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1、!）包被抗原合成。为了避免载体蛋白对抗原?抗体反应的干扰，必须用与免疫抗原载体蛋白不同的蛋白作包被抗原的载体。因此本试验选用鸡卵清蛋白（A(）作为载体合成包被抗原（)*%!A(），合成方法同)BSA。1971年Ercegovich 等首次采用免疫分析技术对DDT、马拉硫磷以及氨基三唑这3种农药进行残鼹分析，放此舞创了免疫分橇技术在农业、环境领域应用的先河 j。到2005年，世界上近 300种农药中大约有70种以上已经建立了相应的免疫学分析方法珏】。经过几十年的飞速发震，农药免疫分析技零以其检测灵敏度高，样品前处理简单，样品需求量少等优点，成为农药残留仪器检测方法的替代技术，可以有效地检测单种农
2、药污染物旧。J。但是由予传统的免疫检测法遥求抗原一抗体识别的高度特异性，通常1种抗体只能检测单种农药(或其结构类似的代谢物)，难以满足实际检测时一次测定要求对多种农药间时检出的需求，不熊实现农药的多残懿免疫检测，限制了农药免疫分析的应用M 嵋j。为了解决这一问题，需要针对每个靶标物制备不同的抗体，并把这些抗体整合使用在溺一个检测体系中。耨勇一个更加经济的实现途径怒制备一次试验可以同时检测多种靶标物的抗体广谱特异性抗体(Broad s矽e懑e诹懿 ib 藤ies)引。本文将对农药广谱特异性抗体的制备方法，以及有机磷、拟除虫菊酯、氯基甲酸醣三大类农药的广谱特异性抗体制备及免疫多残留分析技术的研究现
3、状进行综述。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 5 页 -1 广谱特异性抗体的制备方法通常建立一种农药的免疫分析技术需要考虑以下几个环节：靶标物、半抗原、免疫原、抗体的类型、特异性、检测形式和标记物0|。建立检测方法的第一步就是要明确检测的靶标物，如是单一物质的特异性检测，还是广谱的族特异性检测。而现代检测技术的发展趋势要求提高检测样品的通量和在一个试验中同时检出多种分析物。这就要求制备具有广谱特异性的抗体，它能与一类化合物相结合，并被应用于广谱特异性的试验。目前广谱特异性抗体的制备，通常采用的途径一般分为 3种：选择一类农药的共性结构制备抗体；制备抗独特型抗体；重组
4、抗体。11利用农药的共性结构作为半抗原制备抗体选择农药的共有结构作为半抗原是目前制备广谱特异性抗体最简便和使用最多的方法。对多种目标物化学结构进行分析寻找出共有结构，并结合分子模型技术辅助设计出共性结构半抗原，用于制备针对一类结构的广谱特异性抗体。由于农药等小分子物质通常都是分子量较小的物质(一般小于1 000)，因此要肌体对该物质获得免疫应答，就需要将其与载体分子(通常是蛋白)连接成为免疫原。在设计这些用于免疫原制备的半抗原的时候也必须考虑到连接位点交联在蛋白上时不会使其一些特征结构受到影响?叫引。混合酸酐法制备包被抗原：称54嘲半抗原(约18 ttm01)溶于 200 ttL 无水DMF
5、中，然后按顺序加入427 ttL(约18 ttm01)三正丁胺和 234 L(约 18 ttm01)氯甲酸异丁酯，室温下搅拌反应1 h将30 IIlg OVA 溶于2 mL碳酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢滴加100 ttL 上一步反应液，室温下搅拌反应3 h，然后透析，离心，冷冻干燥，4保存精确测量透析后溶液的体积，计算最终的P(BFNH BSA)为12 ms mE，p(BFNHOVA)为80 msmE，以最后一次的透析外液作空白，分别对BFNH 溶液，BSA 溶液，OVA 溶液，BFNH BSA 溶液，BFNH OVA 溶液进行紫外扫描，根据扫描图谱确定是否发生了偶联，红外光谱仪进步鉴定偶联物阻
6、lo】对透析结束后的样品冷冻(4)干燥，上清液冷冻保存估算半抗原与载体蛋白结合的结合比的公式：结合比=(E2110(B 嗍一略)一E：280BSA)，e瑚B州H(e=Abc其中，A为吸光值；b 为比色杯直径；c 为样品摩尔浓度)名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 5 页 -124抗血清效价测定设置包被抗原质量浓度梯度为4，2，1，05，025 和0125弘grIIL，方阵试验选择抗原抗体最适工作浓度，采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定效价“12具体步骤如下：1241包被将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100弘L，孔，4放置48 h1242封闭洗涤液冲洗
7、ELISA板3次，加封闭液，200“U孔，37 oC，1 h1243待检样本洗板3次，加入梯度稀释的待测血清样品和阴性对照，100“L，孔，37，1 h1244加酶标抗体洗板3次，加入准确稀释的酶标抗体，100 肛U孔，37，1 h1245加底物显色洗板3次，加入底物 TMB，100 pu孔，室温或 37 显色 1530 min1246酶标仪测定 A。砷值在A伽值为10左右，抗体抗原用量较少，即为抗体抗原的工作浓度在效价测定时，若待测孔A值大于或等于阴性对照的21倍，即为阳性效价126制作呋喃丹标准曲线用PBS(pH 74)将呋喃丹标准品稀释成系列质量浓度梯度(10一一1 mgmL)，设空白和
8、对照组，将获得的最佳抗原、抗体工作浓度进行间接竞争ELISA具体步骤如下：包被；封闭；加入待测标准农药或检测样品(50 皿)；加入一抗；加酶标抗体；加底物显色；酶标仪测定测得相应的一系列 A。蚰值，计算不同浓度呋喃丹和抗体结合对包被抗原和抗体结合产生的竞争抑制率(，)，=(A对照一 A测样品)(A对甩一 A空白)10021以，为纵坐标，以 P(呋喃丹)为横坐标，绘制标准曲线L28茭头样品中呋喃丹含量的测定从蔬菜出口基地随机采取茭头样品50份，每份样品取茭头一瓣称取质量，放入容器中加入5倍的PBS 捣碎，静置澄清后将上清液用分液漏斗过滤，再用5倍的PBS 洗涤残渣，同一分液漏斗过滤，收集上清液于
9、锥形瓶中，用 PBS 将溶液调至 01 gmL，作为检测样品每个样品采用间接竞争法进行测定名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 5 页 -(步骤见126节)，同时设定 8个平行检测，上样量为50弘L，测定样品的吸光值，由平均吸光值计算抑制率，再利用标准曲线计算呋喃丹残留浓度21 BFNH 与蛋白偶联鉴定对BFNH，BSA 和BFNH BSA 稀释适当倍数后进行紫外扫描，结果见图2从图 2可以看出。BSA 在 2735 nln 处有最大吸收峰，BFNH 在 2703 am处有最大吸收峰，而 BFNH BSA 的最大吸收峰为2719 llm，相对 BSA 来说，发生了偏移，
10、由于紫外吸收具有叠加效应，其人工抗原紫外吸收的位置及峰形都发生了相应的改变，计算表明，偶联反应后抗原的摩尔吸光系数明显增加，由此说明人工抗原的偶联成功引经计算得 BFNH 与BSA 偶联率为 18：1，而包被抗原 BFNH OVA 偶联率为 5：1围2合成抗原的紫外扫描光谱Fig 2 Ultraviolet absorption spectrum of the BFNH BSA，NFNH and BSA 22最佳工作浓度筛选和抗体效价测定方阵滴定结果表明，当 A伽在10左右时，包被抗原质量浓度为 025肛gmL，一抗稀释 1：16105 倍，羊抗兔 IsGHRP 稀释1：10+倍，以此作为该实
11、验抗原抗体的最佳工作浓度当包被抗原(BFNH OVA)质量浓度为 025zgmL 时，兔 I，兔和兔所产生的抗血清效价分别为64105，128106和64105兔抗血清经过纯化后，其效价达到512 x 106纯化产物经 10SDS PAGE 电泳，结果见图3图3中呈现两条带，分子量分别约为55和22 ku，与抗体的重、轻链分子量大小一致23呋喃丹标准曲线及线性分析在优化条件下进行间接竞争ELISA，不同P(呋喃丹)的A。值测定结果见表 1以抑制率(，)对|D(呋喃丹)作图(见图4)，并利用数据处理软件Origin7 5进行回归分析，得到 jD(呋喃丹)的标准曲线从表 1可知，P(呋喃丹)对抗原抗体免疫反应有竞争性抑制作用，反应体系中游离的呋喃丹分子越多，对包被抗原与抗体的竞争抑制作用就越大从图4可知，P(呋喃丹)在10一001 mgmL 范围内，Y=2713+354善。R=0 997 1，线性关系显著，最低检测限为 10ms mL 24抗体特异性检测5种化学结构与呋喃丹相似的氨基甲酸酯类农药标名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 5 页 -名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页，共 5 页 -