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1、土壤微生物分离实验报告周五 第二组05级生科基地班 刘蕾 孙飞 卢永峰 鲁薪安 齐永 闪波【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果通过查阅伯杰氏系统细菌学手册对照种属特征最终判断所分离纯化的细菌所属的属。【abstract】By several methods and technique, we got the pure cultures of two kinds of bacteria which were separated from soil. According to the results of
2、colony observing, staining, and experiments of physiology and bio-chemistry, we referred to the Bergeys Manual of Systematic Bacteriology and finally decided their genus.【关键词】革兰氏阳性、芽孢、片球菌属 、 芽孢杆菌属【Key Words】Gram Positive 、Spore、Pediococcus、 Bacillus实验目的：1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。2、学习、掌握微生物的鉴定方法。3、对提取的土
3、样进行微生物的分离、纯化培养，并进行简单的形态鉴定。4、对简单鉴定后的微生物进行生理生化鉴定并由鉴定结果查伯杰氏手册以确定分离出微生物的品种。实验原理： 从复杂的微生物群体中获得只含有一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有1、简单单细胞挑取法 2、平板分离法此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。其原理包括两方面：1、在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。2、微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由
4、一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。 但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落的特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化的到许多有价值的菌株。此实验将从土壤中分离两种细菌。实验器材、试剂与菌种：1、 器材：培养皿、载玻片、盖玻片、普通
5、光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、搪瓷杯、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪（枪头）、电子天平、滤纸、pH试纸等。2、 试剂：配制牛肉膏蛋白胨培养基的原料（牛肉膏、NaCl、琼脂、蛋白胨）、配置糖发酵培养基的原料（葡萄糖、K2HPO3、溴百里酚蓝、琼脂、NaCl、蛋白胨）、甘油（丙三醇）、结晶紫染液、番红染液、碘液、95乙醇、5孔雀绿染液、0.5番红水染液、3过氧化氢水溶液、1盐酸二甲基对苯撑二胺溶液、蒸馏水等。3、 土样：取自山东大学7号宿舍楼门前土壤，地下10cm左右。实验步骤：1、配制牛肉膏蛋白胨培养基：1）配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基500ml （用于
6、12个平皿和10支试管斜面） 牛肉膏 0.3% 1.5 g 蛋白胨 1% 5g NaCl 0.5% 2.5g 琼脂 2% 10g pH 7.07.2 2）倒12个平板和10支试管斜面，包扎，121灭菌20min.2、制备土壤稀释液：称取土样10g，放入盛有100ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀10min 使土和水充分混合，然后用移液枪从三角瓶中吸取1ml（此操作要求无菌操作），加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推分别制成制成0.01、0.001、0.0001不同稀释度的土壤溶液。0.00011ml1ml0.10.010.001 稀释过程示意图 （图中左侧梯形为三角瓶，
7、其中加入100ml无菌水与10g土样，土壤溶液稀释度为0.1依此类推，右侧三试管中土壤稀释度分别为：0.01、0.001、0.0001）3、涂布培养：以0.01以及0.0001两个浓度的土壤稀释液作为涂布平板培养的对象，将其分别涂布在3个牛肉膏蛋白胨培养基中，共6个培养基，标号，37C温箱培养48 h。484、划线分离（划线培养）：对两种土壤溶液的微生物培养基进行观察，记录两种区分明显的细菌性状。挑取此两种细菌在新的培养基中划线培养（每种细菌培养3个培养皿），标号、37C培养。 5、初步鉴定：对两种菌进行简单染色、革兰氏染色以及芽孢染色观察，记录结果。6、试管斜面再培养： 将两种纯菌株接种分别
8、接种在5支试管中，共10支试管。37C培养（1824h）。7、对试管中培养的两种菌进行生理生化鉴定： 1）过氧化氢酶鉴定： A 实验原理：乳酸菌与许多厌氧菌与其他细菌区分的主要依据是鉴定有无过氧化氢酶。该酶可以把过氧化氢分解为水与氧气，气体氧以气泡跑出来，则为过氧化氢酶实验阳性。乳酸菌和许多厌氧菌在过氧化氢酶实验中呈现阴性。 B 步骤： 将培养新鲜的待测菌种（培养1824h内）接在载玻片上，滴一滴3过氧化氢于菌体上。 2）糖发酵与氧化实验 A 实验原理： 在细菌的分类鉴定中，糖发酵与氧化测定是一项重要的依据。绝大多数细菌都可以利用糖类作为能源以及碳源，但由于不同的菌存在酶系的差异，因而对糖类的
9、发酵与氧化的能力就有所不同。有的在糖类发酵与氧化代谢中能分解糖类，产酸产气，有的则只能产酸不可以产气。酸的产生与否，以及是发酵型产酸还是氧化型产酸，可以由预先加在培养基中的指示剂（溴百里酚蓝水溶液）呈现出来。这样把接好菌种的培养基放在厌氧或好氧的环境下培养，培养基有绿色变为黄色为产酸，是否产气是通过观察培养基中是否产生气泡或培养基断裂来测定。 B 步骤 配置糖发酵培养基150 ml （葡萄糖：、K2HPO3：、溴百里酚蓝、琼脂：、NaCl：、蛋白胨：），分装试管。 110C灭菌培养基20 mins （同时灭菌一定量甘油，待用）。 对两种细菌进行“穿刺”培养，每种菌做5个试管：2个盖管培养，2个
10、开管培养，一个为盖管对照组。在培养基的上方加入12cm厚的甘油，作为“盖 管”，以提供菌体无氧的生长环境，开管则不加甘油，作为有氧的生长环境供菌体生长。 在37C下培养，并在培养24h后观察培养基中颜色的变化，以及有无气泡。 3）细胞色素氧化酶测定 A 实验原理 细胞色素氧化酶是氧化酶的一种，它在有分子氧以及细胞色素C存在时，可以氧化二甲基对苯撑二胺，使之呈现玫瑰红或暗红色，在此基础上还可以与a苯酚结合生成吲哚酚兰，出现蓝色 B 步骤 在干净培养皿中放一滤纸，用火柴棒取培养1824h的鉴定菌苔黏在滤纸上，滴一滴1盐酸二甲基对苯撑二胺溶液于菌苔上，进行观察。实验结果：1、两种分离细菌的简单鉴定以
11、及生理生化鉴定结果： 表1 鉴定结果细菌1细菌2说明来源小清河淤泥中 培养条件1牛肉膏蛋白胨培养基培养（用于肉眼观察鉴定、简单鉴定、过氧化氢酶鉴定、细胞色素氧化酶测定实验）2糖发酵培养基（用于糖发酵与氧化实验）肉眼观察鉴定大小较小小形态圆圆高度中间凸起中间凸起颜色白色淡黄边缘整齐不规则干湿湿润湿润简单鉴定革兰氏染色紫色（革兰氏阳性菌）紫色（革兰氏阳性菌）简单染色球菌0.81.0m杆菌0.40.92.23.0m芽孢染色没有芽孢有芽孢鞭毛染色无鞭毛有鞭毛简单生理生化鉴定过氧化氢酶鉴定阳性阳性培养物出现气泡为阳性、无气泡为阴性反应。实验为阳性说明两种细菌均含有过氧化氢酶，它们不是厌氧型细菌或乳酸菌。
12、糖发酵与氧化实验培养基柱上全部变黄，为发酵型（穿刺线呈丝状，白色，不在表面生长）上部黄色、下部绿色。该菌为氧化型在培养24h后若培养基上部为黄色，下部为蓝绿色则证明细菌为氧化型；若培养基全部变为黄色，或者下部变为黄色上部为蓝绿色则证明细菌为发酵型。通过培养可知在开管培养基（有氧条件下）中有细菌的生长，但在闭管培养基（无氧条件下）中没有细菌生长，说明两种菌为非厌氧菌。细胞色素氧化酶测定阴性阴性1min中内菌苔呈现红色为阳性，1min以上出现红色为阴性。结果片球菌属芽孢杆菌属片球菌属拉丁学名(Pediococcus) 细胞球形永不延长，直径1.22.0 m。在适宜条件下，分裂以直二个方向形成四联，
13、虽有时也可出现成对排列，单个细胞罕见，不形成链状。革兰氏阳性。不运动，不产芽孢。兼性厌氧，有的菌株在有氧时会抑制生长。化能异养，细胞需要丰富营养的培养基，发酵糖类(主要是单糖和双糖类)。葡萄糖产酸不产气，主要产物是DL或L(+)-乳酸盐。接触酶阴性，氧化酶也阴性。不还原硝酸盐。最适生长温度2540。出现于蔬菜和食品；对植物或动物不致病，种间鉴别见表7-7。 模式种：有害片球菌(Pediococcus damnosus)。细菌-肠杆菌芽孢杆菌属拉丁学名（Bacillus）革兰氏染色阳性菌。产生芽孢，需氧或兼性厌氧。大多数有动力，无荚膜，多数溶血，通常过氧化氢酶阳性。包括对人和动物致病的炭疽芽孢杆
14、菌，可引起食物中毒的蜡状芽孢杆菌，非致病性的枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌等。炭疽芽孢杆菌有荚膜，无鞭毛，在人工培养物内细菌呈长链状排列，形成圆卵形芽孢；芽孢位于菌体中央 ，但不大于菌体宽度；专性需氧；芽孢的抵抗力很强，在干燥状态下可生存数十年；本菌主要使食草动物发病，病程急剧，死亡率高；人的易感性仅次于食草动物，病菌经由破损的皮肤、消化道或呼吸道侵入体内，死亡率高；可用抗生素和磺胺治疗。【参考文献】伯杰氏系统细菌学手册（Bergeys Manual of Systemaic Bacteriology）1974年第八版、1986年第9版，主编 布瑞德（美）微生物学（第2版），主编 沈萍、陈向东 高等教育出版社土壤微生物基础知识作者：西尾道德 农业科技出版社土壤和环境微生物学陈文新主编 北京农业大学出版社【致谢】感谢庞昕老师在本次实验中的悉心指导。 感谢资料室老师对本次实验有关资料的提供。