生化技术凝胶过滤课件.ppt

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1、关于生化技术凝胶过滤第1页，此课件共70页哦 凝胶过滤是凝胶过滤是20C-60Y20C-60Y发展起来的一种分离纯化方法；发展起来的一种分离纯化方法；又称分又称分子筛层析、排阻层析子筛层析、排阻层析原理：原理：凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被阻挡在外部，从而使混合溶液中各种组分按分子物质却被阻挡在外部，从而使混合溶液中各种组分按分子质分子质量不同量不同进行筛分进行筛分特点：特点：设备设备简单，操作方便、重复性好、回收率高简单，操作方便、重复性好、回收率高用途：用途：分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等，分离纯化蛋白质、核酸、

2、多糖、激素等，测定蛋白质测定蛋白质分子质量、样品的浓缩和脱盐等分子质量、样品的浓缩和脱盐等 第2页，此课件共70页哦目目 的的n掌握凝胶的分类和性质掌握凝胶的分类和性质n掌握凝胶过滤的基本原理掌握凝胶过滤的基本原理n熟悉凝胶过滤的操作与应用熟悉凝胶过滤的操作与应用第3页，此课件共70页哦第一节第一节 凝胶的分类及性质凝胶的分类及性质 第4页，此课件共70页哦 凝胶是一类不溶于水，但在水中有较大膨胀度和较好分凝胶是一类不溶于水，但在水中有较大膨胀度和较好分子筛作用的化合物子筛作用的化合物 目前主要有目前主要有葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶、天然琼脂糖天然琼脂糖和和交联琼脂糖交联琼脂糖；其次；其次，还有，还

3、有聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（生物胶）、（生物胶）、交联葡聚糖与双丙烯酰胺共交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶聚凝胶，以及，以及交联琼脂糖与葡聚糖共价结合的凝胶交联琼脂糖与葡聚糖共价结合的凝胶等等第5页，此课件共70页哦第6页，此课件共70页哦第7页，此课件共70页哦商品名称：商品名称：Sephadex，由葡聚糖由葡聚糖右旋糖酐右旋糖酐(G型型)和和3-氯氯-1，2环氧环氧丙烷丙烷(交联剂交联剂)以醚键交联而成以醚键交联而成 在交联葡聚糖在交联葡聚糖G-25、G-50中加入羟丙基后，即可构成烷基化（中加入羟丙基后，即可构成烷基化（LH型）葡聚糖凝胶型）葡聚糖凝胶 一、葡聚糖凝胶一、葡聚糖凝胶第8

4、页，此课件共70页哦第9页，此课件共70页哦性状：性状：外观为白色珠状颗粒，在显微镜下可见表面为外观为白色珠状颗粒，在显微镜下可见表面为网状网状皱纹皱纹溶解性：溶解性：带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀胀 型号：型号：Sephadex G-nSephadex G-n（n n越大，则交联度越小，而膨胀度、吸水量和筛孔越大，则交联度越小，而膨胀度、吸水量和筛孔直径则越大直径则越大）应用：应用：1.1.理化性质理化性质凝胶过滤层析：凝胶过滤层析：以以G G型型SephadexSephadex为固定相，水为流动相，对为

5、固定相，水为流动相，对水溶性物质进行分离水溶性物质进行分离凝胶渗透层析：凝胶渗透层析：以以LHLH型型SephadexSephadex为固定相，以有机溶剂为为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离流动相，对脂溶性物质进行分离第10页，此课件共70页哦 在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的、不溶解的 强酸或氧化剂强酸或氧化剂溶液中，则容易使糖苷键水解断裂溶液中，则容易使糖苷键水解断裂 在室温下长期保存时，应加入适量的在室温下长期保存时，应加入适量的防腐防腐剂如剂如CHClCHCl3 3、0.050.05N

6、aNNaN3 3或或2020EtOHEtOH等等 2.2.稳定性稳定性第11页，此课件共70页哦含少量的羧基基团，为含少量的羧基基团，为弱酸性弱酸性物质。能与带物质。能与带正电荷的分离物正电荷的分离物如碱性如碱性蛋白质等发生吸附蛋白质等发生吸附克服方法：克服方法：提高提高洗脱液的洗脱液的离子强度离子强度至至0.050.05以上，可克服此非特异以上，可克服此非特异性吸附性吸附 常用含有常用含有NaClNaCl的缓冲液作洗脱液。的缓冲液作洗脱液。新购得葡聚糖凝胶新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，虽然对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，虽然吸附的数量较少，但在定量测定或者分离纯化极难得到的

7、物质时吸附的数量较少，但在定量测定或者分离纯化极难得到的物质时，也需先用易得到的蛋白质进行，也需先用易得到的蛋白质进行预层析预层析，以便消除其影响，以便消除其影响 3.吸附性吸附性第12页，此课件共70页哦葡聚糖凝胶对葡聚糖凝胶对芳香族化合物芳香族化合物或或杂环化合物杂环化合物以及以及某些凝集素某些凝集素具具有较强的吸附作用，若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利有较强的吸附作用，若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸附性能，而不是排阻原理用的是吸附性能，而不是排阻原理 第13页，此课件共70页哦第14页，此课件共70页哦琼脂糖是从琼脂中分离出来的一种由琼脂糖是从琼脂中分离出来的一种由D-

8、D-半乳糖和半乳糖和3,63,6脱水的脱水的L-L-半半乳糖连接而成的多糖。其商品名因生产厂家不同而异乳糖连接而成的多糖。其商品名因生产厂家不同而异瑞典、中国瑞典、中国 ：SepharoseSepharose美国：美国：Bio-gel A Bio-gel A 15m15m，排阻分子量小于排阻分子量小于1515millionmillion的分子，即的分子，即15 15 10106 6（排阻限度）（排阻限度）英国：英国：SegavacSegavac，粉状、颗粒状粉状、颗粒状丹麦：丹麦：GelaroseGelarose除除SegavacSegavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售外，都是以珠状琼脂

9、糖凝胶形式出售 二、琼脂糖凝胶二、琼脂糖凝胶第15页，此课件共70页哦1.1.性性 质质高温时呈液态，经凝集即成琼脂糖凝胶高温时呈液态，经凝集即成琼脂糖凝胶对尿素、盐酸胍等具有较强的抵抗力，在对尿素、盐酸胍等具有较强的抵抗力，在pH4.0pH4.09.09.0缓冲液中缓冲液中稳定稳定层析流速较高层析流速较高干胶易脱水破裂，一般存放于含防腐剂的水溶液中，避免剧烈搅干胶易脱水破裂，一般存放于含防腐剂的水溶液中，避免剧烈搅拌拌第16页，此课件共70页哦Sepharose 2B(2)、4B(4)和和6B(6)Sepharose 6B的机械强度大于的机械强度大于2B，但是筛孔小于但是筛孔小于2B Sep

10、harose与与1，3-二溴异丙醇二溴异丙醇(1,3-dibromopropanol)在强碱性条件下在强碱性条件下反应后，即生成反应后，即生成CL型交联琼脂糖型交联琼脂糖(Sepharose CL）这种琼脂糖的筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，但耐热、耐酸碱这种琼脂糖的筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，但耐热、耐酸碱。但是在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生解聚（。但是在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生解聚（稳定性提高稳定性提高）2.2.应用形式（按浓度分）应用形式（按浓度分）第17页，此课件共70页哦3.3.特特 点点 机械强度和筛孔的机械强度和筛孔的稳定性稳定性都比葡聚糖凝胶好；且层

11、析时都比葡聚糖凝胶好；且层析时流流速较快速较快第18页，此课件共70页哦商品名称：商品名称：Bio-gel（生物胶）。以生物胶）。以甲撑双丙烯酰胺甲撑双丙烯酰胺(双体双体)作交联剂作交联剂，以，以过硫酸铵过硫酸铵作催化剂，在作催化剂，在N，N，N，N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)加加速剂的作用下（化学催化），将速剂的作用下（化学催化），将丙烯酰胺丙烯酰胺(单体单体)聚合而成聚合而成 当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。商品聚丙烯酰胺凝胶当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。商品聚丙烯酰胺凝胶型号有型号有Bio-gel P-2到到P-300，其阿拉伯数字表示排阻限度其阿拉

12、伯数字表示排阻限度 如如 Bio-gel P-150的排阻限度为小于的排阻限度为小于150 103 Da三、聚丙烯酰胺凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶第19页，此课件共70页哦 聚丙烯酰胺凝胶一般制成珠状颗粒，使用前必须溶胀。聚丙烯酰胺凝胶一般制成珠状颗粒，使用前必须溶胀。能忍受浓的能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；耐酸碱盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；耐酸碱，但要避免长期与强酸和强碱接，但要避免长期与强酸和强碱接触，如果与其接触并在高温条件下，酰胺基将迅速发生分解触，如果与其接触并在高温条件下，酰胺基将迅速发生分解 聚丙烯酰胺凝胶对聚丙烯酰胺凝胶对芳香族芳香族的、的、酸性和碱性的化合物酸性和碱性的化合

13、物稍有稍有吸附吸附现象现象 克服吸附的方法：提高洗脱液的离子强度克服吸附的方法：提高洗脱液的离子强度 第20页，此课件共70页哦SephacrylSephacryl是是由由烯丙烷基葡聚糖烯丙烷基葡聚糖与与甲撑双丙烯酰胺甲撑双丙烯酰胺共价交联制成。此共价交联制成。此凝胶属凝胶属硬性凝胶硬性凝胶，它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团，它具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团耐酸碱、耐去污剂、耐解离剂，甚至可用去污剂、盐酸胍或尿素耐酸碱、耐去污剂、耐解离剂，甚至可用去污剂、盐酸胍或尿素溶液作洗脱剂溶液作洗脱剂 多用于多用于蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖的分离纯化，也用于的分离纯

14、化，也用于病毒颗病毒颗粒粒的分离的分离四、四、SephacrylSephacryl第21页，此课件共70页哦 由高交联度的琼脂糖与葡聚糖共价结合而成由高交联度的琼脂糖与葡聚糖共价结合而成特点：特点：具有良好的分子筛特性和理化具有良好的分子筛特性和理化稳定性稳定性。溶液的酸碱度可在。溶液的酸碱度可在pH3pH3 1212范围内变化；溶液中加入去污剂范围内变化；溶液中加入去污剂(如如1 1SDS)SDS)和和(或或)解离剂解离剂(如如8 8mol/Lmol/L尿素、尿素、6 6mol/Lmol/L盐酸胍盐酸胍)时，也不会影响分离效果时，也不会影响分离效果 五、五、SuperdexSuperdex第

15、22页，此课件共70页哦SuperoseSuperose：高交联度的多孔琼脂糖珠高交联度的多孔琼脂糖珠玻璃珠：玻璃珠：有大量的网孔，且分布均一。机械性能良好，在较高的层有大量的网孔，且分布均一。机械性能良好，在较高的层析流速下，分辨率并不受影响，其析流速下，分辨率并不受影响，其缺点缺点是对蛋白质等物质有是对蛋白质等物质有吸附吸附能力能力聚苯乙烯凝胶聚苯乙烯凝胶五、其五、其 他他第23页，此课件共70页哦第二节第二节 基本原理基本原理第24页，此课件共70页哦一、基本原理一、基本原理 凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径较一致，且凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径较

16、一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排阻某些大分子化合物于筛呈珠状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则可以在筛孔中自由扩散和渗透。某种组分凝孔之外，而小分子化合物则可以在筛孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻的程度用胶层析柱中被排阻的程度用 表示表示avkotoeavVVVVk 洗脱体积；洗脱体积；外水体积；外水体积；凝胶床体积凝胶床体积eVoVtV 在一定层析条件下，在一定层析条件下，和和 均为固定值，而均为固定值，而 随着被分离物分子量的变化而变化。随着被分离物分子量的变化而变化。组分分子量越大，则洗脱更容易（排阻越多），组分

17、分子量越大，则洗脱更容易（排阻越多），越小，越小，越小越小tVoVeVeVavk第25页，此课件共70页哦 各组分间的各组分间的 值差异越大，分离效果越好；值差异越大，分离效果越好；差异越小差异越小,则分离效果则分离效果很差，或根本无法分离很差，或根本无法分离 流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分管流出物，得到分子量不同的各种组分avkavk第26页，此课件共70页哦 1、当、当Kav=0时，则时，则Ve=Vo，即对于根本不能进入，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质全排阻，

18、洗脱体积等于空隙凝胶内部的大分子物质全排阻，洗脱体积等于空隙体积即外水体积（图中组分体积即外水体积（图中组分）2、当、当Kav=1时，时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积之和。之和。Ve=Vo+Vi（图中组分（图中组分）第27页，此课件共70页哦3 3、当、当0 0K Kavav1 1时，时，V Ve e=V Vo o+K Kavav（V Vi i V Vg g）。）。表示固定相中只有一表示固定相中只有一部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，V Ve e即

19、在即在V Vo o与与V Vo o+V Vi iV Vg g之间之间变化（图中组分变化（图中组分）4 4、有时、有时K Kavav1 1，表示凝胶对组分有吸附作用表示凝胶对组分有吸附作用 （从内水中洗脱出来从内水中洗脱出来的含量下降），此时的含量下降），此时V Ve eV Vo o+V Vi iV Vg g。例如一些芳香族化合物如苯丙例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在氨酸，酪氨酸和色氨酸等在Sephadex G-25Sephadex G-25中的洗脱体积远超出理论中的洗脱体积远超出理论计算的最大值计算的最大值第28页，此课件共70页哦二、二、值的测定值的测定avkotoeavV

20、VVVk只要测出只要测出 、和和 ，即可计算出，即可计算出 值值 eVoVtVavktV 的测定：的测定：（1 1）计算法：）计算法：（2 2）测定法：）测定法：hRVt2itiggitVVVVVVVVV00相比可忽略，故与由于第29页，此课件共70页哦 的测定：的测定：用蓝色的葡聚糖用蓝色的葡聚糖20002000（M=200M=200万），在万），在SephadexSephadex中被完中被完全排阻，并借助其本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测（全排阻，并借助其本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测（210210、260260或或620nm620nm）洗脱体积）洗脱体积 的测定：的测定：用用

21、、N-N-乙酰酪氨酸或其他小分子物质作为乙酰酪氨酸或其他小分子物质作为洗脱对象。由于分子量小，且无吸附，故洗脱体积刚好是洗脱对象。由于分子量小，且无吸附，故洗脱体积刚好是 （=1=1）当分子大小在凝胶孔径的上、下限之间时，则当分子大小在凝胶孔径的上、下限之间时，则 介于介于 和和 之间之间（即（即 =0=0 1 1）oV424)(SONHtVtVavkeVoVtVavk第30页，此课件共70页哦第31页，此课件共70页哦第三节第三节 操操 作作第32页，此课件共70页哦（一）凝胶的选择（一）凝胶的选择 1.1.型号：型号：凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同如：如：

22、Sephadex G Sephadex G 型多用于分离蛋白质；型多用于分离蛋白质；生物胶和生物胶和 SephacrylSephacryl等多用于分离核酸；等多用于分离核酸；要除去蛋白质中的盐类，多用要除去蛋白质中的盐类，多用Sephadex G-25Sephadex G-252.2.粒度：粒度：粒度与交联度无关。与粗颗粒相比，细颗粒凝胶之间空隙粒度与交联度无关。与粗颗粒相比，细颗粒凝胶之间空隙小，装柱易均匀，分离效果好，但流速慢；而粗颗粒凝胶流速快，小，装柱易均匀，分离效果好，但流速慢；而粗颗粒凝胶流速快，宜用小颗粒直径的层析柱宜用小颗粒直径的层析柱 一、凝胶的选择与处理一、凝胶的选择与处理

23、第33页，此课件共70页哦第34页，此课件共70页哦（二）凝胶用量计算（二）凝胶用量计算 膨胀度）干凝胶用量（hrg2 由于凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算出的凝由于凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算出的凝胶用量需增加胶用量需增加101020%20%第35页，此课件共70页哦（三）凝胶的处理（三）凝胶的处理 将所用的干胶置于将所用的干胶置于5 51010倍量的倍量的D.WD.W中，充分浸泡（表中，充分浸泡（表6-26-2溶胀时间）溶胀时间），用倾斜法去除表面悬浮的小颗粒，再用，用倾斜法去除表面悬浮的小颗粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaOH-0.5mo

24、l/LNaCl0.5mol/LNaCl室温浸泡室温浸泡0.5h0.5h，抽滤除去碱液，用，抽滤除去碱液，用D.WD.W洗至中性。再洗至中性。再用抽气方法以用抽气方法以D.WD.W或平衡液除去凝胶颗粒之间的气泡或平衡液除去凝胶颗粒之间的气泡第36页，此课件共70页哦1 1柱子的选择柱子的选择当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高柱长相同时，直径大者比小者分辨率高柱长相同时，直径大者比小者分辨率高床体积相同时，柱长长者比短的分辨率高床体积相同时，柱长长者比短的分辨率高一般理想的层析柱直径与长度之比是一般理想的层析柱直径与长度之比是1 1：25251 1：1

25、00100；层析柱外面最；层析柱外面最好有夹套，好有夹套，能控制温度（柱温箱）能控制温度（柱温箱），以保证结果的重复性，以保证结果的重复性 2 2装柱：装柱：常用湿装法（第三章）常用湿装法（第三章）3 3凝胶柱的鉴定凝胶柱的鉴定 二、凝胶柱的制备二、凝胶柱的制备第37页，此课件共70页哦流速、柱长对分离的影响流速、柱长对分离的影响 第38页，此课件共70页哦 加样量与层析柱床体积及检测方法的灵敏度有关。床体积越小加样量与层析柱床体积及检测方法的灵敏度有关。床体积越小、方法灵敏度越高时，加样量越少、方法灵敏度越高时，加样量越少 层析的目的在于分析时，加样量占床体积的层析的目的在于分析时，加样量占

26、床体积的12，作制备、脱盐用，作制备、脱盐用时，占时，占2030 一般来说，加样量越少，分辨率越高。具体加样体积由一般来说，加样量越少，分辨率越高。具体加样体积由分配分配系数系数(Kav)或洗脱体积或洗脱体积(Ve)来决定来决定三、加样与洗脱三、加样与洗脱（一）加（一）加 样样第39页，此课件共70页哦第40页，此课件共70页哦 V VeAeA、V VeBeB：组分组分A A、B B的洗脱体积的洗脱体积 K KavAavA、K KavBavB：组分：组分A A、B B的分配系数的分配系数 V Vs s：A A、B B两组分的洗脱体积之差（又称为分离体积）两组分的洗脱体积之差（又称为分离体积）V

27、 Vs s=V=VeA eA V VeBeB当样品体积当样品体积V Vp pV Vs s时，理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开时，理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开(图中图中)。但由。但由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大加样量（加样量（V Vp p）的确定）的确定第41页，此课件共70页哦 图图、中中A A、B B两种物质有一定程度的交叉，这表明二者只是部两种物质有一定程度的交叉，这表明二者只是部分分开。因此，当分分开。因此，当V Vp p等于或大于等于或大于V Vs s时，时，A A、B

28、B两种物质就不能完全分开两种物质就不能完全分开(图中图中)当当V Vp pV Vs s时，时，A A、B B两种物质就能分开两种物质就能分开(图中图中)根据根据 V Ve e=V=Vo o+K+Kavav（V Vt t V Vo o）又又 V Vs s=V=VeAeAV VeB eB =（K KavAavAK KavB avB）（）（V Vt t V Vo o）第42页，此课件共70页哦 V Vs s=（K KavAavAK KavB avB）（）（V Vt t V Vo o）=（K KavAavAK KavB avB）（）（V Vi i+V+Vg g）A A、B B两种物质能分开的最低限：两

29、种物质能分开的最低限：V Vp pV Vs s最大最大V Vs s时的必要条件：时的必要条件：K KavAavAK KavB avB 最大，为最大，为1 10 01 1 V Vi i+V+Vg g最大，一般为最大，一般为V Vt t/2/2则：则：最大理论加样量最大理论加样量V Vp pV Vs sV Vt t/2/2最大理论加样量的计算最大理论加样量的计算第43页，此课件共70页哦 为提高分离效果，除了缩小加样体积以外，样品的黏度也一般以为提高分离效果，除了缩小加样体积以外，样品的黏度也一般以小于小于2 2cp(cp(厘帕，厘帕，P=N/mP=N/m2 2s s)，或者与洗脱液的黏度相当为宜

30、或者与洗脱液的黏度相当为宜 葡聚糖使粘度上升葡聚糖使粘度上升 黏度的影响黏度的影响第44页，此课件共70页哦粘度对柱层析的影响粘度对柱层析的影响 第45页，此课件共70页哦1.1.洗脱液的选择原则洗脱液的选择原则 能溶解被洗脱物质而又不使其变性或失活能溶解被洗脱物质而又不使其变性或失活 一般以单一缓冲液（如一般以单一缓冲液（如PBSPBS、Tris-HClTris-HCl缓冲液等）或盐溶液，有时甚至用缓冲液等）或盐溶液，有时甚至用D.WD.W作为洗脱液作为洗脱液 2.2.洗脱速度洗脱速度 若流速不均匀，收集的每一部分洗脱体积不恒定，若流速不均匀，收集的每一部分洗脱体积不恒定，K Kavav就难

31、以确定就难以确定 最好的装置是最好的装置是恒流泵恒流泵(微量泵、蠕动泵微量泵、蠕动泵)，可以使流速在较大范围内恒定，可以使流速在较大范围内恒定。若无此装置，可用控制操作压的办法进行，其装置可使用恒压瓶。若无此装置，可用控制操作压的办法进行，其装置可使用恒压瓶 一般，洗脱速度慢，分离效果就好；但若太慢，又会因扩散加剧而影响一般，洗脱速度慢，分离效果就好；但若太慢，又会因扩散加剧而影响分离效果分离效果(二二)洗洗 脱脱第46页，此课件共70页哦。第47页，此课件共70页哦Sephadex G-50Sephadex G-50及其以下（交联度大）的流速与操作压之间的及其以下（交联度大）的流速与操作压之

32、间的关系遵守关系遵守DarcysDarcys规律规律LPKuu u：线性流速：线性流速(ml/cmml/cm2 2h)h)K K：常数：常数(粗、中、细颗粒的各不相同粗、中、细颗粒的各不相同)P P：操作压：操作压(cp)cp)L L：柱长柱长流速与操作压流速与操作压第48页，此课件共70页哦LPKuo K Ko o仅与凝胶的性质有关，而与柱子直径基本无关。仅与凝胶的性质有关，而与柱子直径基本无关。但是但是G-75G-75以上各种型号交联葡聚糖的流速还与柱直径大小有关以上各种型号交联葡聚糖的流速还与柱直径大小有关 当洗脱液的黏度为当洗脱液的黏度为lcplcp时的表达式时的表达式第49页，此课件

33、共70页哦第50页，此课件共70页哦 一般，洗脱流速慢，则分离效果就好；但太慢又会因扩散加剧而一般，洗脱流速慢，则分离效果就好；但太慢又会因扩散加剧而影响分离效果影响分离效果第51页，此课件共70页哦四、凝胶柱的再生及保存四、凝胶柱的再生及保存（一）再生（一）再生 使用过一次或几次的凝胶柱，通常用使用过一次或几次的凝胶柱，通常用3 34 4倍床体积的洗脱液倍床体积的洗脱液冲洗，再用平衡液平衡即可；但使用过多次后，凝胶冲洗，再用平衡液平衡即可；但使用过多次后，凝胶床体积变小床体积变小、流动速度下降、杂质过多、流动速度下降、杂质过多等，其处理方法是等，其处理方法是 先用水反复进行逆向冲洗（反冲），

34、再用缓冲液进行平衡；先用水反复进行逆向冲洗（反冲），再用缓冲液进行平衡；把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行处理，把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行处理，然后重新装柱然后重新装柱第52页，此课件共70页哦膨胀状态膨胀状态 即在水相中保存。可加入即在水相中保存。可加入0.02%0.02%的叠氮钠（的叠氮钠（NaNNaN3 3）溶液等防腐剂或溶液等防腐剂或加热灭菌后于低温短时间保存。加热灭菌后于低温短时间保存。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂。因为它们能引起凝一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂。因为它们能引起凝胶颗粒的收缩，同时还能进入层析仪器的塑料部件，使塑料变软胶颗粒的

35、收缩，同时还能进入层析仪器的塑料部件，使塑料变软，造成不良后果，造成不良后果（二）保（二）保 存存第53页，此课件共70页哦第54页，此课件共70页哦半收缩状态：半收缩状态：用完后水洗净，然后再用用完后水洗净，然后再用60%60%70%70%乙醇洗，则凝胶体积缩小，于乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温较长时间保存低温较长时间保存干燥状态：干燥状态：用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用95%95%乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于60608080烘干后长时

36、间保存烘干后长时间保存不脱水而直接烘干会黏结成块不脱水而直接烘干会黏结成块第55页，此课件共70页哦第四节第四节 应应 用用第56页，此课件共70页哦原理：原理：盐类小分子物质进入凝胶筛孔，而大分子物质则被排阻在外盐类小分子物质进入凝胶筛孔，而大分子物质则被排阻在外（分子筛原理）分子筛原理）优点：优点：与透析相比，速度快，不会引起大分子物质变性与透析相比，速度快，不会引起大分子物质变性材料：材料：细颗粒葡聚糖凝胶细颗粒葡聚糖凝胶G-25G-25 一、脱盐和浓缩一、脱盐和浓缩第57页，此课件共70页哦分离对象：分离对象：溶解度、带电性等理化性质相似而分子质量不溶解度、带电性等理化性质相似而分子质

37、量不 同，或同，或者是聚合度不等的混合物溶液者是聚合度不等的混合物溶液实例：实例：Sephadex G-200Sephadex G-200层析纯化层析纯化AFPAFP 制备制备Ag-AbAg-Ab复合物复合物 溶于少量溶于少量0.1mol/L Gly-HCl0.1mol/L Gly-HCl缓冲液中，缓冲液中，并用本液透析并用本液透析2h 2h 上上Sephadex G-200Sephadex G-200柱柱 得得AFPAFP峰峰 置置0.1mol/L0.1mol/L柠檬酸柠檬酸-磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH4.8pH4.8）透析）透析 上柱洗脱上柱洗脱 AFPAFP纯品纯品二、分离生命物质二、

38、分离生命物质第58页，此课件共70页哦第59页，此课件共70页哦第60页，此课件共70页哦热源物质：热源物质：指微生物产生的指微生物产生的分子量很大分子量很大的某些多糖蛋白复的某些多糖蛋白复 合物等合物等，能使人体发热的物质，能使人体发热的物质材料：材料：Sephadex G-25Sephadex G-25（8080120120目目 ）特点：特点：比活性炭吸附、离子交换吸附等方便比活性炭吸附、离子交换吸附等方便 实例：实例：用用Sephadex G-25Sephadex G-25凝胶层析除去氨基酸粗品中的热源质：利用凝胶层析除去氨基酸粗品中的热源质：利用热源（大分子蛋白类）的热源（大分子蛋白类

39、）的K Kavav=0=0，而氨基酸的，而氨基酸的K Kavav11，将试剂量控制在柱，将试剂量控制在柱体积的体积的202030%30%，能实现完全分离，能实现完全分离三、去热源物质三、去热源物质第61页，此课件共70页哦 原理：原理：Kav=b lgM+c 或或lgM=adKav(M为分子质量，常数为分子质量，常数a、b、c、d均大于均大于0)先做标准曲线，再在相同条件下测样品先做标准曲线，再在相同条件下测样品Kav 也可用以下也可用以下4个指标代替个指标代替VeVo：分离体积分离体积Ve/Vo：相对保留体积（另相对保留体积（另R Vo/Ve）Ve/Vt：简化的洗脱体积，受柱的填充情况的影响

40、较小简化的洗脱体积，受柱的填充情况的影响较小 Ve：洗脱体积洗脱体积特点：简便实用，所需样品量较少特点：简便实用，所需样品量较少 四、测定分子质量四、测定分子质量第62页，此课件共70页哦pH6pH68 8的范围内，曲线线性才比较好；而在极端的范围内，曲线线性才比较好；而在极端pHpH时，由于变性等时，由于变性等原因易偏高原因易偏高 一般一般适用于球状适用于球状propro的分子量测定，而纤维状的分子量测定，而纤维状propro不合适不合适糖蛋白中若糖蛋白中若糖的比例糖的比例5 5时，测定结果偏大时，测定结果偏大不受不受变性剂变性剂如尿素和盐酸胍的影响如尿素和盐酸胍的影响有些酶类不适用。如有些

41、酶类不适用。如淀粉酶淀粉酶，能与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络，能与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶合物与酶-底物络合物相似，因此在凝胶层析时有异常反应底物络合物相似，因此在凝胶层析时有异常反应用凝胶过滤法测定分子量的局限性用凝胶过滤法测定分子量的局限性第63页，此课件共70页哦第64页，此课件共70页哦第65页，此课件共70页哦第66页，此课件共70页哦第67页，此课件共70页哦 若在若在SephadexSephadex分子上连接分子上连接DEAEDEAE、羧甲基或磺酸乙基等离子基、羧甲基或磺酸乙基等离子基团，可使凝胶在具有分子筛基础上，还具有团，可使凝胶在具有分子筛基础上，还具有离子交换

42、离子交换能力，大能力，大大提高大提高SephadexSephadex在生化制药中的应用范围在生化制药中的应用范围 如：如：DEAE-Sephadex A-25DEAE-Sephadex A-25可用于制备无热原物质的去离子水可用于制备无热原物质的去离子水五、其五、其 他他第68页，此课件共70页哦4 4在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为140140mlml，其其外水体积和总体积分别为外水体积和总体积分别为6060mlml和和200200mlml，求分配系数是多少求分配系数是多少?思考题思考题 解：解：V Ve e=V=Vo o+K+Kavav（V Vt t V Vo o ）140 140=60+K=60+Kavav（200200 60 60）K Kavav=0.57=0.57第69页，此课件共70页哦感谢大家观看感谢大家观看第70页，此课件共70页哦