在柱内的流动与，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。最终生物大分子物质的分离效果。2 2、不能发生洗脱液流干，不能发生洗脱液流干，露出凝露出凝胶颗粒的现象胶颗粒的现象。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填50cm50cm50cm50cm高高高高第26页，讲稿共33张，创作于星期三（3 3）样品加入与
21、洗脱）样品加入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。平齐，关闭出口。滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等
22、样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：洗脱：洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：收集：收集：收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）致的移动，说
23、明色谱柱制作成功）注意：注意：注意：注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁、贴壁加样。加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。第27页，讲稿共33张，创作于星期三（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱注意：注意：注意：注意：正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。第28页，讲稿共33张，创作于星期三收集得到的纯化后的蛋白第29页，讲稿共33张，创作于星期三思考下
24、面的问题：思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。1 1 1 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2 2 2 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一
25、特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？白质得分离有什么意义？白质得分离有什么意义？白质得分离有什么意义？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。化了实验操作。3 3 3 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的
26、程序可分为四大步，包括：样品处理、样品处理、样品处理、样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定粗分离、纯化和纯度鉴定粗分离、纯化和纯度鉴定粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到心等操作收集到血红蛋白溶液血红蛋白溶液，即，即:样品的处理；再经过透析去除分样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法通过凝胶色谱法通过凝胶色谱法通过凝胶色谱法将相对将相对分子质量较大的分子质量较大的杂质蛋白除去杂质蛋白除去，即，即:样品的纯化；最后经样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝
27、聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳胶电泳胶电泳胶电泳进行纯度鉴定。进行纯度鉴定。第30页，讲稿共33张，创作于星期三（三）（三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。目的：目的：目的：目的：第31页，讲稿共33张，创作于星期三 观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-185-18），），如果分如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净速度
28、过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价 1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。第32页，讲稿共33张，创作于星期三感谢大家观看第33页，讲稿共33张，创作于星期三