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1、微生物实验报告-微生物土壤分离姓名：学号：班级：生科二班组别：四组同组者：时间：2012年12月 山东大学实验报告 2012年 12 月姓名 系年级 2011级生科2班 组别四 同组者科目 微生物学实验 题目 微生物的土壤分离 一、【实验题目】微生物的土壤分离二、【实验目的】1. 从各地区的土样中筛选含果胶酶的菌株和产几丁质酶的菌株。2.熟悉菌株筛选的具体操作流程。3. 根据菌落形态，染色结果，运动性等来鉴定未知细菌；小室培养法观察未定未知真菌。4.掌握菌株筛选、分离纯化、鉴定等具体操作流程。5复习本学期所学的微生物实验的相关的操作步骤，并进一步强化无菌操作的概念。三、【实验试剂与器材】1.
2、土样：7号土样2. 菌种：革兰氏染色：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌3. 试剂及培养基培养基：几丁质酶筛选培养基；液体PDA培养基 ；固体PDA斜面培养基；几丁质酶发酵培养基；果胶酶筛选培养基；果胶酶液体种子培养基、发酵产酶培养基；固体斜面培养基、半固体牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、吲哚培养基、甲基红培养基试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇5%孔雀绿水溶液、氯化钠、刚果红、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水4. 仪器显微镜、锥形瓶、培养皿、试管、试管架、移液管、移液枪、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、刮刀、U型管、德汉氏小管、酒精灯、
3、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布、双层瓶等四、【实验原理】1微生物的分离和纯化在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至
4、得到纯菌株。 土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株2与果胶酶有关的（1）果胶：果胶是一组聚半乳糖醛酸，在适宜条件下其溶液能形成胶和部分发生甲氧基化（甲酯化，也就是形成甲醇酯），其主要成分是部分甲酯化的a(l,4)一D一聚半乳糖醛酸，残留的羧基单元以游离酸的形式存在或形成铵、钾钠和钙等盐。（2）果胶酶：是分解果胶的一个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶。通过它们的联合作用使果胶质得以完全分解。天然的果胶质在原果胶酶作用下，转化成水可溶性的果胶；果胶被果胶甲
5、酯水解酶催化去掉甲酯基团，生成果胶酸；果胶酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。（3）产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌等。3DNS法测果胶酶的酶活的原理根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，而半乳糖醛酸是一种还原糖，与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。 4产果胶酶菌株的筛选原理（1）菌种的筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛，挑选具有某种能力的有用菌种，根据不同的筛选目的，采用不同的筛选模型。（2）配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌
6、株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。当果胶被果胶分解菌分泌的果胶酶分解后，刚果红-果胶的复合物就将无法形成，从而在培养基中形成以果胶分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选果胶分解菌。5.与几丁质酶有关的（1）几丁质：几丁质是由N一乙酰D氨基葡萄糖以-1，4糖苷键连接而成的高分子聚合物, 能产生几丁质酶的生物很多，包括植物，动物和微生物。虽然几丁质酶产生生物很多，但在
7、筛选几丁质酶时往往集中于微生物上（2）几丁质酶：关于几丁质酶这一概念目前用得比较混乱，广义的几丁质酶是指所有与几丁质降解有关的酶，还包括脱乙酰酶，壳聚糖酶，几丁寡糖酶，几丁二糖酶等，狭义的几丁质酶是指催化水解至少含有一个N乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，包括几丁内切酶和几丁外切酶。 （3）传统的筛选方法主要有两种，一是在胶体几丁质琼脂培养基上看透明圈的大小及清晰程度；二是水解几丁质荧光类似物的方法这两种方法的优点是快速直观，缺点是透明圈法选得的是那些能分泌并扩散至周围环境中的几丁质酶，对胞内酶产生菌不能被检出；而水解类似物法只简单地反映了降解小分子寡聚物的能力，至于这些酶是否能水解大分子几丁质却不
8、得而知6DNS试剂测几丁质酶酶活的原理 DNS法也叫做3,5-二硝基水杨酸定糖法。其原理是利用3,5-二硝基水杨酸试剂在碱性介质中与还原糖共沸，被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，其颜色深浅与糖类有利出还原集团的数量有关，通过比色法在540nm波长下测定反应液的OD值来计算还原糖的量。这种测定方法的主要优点是廉价，但灵敏度低，因而不适用于坚定几丁质讲解能力较弱的菌株。目前,在微生物产几丁质酶、纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶等糖苷水解酶类的研究过程中,一般是通过DNS试剂测定酶与底物反应生成的还原糖的量来反映酶活力的高低7平板菌落计数法菌落计
9、数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的 23或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。8平板划线分离法平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物
10、的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落,平板上四区面积的分配应是DCBA。9革兰氏染色 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：
11、染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G 表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的
12、溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G 和G-两大类群，常用的复染液是番红。 经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰
13、氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色细菌为革兰氏阴性菌。如下图所示10芽孢染色 芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常呈圆形或椭圆形。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿，在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。再用对比度大的复染剂（如番红液）染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样就可以将两者区别开来。 在不同细菌中，芽孢所
14、处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形，细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。11.微生物的生理生化反应在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。（1）淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主
15、要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 (2) 糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖
16、产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。(3).IMVC实验：主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。a.吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。b.甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解
17、产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转变为红色，即甲基红反应。大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。12小室培养法霉菌可产生分枝的菌丝体，分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10m），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。 载玻片培养观察法（小室培养法）：用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内
18、沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置于显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物。 本次试验通过小室培养观察产几丁质酶的真菌，根据其形态学结构，查资料确定其所属的属。四、 【实验步骤】（1）配制培养基和生理盐水：按照培养基配方配制几丁质酶筛选培养基和果胶酶筛选培养基。在烧杯中配置200ml0.85的生理盐水，用移液管 分别移取9ml于五支洁净试管，再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶，并放入少许玻璃珠。(2)灭菌：将培养基、培养皿、生理盐水、吸管在高压蒸汽灭菌锅内灭菌。（3）加土样：待生理盐水冷却后将冰箱中的已准确称取好的10g土样放入
19、盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中，充分震荡摇匀，然后放在30摇床中摇30min。（4）梯度稀释：静置取上清溶液，在无菌操作台上用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液（如下图）；（5）倒平板：在无菌操作台上，待培养基50左右，往几丁质酶筛选培养基加链霉素，然后倒几丁质酶筛选培养基和果胶酶筛选培养基于培养皿中。（6）涂布：在无菌操作台上，用无菌吸管分别由10-1、10-3两管土壤稀释液中吸取适量对好放入果胶酶已写好稀释度的平板中央位置，每平皿准确放入0.2ml，用无菌刮刀在培
20、养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；然后以同样的方法100、10-2的土壤稀释液涂布于几丁质酶筛选培养基上。（7）培养：将几丁质酶筛选培养基平板和果胶酶筛选培养基平板，倒置，放在培养箱中培养。几丁质酶筛选培养基平板培养34天，果胶酶筛选培养基平板培养30h。（8） 果胶酶菌的鉴定：30h后，将果胶酶帅选培养基平板菌落用用0.5%的刚果红染色1520分钟后，倒掉刚果红，用1M的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈。（9） 划线分离：制备果胶酶划线培养基，灭菌后倒平板用接种环挑取
21、较大透明圈的单菌落至筛选培养基平板，划线分离单菌落。（10） 培养：将果胶酶划线培养基倒置，放在培养箱中培养。（11） 30h后，观察果胶酶划线培养基的菌落，为单一菌落，所以为纯培养物，进行菌落描述：数菌落数目并记录，并此菌进行菌落形态描述，就菌落的大小（大、中，小），颜色（白，黄，粉红等），干湿（干、湿），边缘（整齐，不整齐），表面（光滑，粗糙，有无突起等）分别进行阐述并详细记录；（12） 配制果胶酶的固体斜面培养基：按照配方配制果胶酶的固体斜面培养基，将琼脂融化后将培养基分装至试管中，灭菌。（13） 纯种保藏：将果胶酶菌株划线接种到斜面培养基上，先放在培养箱中培养，待大约30h后，将其转移
22、到冰箱中保存。（14） 划线分离产几丁质酶菌株：制备几丁质酶划线培养基，灭菌后倒平板。（15） 挑取周围有透明圈的菌株，划线分离，（16） （16）观察几丁质酶划线培养基的菌落，为单一菌落，所以为纯培养物，进行菌落描述：数菌落数目并记录，并此菌进行菌落形态描述，就菌落的大小（大、中，小），颜色（白，黄，粉红等），干湿（干、湿），边缘（整齐，不整齐），表面（光滑，粗糙，有无突起等）分别进行阐述并详细记录；（17） 配制一份PDA培养基，分装试管并灭菌，制得斜面，将纯种划线接种在斜面上培养，然后放到冰箱中保存。（18） 小室培养法鉴定霉菌a) 灭菌准备制作4个平皿，在每个平皿皿底铺一张略小于皿底的
23、圆滤纸片，再放一U形玻棒，其上放一洁净载玻片和四块盖玻片，盖上皿盖、再与1个空平皿一起用牛皮纸包好；在100mL锥形瓶中用甘油配制20%的甘油，加塞包好；最后取10mL移液管两支用牛皮纸包好。b) 灭菌将上述用牛皮纸包好的仪器与试剂连同配好的PDA培养基一并放入灭菌锅中110灭菌30min（由于培养基中有葡萄糖，为防止由于高温而使糖发生糊化而变质，灭菌温度不宜过高）。c) 制作琼脂薄片在无菌操作台上分别取已灭菌并溶化冷却至约50的马铃薯琼脂培养基67mL 注入两个灭菌空平皿中，使之凝固成薄层。在两个凝固后的平板背部用记号笔画下约11.2cm11.2cm的方格，通过无菌操作，用解剖刀沿画下的方格
24、线将其切成方形的琼脂块。（注：解剖刀使用前应先在酒精中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，冷却后再进行切割操作）d) 接种在无菌操作台上，先用镊子将载玻片放于U型玻璃管上，然后用解剖刀取一小块儿琼脂块，置于载玻片上（注意：镊子与解剖刀每次使用前都应先在酒精中浸泡，灼烧冷却后再进行下一步的操作），用接种环分别从斜面培养物上挑取很少量的鉴定菌的孢子，分别接种于培养小室中琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。最后用移液管在培养小室中的圆滤纸上加3ml 灭菌的20 %的甘油（用于保持平皿内的湿度 ) ，盖上皿盖并贴标签，每一种菌接种两个小室。e) 恒温培养将接种后的平皿正置于28培养箱中恒温培养34
25、天。f) 镜检在显微镜下直接观察小室培养后的载玻片，用低倍镜即可较为清晰的观察到霉菌的菌丝体及孢子，根据真菌手册对所得的菌进行鉴定。 （19）产果胶酶菌株的鉴定19.1简单染色步骤a涂片取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多）b干燥与固定涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；c染色将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1.5mind水洗倾去染液，将载玻片的涂菌
26、面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止；e干燥用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；f镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察产果胶酶的细菌的形态，并记录其形态。19.2革兰氏染色步骤1.涂片先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域，在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水。分别取四种活跃生长期菌种（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌和一种自选菌）按常规方法涂片（不宜过厚），用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定。2.初染滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色1.5m
27、in后水洗；3.媒染先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min后水洗；4.脱色先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗；5.复染先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染1.5min后水洗；6.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以及该种菌的染色结果并记录下来。19.3芽孢染色步骤i. 涂片，加热干燥及固定在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水，分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌。然后按照常规方法加热干燥
28、及固定；ii. 孔雀绿加热染色用木夹夹住载玻片，向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位，然后在酒精灯上微微加热（孔雀绿着色能力强，加热可使较难染色的芽孢染成绿色，且再难洗脱）至染液冒蒸汽开始计时并维持5min，注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜，过热或加热不足均会影响观察效果，且加热时在载玻片上随时补加染液，切勿让涂片干涸；iii. 水洗水洗一定要等载玻片冷却后进行，否则可能导致载玻片的破裂。具体水洗按常规方法进行；iv. 复染用0.5%番红水溶液复染2min；v. 水洗并干燥按常规方法水洗后自然干燥；vi. 镜检先在低倍镜下寻找视野范围，然后换用高倍镜调焦，最后加香柏油在油镜下仔细
29、寻找该种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢。19.4半固体穿刺法观察细菌运动性i. 配制培养基配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基，分装于4支试管内，110度灭菌20-30分钟，正立于烧杯中冷却至室温；ii. 在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近(但勿触及)试管底,然后循原路退出。如图所示： iii. 接种完成后在30条件下培养两天观察并判断其运动性，并记录实验结果。19.5淀粉水解试验(1)倒平板：按照淀粉培养基配方配制固体淀粉培养基，灭菌，待培养基冷却至50左右，在酒精灯火焰旁倒平板，每组两个平板。 （2）用记号笔在平板底部划成四部分。 （3）接种：在无菌
30、操作台上，将待检测的菌点种，注意仅用接种针接触极少面积的培养基，在平板的反面对应部分贴上标签， （4） 培养：将平板倒置，在28温箱中培养两天。 （5） 观察：取出培养基，观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察培养皿中菌落周围是否有无色透明圈，若有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，为阳性，反之则为阴性。记录实验结果。19.6葡萄糖发酵试验i. 培养基配制将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。ii. 接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种
31、的菌名。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管2支，接种鉴定菌，另一支作为对照。iii. 培养将上述已接种的试管置于30培养箱中培养48小时。iv. 观察观察其颜色变化并记录下来结果。19.7乳糖发酵试验i. 培养基配制将配制好的乳糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。ii. 接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。取盛有乳糖发酵培养基的试管2支，接种鉴定菌，另一支作为对照。iii. 培养将上述已接种的试管置于30培养箱中培养48小时。iv. 观察观察其颜色变化并记录下来结果。19.8吲哚试验i. 培养基的配制将配制好的蛋白
32、胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。ii. 接种用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有蛋白胨水培养基的试管2支，接种鉴定的菌种。iii. 培养将上述已接种的试管置于30培养箱中培养48小时。iiii.观察观察其颜色变化并记录下来结果。19.9.甲基红试验i. 培养基的配制将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。ii. 接种用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有蛋白胨水培养基的试管2支，接种鉴定的菌种。iii. 培养:培养两天iv. 观察：将每支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入2滴甲基红试剂，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者
33、为阴性。观察试管内的颜色变化，并记录实验结果。(21)酶活的测定： a种子培养：从长好的平板上挑取产果胶酶的单菌接种到其相应的液体种子试管培养基中，将产几丁质酶的单菌落接种到，液体PDA培养基中30摇床培养1d左右。 b发酵培养：按接种量的5%将种子培养基接到发酵产酶培养基摇瓶中，摇瓶为300ml三角瓶，装液量50ml，30培养，每隔12小时取样测酶活。c酶活的测定 采用DNS法，规定每ml果胶酶液降解果胶底物每分钟产生1 g还原糖为1个酶活单位。吸取0.2 mL适当的稀释酶液于试管中，加18 mL、pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制的浓度为1的果胶底物(几丁质底物)溶液，37水浴反应30 min
34、后，立即加入2 mL的DNS终止反应，沸水浴10 min，冷却后蒸馏水定容到15 mL，摇匀。对照：吸取0.2 mL稀释酶液于试管中，加2 mL的DNS和1.8 mL、pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制的浓度为1的果胶底物（几丁质底物）溶液，37水浴反应30min，沸水浴10 min，冷却后蒸馏水定容到15 mL，摇匀。在540 nm下测定其吸光值并记录实验结果。注意标定时用蒸馏水做空白，若吸光度数值超过1.0，需要稀释后测定结果。六、【实验结果】1细菌的总的实验结果菌号基本特征鉴定结果1号短杆状，有芽孢，革兰氏阴性。水解淀粉，不分解葡萄糖乳糖，不产酸，分解色氨酸。有运动性。芽孢杆菌科 芽孢杆菌属
35、（Bacillus.）1000倍稀释平板的细菌种类和数目表1细菌种类及数目的测定平板1平板2平板3平均数种类数566-菌落数232524241g土壤中细菌的总数目：241000100/(0.210)=1.2106（个）表2目标菌菌落形态描述项目大小颜色边缘表面干湿度表面形状特征中等大小乳白色整齐湿润突起目标菌水解圈的检测：表3 水解圈大小测量数据水解圈水解圈1水解圈2水解圈3平均直径大小（cm）1.21.31.21.24水解圈简单染色的结果 简单染色后，镜检结果显示该产果胶酶的菌株为短杆状短杆状目标菌图1目标菌的简单染色4.细菌的革兰氏染色图 3金黄色葡萄球菌的革兰氏染色结果结果显示为革兰氏阳
36、性菌5.芽孢染色结果：显示为有芽孢，芽孢的特征如下表所示项目芽孢形状芽孢着生位置目标菌椭圆形位于菌体中央6运动性 由图可知，该细菌具有运动性，则具有鞭毛。7. 生理生化试验a)淀粉水解试验:表1.淀粉水解试验结果(“+”表示阳性，“”表示阴性)菌种阴 / 阳性结论目标菌+目标菌可水解淀粉淀粉水解圈淀粉水解圈b)葡萄糖发酵培养基：表2. 葡萄糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“”表示阴性）菌种目标菌空白颜色变化紫色紫色是否产气否否阴/阳性-结论该菌不分解葡萄糖或分解不产酸不产气对照组c)乳糖发酵培养基:表3. 乳糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“”表示阴性）菌种目标菌空白颜色变化紫色紫色是否产气否
37、否阴/阳性-结论该菌不分解乳糖或分解不产酸不产气对照组图8 乳糖酵解实验室意图d.吲哚实验表4.吲哚试验结果（“+”表示阳性，“菌种目标菌是否产生红色环状物是阴/阳性+结论目标菌可以分解色氨酸为吲哚a) 甲基红试验:表5. 甲基红试验结果（“+”表示阳性，“”表示阴性）菌种目标菌颜色变化变黄阴/阳性-结论该菌转化有机酸为非酸性末端产物甲基红试验图霉菌的实验结果根据小室培养的观察，最终确定为曲霉属，具体结果见下的描述形状直径大小（7296h）颜色厚度备注圆形20cm菌丝无色，孢子产生鲜绿色色素厚气生菌丝发达，孢子头目测成颗粒状集中于菌落中心，并向四周辐射式递减。基丝成辐射状分布几丁质稀释浓度10
38、010-2菌落个数28335菌落种类311小室培养时观察到该真菌具有辐射状分生孢子头；分生孢子呈直链排布形成孢子丝；孢子为球状，表面粗糙；菌丝均有隔，壁厚；均可见足细胞；且无假根，匍匐枝等结构。其1号形态符合典型的曲霉属特征，所以该真菌属于曲霉属。如下图所示：酶活的测定结果时间 项目 果胶酶实验组果胶酶对照组几丁质酶实验组几丁质酶对照组12h0.2860.2440.0450.02824h0.3170.2300.1750.10336h0.5450.3470.3120.18548h0.5790.2180.2110.17960h0.1440.144注：由于最后一组测的时候发现产几丁质酶菌液不知何时被
39、同学拿出摇床，所以没有最后的一组的几丁质的吸光度数据。七、【注意事项】1、实验时一定要事先做好准备，了解其要注意的事项及实验内容，以免实验时手忙脚乱，浪费时间且导致实验结果不理想。2、接种方式是液体固体，用灭菌的移液管或大枪头；接种后振荡接种瓶，使菌种充分与固体培养基混合。 3、酶活测定注意事项 试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落； 移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头； 精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理； 避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时； 4、U
40、V2000型分光光度计的使用注意事项 提前半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检； 将对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用镜头纸擦干外壁，放入样品室； 调节测定所用波长； 读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于30酒精中 5、在分离和纯化菌种时，应用力适度，切不可划破培养基，否则，不利于菌种的分离和纯化；6、纯化菌种时，要挑取分离平板上较小的菌落进行纯化，大片的菌落杂菌较多，同样，发酵培养纯化的产果胶酶菌种时也要挖取较小的单个菌落。【实验总结】 本次试验我们体验了如何自己设计实验，从土壤中提取微生物的一系列操作不仅巩固了这学期所学习的无菌操作技术和有关微生物的一
41、系列实验步骤，更是深刻理解了实验操作规范的重要性，学会了如何从土样中筛选含果胶酶的菌株和产几丁质酶的菌株。熟悉菌株筛选的具体操作流程。并且能够根据菌落形态，染色结果，运动性等来鉴定未知细菌；小室培养法观察未定未知真菌。了解了菌株筛选、分离纯化、鉴定等具体操作流程。在实验的过程中复习了本学期所学的微生物实验的相关的操作步骤，并进一步强化无菌操作的概念。本次试验还是比较成功的，我们组筛选出了产果胶酶和产几丁质酶的菌株。附录培养基1.果胶酶筛选培养基：果胶 2gK2HPO4 1gMgSO4 0.5gNaNO3 3gFeSO4 0.01g琼脂 20gpH 7.0水 1000mL2.几丁质酶真菌筛选培养
42、基:胶体几丁质 2.5gK2HPO4 0.7gK2HPO4 0.3gMgSO4 7H2O 0.5gFeSO4 7H2O 0.01g琼脂 20gpH 7.0水 1000mL3.牛肉膏蛋白胨培养基的配制：牛肉膏 3g蛋白胨 10gNaCl 5g琼脂 15 - 20g水 1000mLpH 7.0 - 7.24.马铃薯培养基（PDA）的配制：马铃薯 40g蔗糖 4g琼脂 4g水 200mlPH 自然马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖和琼脂，溶化后补足至200ml，121灭菌20min。5.淀粉培养基 牛肉膏 2g NaCl 5g蛋白胨 10g可溶性淀粉 2g琼脂 1520g水 1000ml6.糖发酵培养基NaCl 5g蛋白胨 10g水 1000mlpH 7.61.6%溴甲酚紫乙醇溶液