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1、关于练习血红蛋白的提取和分离第1页，讲稿共36张，创作于星期二思考思考1 1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2 2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白
2、质。以用来分离不同蛋白质。第2页，讲稿共36张，创作于星期二一、基础知识：一、基础知识：凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）：1 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2 2、概念：根据、概念：根据相对分子质量的大小相对分子质量的大小分离蛋分离蛋白质的方法白质的方法第3页，讲稿共36张，创作于星期二3 3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（
3、），移动速度（），移动速度（），而（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（）移动，路程（），移动速度（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快第4页，讲稿共36张，创作于星期二n用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质蛋白质 (D)(D)nA A路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢 B B路程较长，移动速度较快路程较
4、长，移动速度较快nC C路程较短，移动速度较慢路程较短，移动速度较慢 D D路路程较短，移动速度较快程较短，移动速度较快4 4、具体过程、具体过程第5页，讲稿共36张，创作于星期二第6页，讲稿共36张，创作于星期二n相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个进行过程可表示为图中哪一个B B第7页，讲稿共36张，创作于星期二 缓冲溶液：缓冲溶液：1 1、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）对溶对溶液的（液的（）的影响，维持）的影响，维持PH PH 基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PHPH值值第8页，讲稿共36张，创作于星期二2 2、
5、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制3.3.为什么在本实验中实用为什么在本实验中实用缓冲溶液缓冲溶液 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷磷酸缓冲液酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（于观察（红色红色）和材料的科学研究（）和材料的科学研究（活性活性）第9页，讲稿共36张，创作于星期二电泳：电泳：1 1、概念：指带电粒子在电场作用下发、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。生迁移的过程。2 2、原理：、原理：第10页，讲稿共36张，创作于星
6、期二3.3.分类：分类：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和和聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定（测定（）通）通常用常用 SDSSDS聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量第11页，讲稿共36张，创作于星期二使用使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于白质的电泳迁移率完全取决于A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异第12页，讲稿共36张，创作于星期二二二 实验操作实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的
7、提取和分离一般分为四步：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定第13页，讲稿共36张，创作于星期二思考思考 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNADNA，用人，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于，便于进行进行DNADNA的提取，的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。含量丰富便于提取血红蛋白。第14页，讲稿共36张，创作于星期二n选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列选用红细胞作分离蛋白质的实验
8、材料，下列是其优点的是是其优点的是 (ABC )(ABC )多多nA A血红蛋白是有色蛋白血红蛋白是有色蛋白 nB B红细胞无细胞核红细胞无细胞核nC C红细胞蛋白质含量高红细胞蛋白质含量高 nD D红细胞红细胞DNADNA含量高含量高第15页，讲稿共36张，创作于星期二1.1.样品处理样品处理血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多最多）血红蛋血红蛋白白（）90第16页，讲稿共36张，创作于星期二1 1、样品处理样品处理n（1 1）、红细胞的洗涤：）、红细胞的洗涤：n（2 2）、血红蛋白
9、的释放：）、血红蛋白的释放：n（3 3）、分离血红蛋白溶液：）、分离血红蛋白溶液：第17页，讲稿共36张，创作于星期二分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 （无色透明的甲苯层）（无色透明的甲苯层）脂类物质脂类物质 （白色白色脂溶性物质沉淀层）脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液血红蛋白溶液 （红色透明液体）（红色透明液体）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）第18页，讲稿共36张，创作于星期二2.2.透析透析(粗分离粗分离)a a过程：过程：b b目的：目的：c c原理：原理：除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质透析袋能使小分子自由进出，而大分子透
10、析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。保留在袋内。第19页，讲稿共36张，创作于星期二n（1 1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：_、_、_和和_。n（2 2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。离心，收集血红蛋白溶液。n 加入柠檬酸钠的目的是加入柠檬酸钠的目的是_。n 以上所述的过程即是样品处理，它包括以上所述的过程即是样品处理，它包括_、_、收集血红蛋白溶液。、收集血红蛋白溶液。第20页，讲稿共36张，创作
11、于星期二n（3 3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。经过透析，这就是样品的粗分离。n透析的目的是透析的目的是_。n透析的原理是透析的原理是_。去除分子质量较小的杂质去除分子质量较小的杂质透析袋能使小分子自由进出，而大分子透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内则保留在袋内第21页，讲稿共36张，创作于星期二n（4 4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经后经SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。n样品纯化的目的是样品纯化的目的是_。n血红蛋白
12、有什么特点？血红蛋白有什么特点？_。n这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去 血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋白的颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。分离过程非常直观，大大简化了实验操作。第22页，讲稿共36张，创作于星期二n下列操作正确的是（下列操作正确的是（D D ）nA.A.分离红细胞时采用低速长时间离心分离
13、红细胞时采用低速长时间离心 nB.B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可可nC.C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 nD.D.透析时要用透析时要用20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液，透析的磷酸缓冲液，透析12h12h第23页，讲稿共36张，创作于星期二n下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是施中，正确的是 ()()多多A A采集血样后要高速短时问离心获得血细胞采集血样后要高速短时问离心获得血细胞B B洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤洗涤三次后
14、如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。次数，否则血浆蛋白无法除净。C C在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白血红蛋白D D释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来白和其他杂质分离开来 BCD第24页，讲稿共36张，创作于星期二在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是分析无误的是 D DA A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B B洗涤时离心速度过小，
15、时间过短，白细胞等会沉淀，洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果达不到分离的效果C C洗涤过程选用洗涤过程选用0.1%0.1%的生理盐水的生理盐水D D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质D第25页，讲稿共36张，创作于星期二3 3凝胶色谱操作（纯化）凝胶色谱操作（纯化）（1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：第26页，讲稿共36张，创作于星期二n凝胶色谱柱取长为凝胶色谱柱取长为40 cm40 cm，内径为，内径为1 16 cm6 cm，有，有关说法中，正确的是关说法中，正确的是 (ABD )(ABD )多多A
16、 A一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果B B凝胶色谱柱过高超过凝胶色谱柱过高超过1 m1 m，不影响分离的效果，不影响分离的效果C C凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度D D凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大稀释度过大第27页，讲稿共36张，创作于星期二（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填 凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：A A、材料：、材料：B B、代表意义、代表意义：“G”G”表示表示 。7575表示表示 凝胶的前处理：凝胶
17、的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：A A、固定：、固定：将色谱柱装置固将色谱柱装置固定在支架上。定在支架上。B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒
18、之间的空隙。、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。第28页，讲稿共36张，创作于星期二 洗涤平衡：洗涤平衡：装填完毕后，装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高高的操作压下，用的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡1212小时小时。注注注注意：意：意：意：1 1、液面不要
19、低于凝胶表面，液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入否则可能有气泡混入，影响液体，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。物质的分离效果。2 2、不能发生不能发生洗脱液流干，洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现露出凝胶颗粒的现象象。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填50cm50cm50cm50cm高高高高第29页，讲稿共36张，创作于星期二（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。胶面平齐，关闭出
20、口。滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：洗脱：洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适
21、当高度，的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：收集：收集：收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每每5ml5ml收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）的移动，说明色谱柱制作成功）注意：注意：注意：注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁、贴壁加样。加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、
22、使吸管管口沿管壁环绕移动。第30页，讲稿共36张，创作于星期二（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱注意：注意：注意：注意：正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。第31页，讲稿共36张，创作于星期二n在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是A AnA A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，序，降低分离效果降低分离效果nB B、气泡阻碍蛋白质的运动、气泡阻碍蛋白质的运动nC C、气
23、泡与蛋白质发生化学反应、气泡与蛋白质发生化学反应nD D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密第32页，讲稿共36张，创作于星期二n样品的加入和洗脱的操作不正确的是样品的加入和洗脱的操作不正确的是A AnA A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面nB B加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内nC C等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口nD D用吸管小心的将用吸管小心的
24、将1ml1ml透析后的样品加到色谱柱透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面的顶端，不要破坏凝胶面A第33页，讲稿共36张，创作于星期二n下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（中正确的是（A A）nA A可采集猪血作为实验材料可采集猪血作为实验材料 B B用蒸馏水重复洗涤红细胞用蒸馏水重复洗涤红细胞nC C血红蛋白释放后应低速短时间离心血红蛋白释放后应低速短时间离心 D D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液A第34页，讲稿共36张，创作于星期二二、实验操作二、实验操作n蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：n（1 1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。放；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。n（2 2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。）粗分离：透析除去分子较小的杂质。n（3 3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。杂质蛋白质除去。n（4 4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。定。第35页，讲稿共36张，创作于星期二感感谢谢大大家家观观看看第36页，讲稿共36张，创作于星期二