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1、制 剂超临界CO2萃取白芷中香豆素类成分的工艺优化研究刘红梅,张明贤,刘杨平,韩永萍,陶凤云(北京联合大学生物化学工程学院 北京100023)收稿日期:2003205216作者简介:刘红梅(1970),女,安徽霍邱人,讲师,硕士,主要从事超临界流体技术、蒸馏技术、电渗析技术的研究。电话:013661332722E2mail:trok ,hgthongmei .关键词:超临界萃取工艺;白芷;香豆素;正交设计;逐步回归摘要:目的:以氧化前胡素、欧前胡素、总香豆素含量为试验指标,优化白芷中香豆素类成分的超临界CO2萃取工艺。方法:通过正交试验,采用高效液相色谱法测定氧化前胡素、欧前胡素的含量,采用极
2、差方差和逐步非线性回归对试验数据进行分析。结果:白芷中香豆素类成分的超临界CO2的最佳萃取工艺为萃取温度50、萃取压力21MPa、萃取时间3.5h、分离压力6.0MPa、粉碎度20目;实验值和模型计算值的相对误差小于5%。结论:萃取压力、温度、时间、药材的粉碎度等工艺参数对试验指标有显著性影响,而且部分因素之间存在交互作用,回归模型具有较高的预测精度。中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:100121528(2004)0220090204Study on extraction of coumarins inAngelica Dahuricaby supercritical CO2
3、LIU Hong2mei,ZHANG Ming2xian,LIU Yang2ping,HAN Yong2ping,TAO Feng2yun(College of Biochemical Engineering of Beijing Union University,Beijing 100023,China)KEY WORDS:supercritical extraction process;Angelica Dahurica;coumarins;orthogonal design;stepwise re2gression analysisABSTRACT:AIM:To optimize the
4、 extraction process for coumarins inA ngelica Dahuricaby supercritical CO2as guided by the contents of oxyimperatorin,imperatorin and the total coumarins in the extract.METHODS:HPLC was applied to determine the contents of oxyimperatorin and imperatorin.orthogonal design was appliedto optimize SFE p
5、rocess.Range and variance analysis as well as stepwise nonlinear regression analysis were ap2plied to deal with experimental results.RESULTS:The optimum process was established as following:21MPaas extracting pressure,50as extracting temperature,3.5h as extracting time,20 mesh as pulverized degreean
6、d 6.5MPa as separating pressure.The relative error between experimental data and calculated value was lessthan 5%.CONCLUSION:Changes in extracting pressure,temperature,time,pulverized degree would affectthe extracting results remarkably.Some factors had interactions on the extraction of coumarins in
7、A ngelicaDahurica.Regression equation was reasonable and could forecast results precisely.白芷性温,味辛,具有祛风除湿、通窍止痛、消肿排脓等功效1,是中药复方中的常用药,是治疗头风眩晕的古方“都梁丸”中的一味君药,其主要生理活性物质是香豆素,其中最主要的是氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素2。研究表明白芷提取物中总香豆素的含量越高,其疗效也越好,因此白芷提取物中总香豆素的含量可作为白芷提取工艺的评判指标3。本文以白芷的代表成分欧前胡素、氧化前胡素为试验指标,并以两者之和作为总香豆素的含量,采用正交试验设计方
8、法、超临界CO2萃取工艺对中药白芷中香豆素类物质进行提取研究,并采用高效液相色谱法测定氧化前胡素、欧前胡素含量,采用极差方差分析和逐步非线性回归方法对试验数据进行分析和拟合,优化提取工艺。1 仪器和药品CL25型超临界流体萃取机(北京合世兴业有限公司,5L);SSI2222D高效液相色谱仪(美国凯德)。川白芷(北京同仁堂集团);氧化前胡素、欧前胡092004年2月第26卷 第2期中 成 药Chinese Traditional Patent MedicineFeb.,2004Vol.26No.2 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.
9、All rights reserved.素对 照 品(中 国 生 物 制 品 检 定 所);二 氧 化 碳(99.95%);甲醇为色谱纯。2 试验方法2.1 正交试验设计采用正交试验设计方法,以萃取压力、温度、时间、分离压力、药材粉碎度为试验因素,取三水平,选用L18(37)正交表安排试验,因素2水平见表1。表1因素与水平水平A温度()B压力(MPa)C时间(h)D分离压力(MPa)E粉碎度(Mesh)140212.56.05245253.06.510350303.57.020 称取2.5kg白芷生药,粉碎,过5目、10目、20目标准筛,然后置于萃取釜中,按选定的正交表安排试验。2.2 样品分
10、析 采用高效液相色谱法测定样品中氧化前胡素、欧前胡素的含量,并以两者之和作为总香豆素的含量。2.2.1 色谱条件Hyper ODS2 C18色谱柱(200mm4.6mm);流动相:甲醇2水(7030);检测波长:254nm。2.2.2 线性关系精密称取氧化前胡素对照品5.0mg、欧前胡素对照品5.5mg,分别置于50mL量瓶中,用甲醇溶解定容至刻度,摇匀;分别取上述溶液0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0mL,均用甲醇定容至10ml,按上述色谱条件测定。以峰面积为纵坐标,对照品进样浓度为横坐标,绘制标准曲线,并进行线性回归分析,得到如下线性回归方程
11、:氧化前胡素:Y=0.0959+0.0241X,r=0.9998;欧前胡素:Y=0.0959+0.0241X,r=0.9997;线性范围分别为:0.0050.05mgmL-1;0.00550.055mgmL-1。2.2.3 精密度试验对照品:分别取同一浓度的氧化前胡素、欧前胡素对照品溶液,连续进样5次,RSD分别为0.92%和1.35%。样品:取同一浓度的样品溶液,连续进样5次,测定氧化前胡素、欧前胡素的含量,RSD分别为1.03%和1.28%。2.2.4 重现性试验取5份同批号的样品溶液,测定氧化前胡素、欧前胡素的含量,RSD分别为2.59%和2.94%。2.2.5 稳定性试验样品溶液室温放
12、置,每隔2h进样一次,测定氧化胡素和欧前胡素的含量,共测5次,RSD分别为0.67%和0.82%,说明样品溶液在8h内稳定。2.2.6 回收率试验精密称取10份已知含量的同一样品溶液,其中5份准确加入氧化前胡素对照品适量,另外5份准确加入欧前胡素对照品适量,按选定的色谱条件操作,平均加样回收率分别为99.13%和99.86%,RSD分别为1.31%和0.98%。2.2.7 样品溶液的制备精密称取白芷SFE萃取物5.0mg置于50mL量瓶中,用甲醇溶解定容至刻度,摇匀得样品溶液,在上述色谱条件测定,用标准曲线方程计算出各样品溶液中两种香豆素的含量,并得到总香豆素的含量。2.3 数据分析首先对试验
13、数据进行极差和方差分析,优化试验方案,然后采取逐步非线性回归方法研究各项指标与因素之间的定量关系,建立相应的回归方程。3 试验结果与数据分析3.1 正交试验结果和极差方差分析极差和方差分析结果见表2、表3。3.2 逐步非线性回归分析由于试验因素间可能彼此正交,但在安排正交表时并没有考虑因素间的正交作用,因此为对试验结果进行进一步的预测,探索因素之间是否存在交互作用,本文采用多元二次多项式、利用逐步回归分析方法对试验数据进行进一步处理,得到的回归方程如下:以总香豆素含量为指标y1,回归方程为:y1=264.8816-11.41A-0.9392B+0.1257A2+0.0289A E+0.191B
14、C-0.2184CE-0.0196E2R=0.998S=0.183F=430.6F0.01(7,11)=4.89以氧化前胡素含量为指标y2,回归方程为:y2=175.9134-7.5543A-0.7588B+0.0837A2+0.0184A E+0.1734BC-0.0042B E-0.216CER=0.999S=0.0843F=1084F0.01(7,11)=4.89以欧前胡素含量为指标y3,回归方程为:192004年2月第26卷 第2期中 成 药Chinese Traditional Patent MedicineFeb.,2004Vol.26No.2 1995-2005 Tsinghua
15、 Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.y3=84.7365-3.687A-0.102B+0.0402A2+0.00999A E+0.0154CE-0.0149E2R=0.994S=0.0847F=266.6F0.01(7,11)=4.82表2正交试验结果试验号因素ABCDE总香豆素含量(mgg-1)氧化前胡素含量(mgg-1)欧前胡素含量(mgg-1)1111112.6731.4271.2462122223.4121.5911.8213133331.3150.2101.1054211222.0190.6981.3215222331
16、.9960.9980.9686233110.8850.5890.2967312139.3176.1733.1448323214.4843.8970.5879331321.7680.2591.50910113325.7203.4932.22711121132.3161.2381.07812132210.6780.3470.33113212311.0420.9250.11714223121.4920.5230.96915231230.7650.3870.37816313238.8125.6313.18117321311.2040.6370.56718332123.1301.7681.542总K12
17、.6864.9311.7913.3321.828香K21.3622.4793.2883.3622.954豆K34.8161.4543.7852.1694.082素R3.4543.4771.9941.1932.254氧K11.3843.0580.7741.9531.304化K20.6871.4811.9672.0921.389前K33.0610.932.3911.0872.440胡素R2.6742.1281.6171.0051.136欧K11.3011.8731.1071.3790.524前K20.6750.9981.3211.2701.565胡K31.7550.7641.4111.0821.6
18、42素R1.0801.1090.3040.2971.118表3方差分析结果方差来源ABCDE误差总香豆素36.3338.1013.005.6115.086.204离差平方和氧化前胡素17.7818.548.493.604.754.149欧前胡素3.533.620.480.274.681.088总香豆素222226自由度氧化前胡素222226欧前胡素222226总香豆素18.1719.056.502.807.541.033均方差氧化前胡素8.899.274.251.802.370.691欧前胡素1.771.810.240.142.340.181总香豆素17.4518.296.252.697.24
19、方差比氧化前胡素12.813.356.112.593.48欧前胡素9.749.981.330.7512.91总香豆素P 0.01P 0.01P 0.05P 0.25P 0.05显著性氧化前胡素P 0.01P 0.01P 0.05P 0.25P 0.05欧前胡素P 0.05P 0.05不显著不显著P 0.01F0.25(2,6)=1.76,F0.1(2,6)=3.46,F0.05(2,6)=5.14,F0.01(2,6)=10.92,292004年2月第26卷 第2期中 成 药Chinese Traditional Patent MedicineFeb.,2004Vol.26No.2 1995-
20、2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.由上述回归方程可以看出,三个回归方程都在=0.01水平上显著,所涉及的因素之间存在交互作用;另外在三个指标的回归方程中,因素D均没有出现,即因素D对指标变化的影响不大而被删掉,与方差分析结果一致。3.3 萃取工艺优化表3的方差分析结果表明,因素A、B对白芷中总香豆素、氧化前胡素的超临界萃取结果有极为显著性影响(P 0.01),对欧前胡素的萃取结果有显著性影响(P 0.05),因素C和E对白芷中总香豆素、氧化前胡素的萃取结果有显著性影响(P 0.05),因素C对欧前胡素
21、超临界萃取的影响不显著,因素E对欧前胡素的超临界萃取结果有极为显著的影响(P 0.01);因素D对总香豆素、氧化前胡素的萃取结果的影响不很显著(P A E C D,但RB、RA非常接近;以氧化前胡素含量为指标,影响顺序依次为A B C E D,但RC、RD较为接近。综合分析各方面的因素,认为各试验因素对试验指标的影响顺序依次为A B E C D。由于因素D的变化对三个指标的影响都不大,因此综合考虑各方面因素,确定最优萃取方案是A3B1C3D1E3,即 萃 取 温 度50、萃 取 压 力21MPa、萃取时间3.5h、分离压力6.0MPa、粉碎度20目。3.3 验证试验取1.25kg粉碎的白芷药材
22、按最优化工艺条件A3B1C3D1E3进行萃取试验,以总香豆素、氧化前胡素、欧前胡素含量为指标进行考察,结果见表4。表4优化工艺验证试验(n=3)总香豆素含量mg/g氧化前化素含量mg/g欧前胡素含量mg/g试验值预测值误差(%)试验值预测值误差(%)试验值预测值误差(%)9.1368.7194.566.0195.7823.943.1873.211-0.75 表4结果表明,按优化工艺条件萃取,各项指标均达到或超过正交试验表中结果的较高值,非线性回归方程的预测值和试验值的相对误差不超过5%,具有较高的预测精度,因此可以认为优化是成功的,得到的回归方程能对萃取工艺进行正确的描述。4 讨论4.1 最优
23、化萃取方案为A3B1C3D1E3,即萃取温度50、萃取压力21MPa、萃取时间3.5h、分离压力6.0MPa、粉碎度20目。4.2 通过逐步非线性回归分析,得到具有较高预测精度的回归方程。4.3 通过逐步非线性回归分析,发现所涉及的工艺参数之间存在交互作用。因此即使在安排试验时没有考虑交互作用,在回归分析时也可以引入因素之间的交互作用项。参考文献:1 郑虎战.中药现代研究与应用(2)M.北京:文苑山版社.1998,98.2 张玉芳,余红梅.硫熏对白芷香豆素类成分含量的影响研究J.中国中药杂志.1997,22(9):5362538.3 魏玉平,刘俊,严小林等.白芷治疗头前的提取:艺评价指标的研究
24、J.中草药.200l,32(4):3182319.中药数字化色谱指纹谱中药数字化色谱指纹谱技术是针对中药药材及中成药的鉴定和质量控制的新方法、新技术。它针对中药这一复杂对象,运用色谱技术,得到色谱图和一系列实验数据,再通过一定的公式建立参数,将复杂的色谱图变成直观的数字,从而进行中药的质控和质检。本书著者为洪筱坤教授和王智华教授,得到上海市科技专著出版基金资助。书中记载了著者潜心研究近20年的成果,介绍了数字化色谱指纹谱技术的原理、建立方法、公式和参数,并以柴胡等中药和麝香保心丸等中成药为例,具体证明了色谱指纹谱技术在质控和质检方面的可信性和可行性。本书可作为医药院校师生的参考书,也适用于科研单位、中药企业、药政管理人员及相关专业人士参考。本书为大32开精装本,定价为38元,由上海科技出版社出版发行。联系地址为上海瑞金二路450号 上海科技出版社发行科。邮编:200020,电话:021264459135。欢迎订购。392004年2月第26卷 第2期中 成 药Chinese Traditional Patent MedicineFeb.,2004Vol.26No.2 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,Ltd.All rights reserved.