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1、收稿日期 2005-06-29 修回日期 2005-09-29*基金项目 国家自然科学基金资助项目(No.30100188);广州市科技计划项目(No.2002U13E0011)资助v 通讯作者 Tel:87335822;E-mail:X 文章编号 1000-4718(2006)06-1129-04大鼠骨髓间质干细胞对同种骨髓移植后造血重建和免疫重建的作用*雷俊霞1,6,郭振宇2,赵东长3,李红霞4,余伟华1,张秀明6,郑芹1,魏箐5,李树浓1,项鹏6v(中山大学1中山医学院病理生理教研室,6干细胞中心,广东 广州 510080;2中山大学附属第五医院器官移植科,广东 珠海 519000;3广
2、东省妇幼保健院儿科,广东 广州 510010;4广州市公安局刑事科学技术研究所,广东 广州 510030;5中山大学附属第二医院医学中心,广东 广州 510120)摘要目的:探讨大鼠骨髓间质干细胞(MSC)对同种异体骨髓移植造血重建和免疫重建的影 响。方 法:建立大鼠同种异体骨髓移植模型,通过生存 率分析、外周血象检测、免疫细胞计 数和受体免 疫功能检 测,综 合评价 MSC对骨髓 移植(bonemarrowtransplantation,BMT)后造血重 建和免 疫重建 的作 用。结果:(1)MSC 可促进 B MT 后造 血重建:移植后 30d,共移植组外周血白细胞、淋巴细胞和血小板数均高
3、于单纯骨髓 移植组;共移植组 骨髓细胞 数也高于对照组。(2)MSC可促进 B MT 后免疫重建:移植后 30 d,共移 植组胸 腺细胞 数、脾 细胞总 数均高 于骨髓单 纯移植 组;共移植组对 ConA、LPS 刺激的淋巴细胞增殖反应以 及对第 三体来 源的同 种混合 淋巴细胞 反应 均强 于单纯 B MT 组。结论:大鼠 MSC与骨髓共移 植对同种异体骨髓移植造血重建和免疫重建有一定促进作用。关键词 间质干细胞;骨髓移植;造血复建;免疫复 建中图分类号 R338 18 文献标识码 AEffects of cotransplantation of rat bone marrow mesenc
4、hymal stem cells andbone marrow on hematopoiesisLEI Jun-xia1,6,GUO Zhen-yu2,ZHAO Dong-chang3,LI Hong-xia4,YU Wei-hua1,ZHANG Xiu-ming6,ZHENG Qin1,WEI Qing5,LI Shu-nong1,XIANG Peng6(1Departmento f Pathop hysiology,Zhon gshanMedicalCollege,6StemCell Center,Sun Yat-senUniversity,Guang zhou 510080,China;
5、2De pa rtmentof OrganTransplantation The Fifth AffiliatedHosp ital o f Sun Yat-senUniversity,Zhuhai 519000,China;3De partmento f Pediatrics,Guangdong ProvinceMaternal andChildren.sH osp ital,Guan gzhou510010,China;4Instituteo f Crim-inal Sciences,Public Secu rity Bureau,Guangzhou 510030,China;5Medic
6、alCenter,TheSecondAffiliatedH ospital,Sun Ya t-senUniversity,Guangzhou510120,China)ABSTRACTAIM:To inves tigate effectsof rBMMSConhematopoiesis and im munereconstitutionafterallo-hematopo-ietic stemcellstransplantation(HSCT).METHODS:AllogeneicBMT modelfrom Fischer344rats(RT-1Al)to Wistar rats(RT-1Au)
7、wasestablished.The effectsofMSCson hematopoietic reconsti tution andimmunereconstitu tion were studiedby observingthe survival rate,peripheralbloodcounts,thymuscounts,spleencounts,bonemarrowcountsand immunefunctionanalysisat 30daysafter transplan tation.RESULTS:1.Cotransplantationof MSCs and bone ma
8、rrow(BM)was demonstratedto improvehematopoieticrecons titution.Lymphocyteandplateletcountsin peripheralbloodin cotransplantation groupswerehigherthan thosein controlgroups.More bonemarrowneucleatedcells werealsoobservedin cotransplantation groups.2.Cotransplantation of MSCsandBM improvedimmune recon
9、stitution.First,overall thymic cellularity andspleen cellularity significan tly increasedin cotrans-plantationgroupsat day30.Secondly,cotransplan tation improvedim munefunctionalrecovery.Non-specificlymphocytesprolifer-ation reactioninducedby ConAand LPSincreasedin cotransplantation group,andsodid f
10、or allogeneicmixed-lymphocytereac-tion.CONCLUSION:Hematopoietic reconstitutionandimmunereconstitution weresignificantlyenhanced byMSCs cotransplantedwith BM.KEY WORDSMesenchymal stemcells;Bonemarrowtransplantation;Hematopoietic remodeling;Immuneremodeling由于移植相关死亡率及原发疾病复发率的下降,目前造血干细胞移植(hematopoieicst
11、em cell trans-plantation,HSC T)已越来越多地用于恶性血液病(白血病、淋巴瘤等)、恶性肿瘤(如神经母细胞瘤、肺癌#1129#中国病理生理杂志ChineseJournalof Pathophysiology 2006,22(6):1129-1132名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 4 页 -等)及某些遗传病的治疗。尽管造血干细胞移植已取得明显疗效,甚至也是某些疾病的唯一根治方法,但是,即使在造血干细胞成功植入后,致死性感染的发生率依然很高。据McGlave报道 1:在用无关供体而 HLA 匹配的供受者间进行骨髓移植(bone marro w
12、transplantation,BMT)治疗慢性髓系白血病时,有 1/3的患者死于感染。这种威胁生命的致死性感染被证实与骨髓移植后T 细胞,尤其是 CD4+T 细胞难以恢复密切相关。T 细胞重建困难既可导致严重感染,也成为移植后肿瘤复发的主要诱因,已 成为困扰临床的一大难题。最近,有报道骨髓间质干细胞(mesenchymal stemcell,MSC)作为骨髓基质细胞的共同前体细胞,可明显促进造血干细胞的植入、分化 2。此外,还有发现MSC具有特殊的免疫调节效应,对 GVHD 有一定的抑制作用 2-4。但 MSC 对免疫重建的影响还未见系统报道,而这正是临床特别关注的问题。为此,本实验建立大鼠
13、同种异体骨髓移植模型,在此基础上探讨 MSC与 BM 共移植后免疫重建的特点。材料和方法1材料111实验动物中山大学中山医学院实验动物中心提供。112试剂1 常规试剂RPMI-1640、DME M-LG(Gibco-BRL,Grand Isand,NY),MTS/PTS(Promega,USA),丝 裂 霉素、ConA、LPS(Sigma)。o 免疫荧光标记抗体荧光标记小鼠抗大鼠抗体MHC-?-FITC、MHC-FITC、CD86-FITC、CD80-PE、CD29-FITC、CD44-FITC、CD61-FITC、CD11b-FITC、CD71-FITC、CD45-FITC、CD45R-FI
14、TC(Pharmingin,SanDiego,CA)。?分子生物学试剂GenomicDNA purification kit(G$T Biotech)、PCR 引物由上海生物工程有限公司合成、Taq 酶(MBI)。2方法211MSC的分离、扩增及鉴定按本室常规方法操作,收获大鼠股骨骨髓,贴壁培养,经反复换液、弃悬浮细 胞,待 细 胞 传 至第 5 代 时,可 获得 纯 的 骨 髓MSCs。选择 P5-P10 代的细胞,用流式细胞技术分析细胞表面标记并进行成脂、成骨样细胞诱导鉴定。212大鼠 MSC对同种异体骨髓移植后造血重建和免疫重建的影响1 供者大鼠的骨髓细胞制备取6-8 周龄 Fische
15、r344(F344,RT1Al)雄性大鼠,颈椎脱臼处死,无菌条件下取出双侧股骨和腓骨,用注射器吸取RPMI-1640 培养基冲出骨髓腔中细胞,Tris-NH4Cl 溶解红细胞,台盼蓝染色计算细胞活力和数目,细胞活力应为95%以上,调节细胞浓度为1 1011/L。o 受者大鼠预处理、分组受者 大鼠为体重180-200g 的雌性 Wistar(RT1Au)大鼠,移植前 3 d 开始饮用含庆大霉素(320 g/L)和红霉素(250 g/L)的饮用水。移植当天采用60Co C 射线全身照射法进行预处理。照射剂量为815 Gy,剂量率为 017 Gy/min。照射后 6 h 内,经腹股沟静脉移植供体MS
16、C(5106)和或骨髓细胞(018108)。分组如下:A 组(单纯骨髓移植组),每只大鼠移植018 108个骨髓细胞;B 组(BM 与 MSCs共移植组),每只大鼠移植018 108个骨髓细胞+5106个 MSCs;C 组(单纯照射组),预处理后不移植细胞,在股静脉注射等量的NS。每组 10只大鼠,移植后 30 d 取材。?Fischer344大鼠 B M 植入 Wistar大鼠检测在骨髓移植后 30 d,取单纯骨髓移植组与共移植组的外周血,提 取 DNA,PCR 扩 增 Y 染色 体,扩 增产 物进 行115%琼脂糖凝胶电泳检测。引物序列及退火温度如下:SRY 引 物 序 列:P1,5.-A
17、GCAGC TGGGATAT-CAGTGG-3.;P2,5.-TC TGGTTCTTGGAGGACTGG-3.。退火温度为55 e。?大鼠 MSC对同种异体骨髓移植后造血重建和免疫重建的影响(1)观察生存指征。(2)分别于移植后15 d、30 d 断尾采集外周血,用血象分析仪动态检测血象变化。(3)取大鼠胸腺、脾脏、股骨,制备单个核细胞悬液(其中脾细胞悬液制备要求无菌操作),计数。部分脾细胞悬液调整浓度,用于细胞功能检测。(4)移 植大鼠免疫功能检测:ConA、LPS 诱导的 淋巴细胞增殖实验。无菌制备单个核脾细胞悬液,台盼蓝染色确定细胞活力 95%,调节细胞 浓度为4 109cells/L
18、备用。将脾细胞加入96孔板,4 105cells/well,并分别加入ConA(终浓度为5 mg/L),LPS(终浓度为 1 mg/L)进行诱导,培养基终体积为200 LL,37e、5%CO2培养 3 d 后进行MTS/PTS 比色法测定。实验结果以刺激指数表示:刺激组3 孔平均值/对应未刺激组 3 孔平均值。单向混合细胞培养:将预处理后的刺激细胞(用浓度为 25 mg/L 的丝裂霉素,37 e、5%CO2预 处理30 min)和反应细胞共同加入96 孔板,两者终浓度分别为 2 105cells/well、4 105cells/well。每组设3 个复孔。37 e、5%CO2培养 5 d,MT
19、S/PTS比色法测定细胞增殖情况。3统计学处理实验 数据用均数?标准差(x?s)表示,采用SPSS 软件包处理,多组间比较采用方差分析,并绘制Kaplan-Meier 存活曲线。结果1细胞的形态、表型及多向分化潜能5-10 代的 MSC 呈宽大 梭形,旋涡 状生长,1B2分瓶传代,2-3 d 即可见80%融合。细胞表面标志#1130#名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 4 页 -为:MHC-?、MHC-、CD80、CD86、CD11b、CD45均为阴性;CD61、CD71 弱 阳性;CD44 在不同 样品可阳性,也可阴性。一定条件诱导后,细胞可 向成骨、成脂及神经样细
20、胞分化。2MSC 与 BM 共移植对移植后存活率的影响单纯照射组 9 只大鼠在预处理后的第2 周内全部死亡,平均存活时间为(1211?113)d。骨髓病理显示造血衰竭,各组动物的存活情况,见图 1。Fig 1MSCcontransplantation increasedsurvi val.图 1骨髓移植后各组大鼠的生存曲线3MSC 与 BM 联合移植促进造血重建和免疫重建311F344 大鼠 BM 植入 Wistar 大鼠的指征在骨髓移植后 30 d,单纯骨髓移植组与共移植组的外周血均显示 Y 染色体阳性。见图2。312MSC对大鼠同种异体骨髓移植外周血象恢复的促进作用对大鼠外周血的动态观察表
21、明(表 1),单纯骨髓移植组、骨髓与 MSC 共移植组的血红蛋白均恢复较快,+30 d 时即恢复正常。在同一检测时点比较,共移植组的淋巴细胞、血小板数均高于单纯骨髓移植组。+30 d 时,共移植组的血小板已恢复正常。Fig 2SRYgeneexpression in the recipients30daysafterIV injec-tion of 5 106MSCs+01 8108bone marrowcells.M:marker;-:negativecontrol,DNA of femalerats perip heralblood;+:positive control,DNA of ma
22、le rats perip heralblood;1-4:BM transplantationgroup;5-8:cotransplan-tation grouptransplantedwith bonemarrowandMSC.图 2移植鼠 SRY 基因表达313MSC与 BM 共移植促进骨髓细胞数、胸腺细胞数和脾细胞数的恢复移植后30 d,共 移植组骨髓有核细胞数明显高于骨髓单纯移植组,两者分别为(52167?8162)106cells/根股骨、(35138?6116)106cells/根股骨,P 0105;共移植组胸腺细胞总数明显高于单纯骨髓移植组,两组的胸腺细胞总数分别为(5164?0
23、182)108、(3126?0173)108(P 0105),正常为(7116?0179)108;共移植组脾细胞总数也高于单纯骨髓移植组,两组的脾细胞总数分别为(5166?0183)108、(4101?0155)108(P 0105),正常为(7183?1121)108。表 1移植后外 周血象的动态变化Tab1Peripheralblood countsafterallo-BMT(x?s)PeripheralbloodBM groupBM+MSCgroup+15 d(n=10)+30d(n=7)+15 d(n=10)+30 d(n=9)Normalgroup(n=10)Hb(g/L)50.35
24、?9.26127.56?14.0479.03?16.71*135.83?24.30128.67?11.46WBC(109cells/L)1.64?0.315.47?1.112.25?0.51*7.12?1.70*v9.88?1.72Lymph(109cells/L)1.31?0.324.66?1.031.79?0.56*6.05?1.39*v8.41?1.63Plat(109cells/L)35.14?7.84402.50?63.7083.52?19.39*594.33?121.09*676.67?124.87*P 0 1 05 vs the correspondi ng item of B
25、M group at thesametime point;vP 0105 vs normalgroup.314MSC与 BM 共移植有利于免疫功能的恢复丝裂原诱导的淋巴细胞增殖反应与同种混合淋巴细胞反应被用来评价骨髓移植后免疫功能的恢复。移植后 30 d,共移植组的受体脾细胞、单纯骨髓移植组脾细胞分别与供体来源的脾细胞、受 体来源的脾细胞共培养,两组均显示耐受状态。而共移植组的受体脾细胞对 ConA、LPS、第三体来源的脾细胞刺激均显示较对照组更高的刺激率,均 P 0105。见表 2、表 3。这表明共移植组的T、B 淋巴细胞功能均较对照组恢复早。表 2移植后 30 d,大鼠脾 细胞 对 Con
26、A、LPS 诱导 的淋 巴细胞增殖反应Tab2MSC cotransplantation improvedConA and LPSstimulatedproliferationcompared to BM transplantationgroup(x?s)GroupMitotic response of spenocytesTo Con ATo LPSBM(n=7)4.78?1.172.11?0.53B M+MSC(n=9)6.33?1.25*3.22?0.62*N(n=10)7.56?1.365.25?1.23*P 0 1 05 vs BM group.#1131#名师资料总结-精品资料欢迎
27、下载-名师精心整理-第 3 页，共 4 页 -表 3移植后 30d,大鼠同种异体混合淋巴细胞反应Tab 3Alloreactivity of splenocyteson 30 days after transplant(x?s)StimulatorResponder(Wis tar)BM(n=7)B M+MSC(n=9)N(n=10)Splenoc ytes of normalF3441.89?0.41 2.02?0.385.86?1.21Splenoc ytes of normalWistar2.79?0.68 3.13?0.641.16?0.31Splenoc ytes of normal
28、SD4.27?0.92 5.95?1.12*w7.33?1.37*P 0 105 vs BM group;wP 0105 vs N group.讨论在一些免疫缺陷动物模型,如人 造血干细胞绵羊宫内羊胎移植、NOD-SCID 鼠异种移植,MSC已被证实促进造血干细胞移植后造血重建 5,6。为进一步探讨 MSC 对同种异体骨髓移植的影响,本实验通过 F344-Wistar 大鼠的同种异体骨髓移植模型,探讨MSC对同种异体骨髓移植后造血重建和免疫重建的影响。移植后 30 d,受体生存率、外周血象、骨髓有核细胞数均高于单纯骨髓移植组,表明 一定量骨髓细胞与 MSC共移植可明显促进造血恢复。据认为MSC
29、可能通过释放各种细胞因子、表达黏附分子、细胞外基质蛋白等促进造血干细胞的黏附、归巢,并进一步支持其增殖、分化潜能 2。MSC在明显促进同种骨髓移植后造血恢复的同时,对受体免疫功能的恢复也有积极作用。移植后30 d,共移植组胸腺细胞数、脾细胞数均较单纯移植组高。进一步免疫功能检测发现,共移植组对ConA和 LPS刺激的淋巴细胞增殖反应也高于单纯骨髓移植组。两组间受体对供体来源的混合淋巴细胞反应均产生耐受;而共移植组受体对第三体来源的同种混合淋巴细胞反应较单纯BMT 组增强。因此,MSC可从数量和功能多方面促进淋巴细胞的重建。MSC对骨髓移植后免疫重建的促进作用可能与下列因素有关。(1)MSC可能
30、通过降低GVHD 对免疫重建发挥积极作用。MSC可降低 GVHD 的发生率或减轻其严重程度 2-4,8,11。我们在实验中也观察到单纯骨髓移植组均表现出不同程度的GVHD:如体重减轻、腹泻、耳朵红斑和脱毛等;而 MSC与骨髓共移植组未观察到典型的 GVHD 症状。由于GVHD 可选择免疫器官为攻击靶子,导致淋巴器官萎缩或细胞减少;严重干扰 CD4+T 的发育并抑制T、B 淋巴细胞功能。因此,MSC通过降低 GVHD 对 BMT 后免疫重建有积极作用。(2)MSC 是 否通过直 接途 径促进 免疫重 建?一些 相 关 的 报 道 已 表 明:骨 髓 基 质 细 胞 可 借 助CD90、CD62L
31、、CD44、CD117等黏附未成熟胸腺细胞,并支持这些细胞的体外存活、增殖 9;骨片与骨髓移植后,骨髓基质细胞可迁移至胸腺,并参与胸腺细胞的阳性选 择 7。但是 直接 的证 据是 要进一 步探 讨MSC在免疫器官的分布。我们采用PCR 技术曾检测到标记 MSC 在免疫器官的长期存在(本室资料);也有报道 10采用 Real-time PCR技术可检测 MSC在免疫器官及其它脏器的长期定居。目前 MSC 的临床应用依然是审慎的,进一步通过体内实验动态检测MSC 的体内分布,尤其是采用FISH 或免疫组化方法直接检测MSC 在体内的分布;MSC对机体免疫功能的动态影响,将具 有更重要意义,也是我们
32、以后在实验中特别关注的问题。参考文献 1McGlavePB,Shu XO,WenW,et al.Unrelateddonormar-rowtransplantationfor chronic myelogenous leukemia:9 yearsexperience of the nationalmarrowdonorprogramJ.Blood,2000,95(7):2219-2225.2Fibbe WE,Noort WA.Mesenchymal stem cellsandhematopoieticstem cell transplantation J.Ann N Y AcadSci,20
33、03,996:235-244.3Dae-Chul Jeong,Nak-Gyun Chung,Sun-YoungKim.Mesenchymal stem cells might preventlethal GVHD in MHCmismatched murine allogeneicbone marrow transplantation J.Blood,2003,102(11):5369(abs tract).4KatarinaLB,Ida R,Berit S,etal.Treatmentof severeacutegraft-versus-host diseasewith third part
34、y haploidenticalmesenchymal stemcellsJ.Lancet,2004,363(9419):1439-1441.5KruisselbrinkAB,Anker PS,et al.Mesenchymal stem cells.promoteengraftmentof humanumbilical cord blood-derivedCD34(+)cells in NOD/SCID mice J.Exp Hematol,2002,30(8):870-878.6Almeida PG,PoradaCD,TranN,et al.Cotransplan tation ofhum
35、ans tromal cell progenitorsinto preimmunefetal sheepre-sultsin early appearance of human donorcells in circulationandboostscell levelsin bonemarrowat later time pointsaftertransplantation J.Blood,2000,95(11):3620-3627.7Li Y,Hisha H,InabaM,et al.Evidence for migrationofdonorbone marrow stromal cells
36、into recipient thymus afterbonemarrowtransplan tation plusbonegrafts:A role ofstromalcells in positive selectionJ.E xp Hematol,2000,28(8):950-960.8李浩威,温冠媚,肖庆忠,等.供者源性骨髓间充质干细胞对急 性移植物抗宿主病的影响 J.中国病理 生理杂志,2003,19(5):577-580.9BardaS M,Rozenszajn LA,Globerson A,et al.Selectivead-hesionof immaturethymocytes
37、to bonemarrowstromalcells:relevancetoT celllymphopoiesis J.ExpHematol,1996,24(2):386-391.10Devine SM,CobbsC,Jennings M,et al.Mesenchymal stemcells distributeto awiderangeof tissuesfollowingsystemicin-fusioninto nonhumanprimates J.Blood,2003,101(8):2999-3001.11Le BlancK,RingdenO.Immunobiologyof humanmesenchy-mal stemcells andfuture use in hematopoietic stemcell trans-plantationJ.Biol BloodMarrowTransplant,2005,11(5):321-334.#1132#名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 4 页 -