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1、 纳米通道电化学单分子分析检测酶分子 青岛科技大学研宄生学位论文 纳米通道电化学单分子分析检测酶分子 摘要 单分子检测技术在分析领域的应用十分的广泛，本文主要是应用单分子检测 技术研宄酶的活性。本文的研宄是基于溶 血素纳米孔道的单分子电化学检测来讨 论限制性核酸内切酶和凝血酶的活性。以溶血素通道为基础，将膜片钳放大技术 与电化学检测技术相结合，实现限制性核酸内切酶和凝血酶单分子的检测及传感 分析。利用核酸内切酶对特定位点的限制性内切以及凝血酶与凝血酶适体亲和作 用的原理，设计了不同的特定的 DNA链，通过观察分析限制性核酸内切酶或凝 血酶作用于 dsDNA后， DNA通过纳米孔道时的微电流变化
2、，从而达到研究限制 性核酸内切酶和凝血酶活性的目的。本论文共分为五章： 第一章，概述了纳米通道、核酸内切酶以及纳米粒子的简介及作用并 简单介 绍了单分子检测技术、凝胶电泳技术以及膜片钳放大检测技术等分析方法。着重 对单分子检测技术和纳米通道进行了说明，对单分子检测技术的前景做了介绍。 第二章，采用单分子电化学检测初步研究了 DNA测序工作，主要研究了 限制性内切酶的活性。通过用溶血素和卵磷脂的自由组装形成生物纳米孔 道，利用溶血素孔径的特性来控制单链 DNA和双链 DNA通过孔径时不同的 电流下降，来初步对 DNA测序工作进行了解。在限制性内切酶的作用下双 链 DNA能顺利的通过纳米孔道，通过
3、对比限制性内切酶作用前后电流的变 化进而对限制性内切酶 的活性进行研究。 第三章，通过凝胶电泳技术和纳米金标记 DNA在 TEM下的图像来研究限制 性核酸内切酶的活性，以及错配碱基 T与 T在 Hg条件下能形成 T-Hg-T的稳定 存在。首先通过限制性内切酶作用前后的 DNA在凝胶电泳下进行分离，观察分 离的情况来研究限制性内切酶的，其次当 DNA被纳米金修饰后，观察在限制性 内切酶作用前后， DNA上修饰的纳米金在 TEM表征下的不同来研究限制性内切 酶的活性。同时在以上的实验中剪切位点有错配碱基 T与 T的时候，限制性内切 酶不能作用，只有当在 Hg条件下，形成 T-Hg-T的稳定结构后，
4、限制性内切酶 才能发生作用。 第四章，通过溶血素纳米孔道研究凝血酶单分子的活性。通过用溶血素和卵 磷脂的自由组装形成生物纳米孔道，利用溶血素孔径的特性来控制单链 DNA和 双链 DNA通过孔径时不同的电流下降。研宄了凝血酶与是凝血酶适体的亲和作 用，当凝血酶作用下的 ssDNA才能顺利的通过溶血素纳米孔道，同时也研究了颈 I 纳米通道电化学单分子分析检测酶分子 环结构的解链时间与电压的关系。利用核酸适体实现单个酶分子的检测，对单个 酶分子的实时生物化学反应和酶催化动力学进行研究，研宄单个酶分子在许多非 特异性结合位点中如何找到特异性位点，为解决生命科学中的重大问题提供理论 依据。 第五章，结论
5、部分，对全文内容进行了总结。 关键词： 核酸内切酶；凝血酶；单分子检测；溶血素；纳米通道 青岛科技大学研究生学位论文 ELECTROCHEEMICAL DETECTIONG OF SINGLE ENZYME MOLECULES BASED ON NANOCHANNEL ABSTRACT The technology of single molecule detection is widely applied in the field of analysis, this paper mainly researchs the activity of enzyme by the technology
6、 of single molecule detection. The research of this paper is based on the single molecular electrochemical detection of hemolysin nanopores to discuss the activity of restriction endonuclease and thrombin. Using the principle of endonuclease restriction of a specific site and the affinity iunction o
7、f thrombin and thrombin aptamer, the different specific DNA chains are designed, when restriction endonuclease or thrombin acts on the dsDNA， the microelectric current when DNA throughing nanopores will bedifferent, so as to achieve the purpose of researching the activity of restriction endonuclease
8、 and thrombin This thesis is divided into five chapters: The first chapter, this paper summarizes the introduction and function of nanochannel, endonuclease and nanoparticles of and simply introduces the analytical method of single molecule detection, microgel electrophoresiss and the patch clamp an
9、plifier detection. This paper especially illustrates the single molecule detection and nanochannel, at the same time the prospects of the single nwlecule detection is presented. The second chapter, the single molecule detection is used to preliminary study the DNA sequencing and mainly study the act
10、ivity ofrestriction enzymes. Using the characteristics of hemolysin aperture to control the different current when the single-strand DNA and double-stranded DNA through the pore, this paper preliminary understands the DNA sequence by using the biological nanopores of hemolysin and lecithin free asse
11、mbed. Under the action of restriction enzymes, the double-wStranded DNA can smoothly through the nanopore. By corrparing the current change before and after restriction enzymes function the restriction enzyme?s activity is studied. The third chapter, by microgel electrophoresiss technology and the t
12、he TEM images of DNA tagged by AuNPs, the restrictive endonuclease5s activity is studied, as well as the mismatch base T and T can stably exist under the condition of Firstly I 纳米通道电化学单分子分析检测酶分子 studing the activity of the restriction enzyme by observing the separation, which is the DNA under the mi
13、crogel electrophoresiss before and afte the restriction enzymes action. Secondly after the DNA is tagged by AuNPs, studing the activity of the restriction enzyme by observing nanoparticless different characters in TEM. At the same time in the above experiments, which have mismatch base T and T the r
14、estriction enzymes can not act on the DNA. Only when under the condition of Hg2+, formed the stable structure of T-Hg-T, the restriction enzymes can work. The fourth chapter, through the hemolysin nanopores, the activity of thrombin molecule is studied. Using the characteristics of hemolysin apertur
15、e to control the different current when the single-strand DNA and double-stranded DNA through the pore, this paper preliminary understands the DNA sequence by using the biological nanopores of hemolysin and lecithin free assembed. This paper researchs the affinity of thrombin and thrombin aptamer. W
16、hen under the action of thrombin, the ssDNA can smoothly through the hemolysin nanopores. At the same time, the time of melting the chains of neckring structure is relevant to the voltage. The fifth chapter, it was summarized for the whole thesis. KEY WORDS: Endonuclease; Thrombin； Single molecule d
17、etection; Hemolysin; Nanochannel 青岛科技大学研宄生学位论文 目录 第一章绪论 . 1 1麟通道 . . 1 1.1自然态的通道 . 1 1.1.1生物膜离子通道 . 1 1丄 2溶血素跨磷脂双层细胞膜形成的离子通道 . 1 1.2人工合成的通道 . 2 2核酸内切酶 . 3 2.1核酸内切酶简介 . 3 2.2核酸内切酶的分类 . 3 2.3限制性核酸内切酶作用 . 3 2.4限制性内切酶的性质及应用 . 4 3 单分子检测 （ single molecules detection， SMD) . 5 3.1 DNA 简介 . 5 3.1.1 DNA 的成分
18、. 5 3.1.2DNA的空间结构 . 5 3.1.3 DNA的稳定性 . 6 3.2适 本 . 7 3.2.1适体简介 . 7 3.2.2适体的特点 . 7 3.3单分子检测的分类 . 8 3.3.1光谱分析法 . 8 3.3.2电化学检测法 . 8 3.3.3生物动力学工具法 . 9 3.3.4单分子检测的应用前景 . 9 4纳米粒子 . 11 4.1纳米粒子简介 . 11 4.1.1纳米粒子的性质 . 11 I _纳米通道电化学单分子分析检测酶分子 _ 4.2纳米金粒子 . 12 4.3二氧化铈纳米粒子 . 13 5凝胶电泳分析 . 15 5.1 _嫌介 . 15 5.1.1电泳技术与应
19、用 . 15 5.1.2聚丙烯酰胺凝胶电泳 . 15 6膜片钳放大检测技术 . 17 6.1膜片钳技术简介 . 17 6.2 4压钳位 . 17 6.3单通道电流记录 . 17 7立题依据和研究内容 . 18 第二章基于溶血素纳米孔道检测 Nb.BbvCI内切酶单分子 . 19 1 Its . 19 2实验部分 . 20 2.1试剂与仪器 . 20 2.1.1主要试剂 . 20 2.1.2仪器装置 . 20 2.2 &验方 & . 21 2.2.1 DNA储备液及缓冲溶液 . 21 2.2.2样品的制备 . 21 2.2.3卵鱗脂的处理 . 21 2.2.4仪器操作 . 21 2.2.5制备磷
20、脂双分子层膜 . 21 2.2.6在磷脂双分子层膜上形成纳米孔道 . 22 2.2.7检测 PI、 P2、 P3通过纳米孔道时的电流信号 . 23 3结果与讨论 . 24 3.1魏醜 . 24 3.2 $验过程 . 26 3.2.1检测 P1穿过纳米孔道时的电流变化 . 26 _ 青岛科技大学研宄生学位论文 _ 3.2.2检测 P2穿过纳米孔道时的电流变化 . 28 3.2.3检测 P3穿过纳米孔道时的电流变化 . 29 3.3讨论 PI、 P2、 P3穿过纳米 ?L道时的电流脉冲 . 30 4 /J、 . 33 第三 章基于纳米金胶标记 DNA的电化 学检测 . 34 1 tiTs . 34
21、 2麵部分 . 35 2.1试剂与仪器 . 35 2.1.1主要试剂 . 35 2.1.2仪器装置 . 35 2.2实验方法 . 36 2.2.1纳米金胶的制备 . 36 2.2.3凝胶电泳样品的制备 . 36 2.2.4透射电子显微镜分析 （ TEM)的样品的制备 . 36 2.2.4.1巯基 DNA的前处理与修饰 . 36 2.2A2制备 TEM的样品 . 37 3结果与讨论 . 38 3.1魏廳 . 38 3.2利用凝胶电泳分离 DNA. 38 3.2.1 制胶 . 38 3.2.1.1 制备 30%凝胶 . 38 3.2.1.2 制得 50 xTAE 缓冲液 . 38 3.2.1.3固
22、定凝胶 . 38 3.2.2凝胶电泳分离 DNA. 39 3.3利用 TEM表征反应前后的溶液 . 41 3.3.1纳米金溶液 TEM表征 . 41 3.3.2 Gl、 G2 的 TEM 表征 . 42 3.3.3 G3、 G4 的 TEM 表征 . 43 3.3.4 G5、 G6 的 TEM 表征 . 44 4 /J、 . 47 III _ 纳米通道电化学单分子分析检测酶分子 _ 第四章基于溶血素纳米孔道检测凝血酶单分子 . 48 1 Ms . 48 2实验部分 . 49 2.1试剂城 . 49 2.1.1主要试剂 . 49 2.1.2仪器装置 . 49 2.2 $验方法 . 50 2.2.
23、1 DNA储备液及缓冲溶液 . 50 2.2.2样品的制备 . 50 2.2.3卵憐脂的处理 . 50 2.2.4仪器操作 . 50 2.2.5制备磷脂双分子层膜 . 50 2.2.6在磷脂双分子层膜上形成纳米孔道 . 51 2.3 实验 . 51 2.4检测颈环结构 S1穿过溶血素孔道的电流信号 . 52 2.5检测凝血酶加入前后杂交颈环 DNA穿过溶血素孔道的电流信号 . 54 2.6讨论 Gl、 G2、 G3穿过纳米孔道时的电流脉冲 . 55 3 /J、 . 59 第五章结论 . 60 参考文献 . 61 至文谢 . 65 附录：攻读硕士学位期间己发表和待发表的学术论文目录 . 66 独
24、创性声明 . 67 IV 青岛科技大学研宄生学位论文 第一章绪论 1纳米通道 纳米孔一般定义为内径为 1 100 nm的微孔，若孔的深度远大于孔径，就称 之为纳米孔道，一般孔径应大于洞孔深度，或者处于同一量级。纳米通道根据其 形成方式可以分为自然态的通道以及人工合成的通道。 1.1自然态的通道 1.1.1生物膜离子通道 离子通道依据其活化的方式不同，可分两类：一类是电压活化的通道，即通 道的开放受膜电位的控制，如 Na+、 Ca+、 CT和一些类型的 K+通道；另一类是化 学物活化的通道，即靠化学物与膜上受体相互作用而活化的通道，如 Ach受体通 道、氨基酸受体通道、 Ca+活化的 K+通道等
25、。 活体细胞不停地进行新陈代谢活动，就必须不断地与周围环境进行物质交 换，而细胞膜上的离子通道就是这种物质交换的重要途径 .人们已经知道，大多数 对生命具有重要意义的物质都是水溶性的，如各种离子，糖类等，它们需要进入 细胞，而生命活动中产生的水溶性废 物也要离开细胞，它们出入的通道就是细胞 膜上的离子通道。生物膜离子通道是各种无机离子跨膜被动运输的通路。生物膜 对无机离子的跨膜运输主要有被动运输和主动运输两种方式。被动运输的通路称 离子通道，主动运输的离子载体称为离子栗。生物膜对离子的通透性与多种生命 活动过程密切相关。例如，感受器电位的发生，神经兴奋与传导和中枢神经系统 的调控功能，心脏搏动
26、，平滑肌蠕动，骨骼肌收缩，激素分泌，光合作用和氧化 磷酸化过程中跨膜质子梯度的形成等。 1.1.2溶血素跨碟脂双层细胞膜形成的离子通道 溶血素可以与磷脂双子层自组装形成自然态的生物纳米孔道。溶血素的内部 孔道是刚性的，它可以使得小型的离子和带电的分子通过，对于大分子物质是不 能通过的，因此以溶血素纳米孔为基础的生物膜在电化学检测池中可以降电化学 检测池分割成由微孔相连的两个部分。在一定的电压下带电的离子或带电微型分 子可以定向地从通道内通过。不同的电压下，孔道内的电流是不一样的，当 DNA 或者 RNA分子穿过时会产生下降电流，同时会有下降的脉冲，脉冲的宽度与链 1 纳米通道电化学单分子分析检
27、测酶分子 的长短 成正比的，而且通过纳米孔道时，脉冲的数量、时间等与组成 DNA或 RNA 的碱基数量有关。生物大分子在外界压力下穿过由玻璃等绝缘材料制作的纳米孔 或生物纳米孔时会导致通过小孔离子流的阻塞，小孔电导率的瞬时变化反应了这 个过程，电流的减低量反映粒子的体积大小，而电流变化的次数则反映生物大分 子的数目。 1.2人工合成的通道 尽管溶血素孔能够满足生物大分子的研究，但是由于其自身性质的原因注定 其本身的不稳定性，使得形成的纳米孔道同样寿命比较短而且自身的孔径的控制 比较局限，这就促使人们对新一类的纳米孔道的探索 1。固态纳米孔道具有孔径 稳定，物理性能良好等优势。常用的固态纳米孔道
28、是应用 Si3N4晶体膜。制造固 态纳米孔道的技术里最常见的是聚焦粒子束技术，它专门应用于光刻掩模版修补 和集成电路修饰。人工合成的纳米通道还有碳纳米管、聚合膜通道、 A1203膜通 道，其中碳纳米管通道在目前应用比较广泛，碳纳米管的研究主要是基于石墨烯 的研宄，目前对于石墨烯的研宂越来越多，在各个领域都有相关的报道，因此人 工制造的碳纳米管纳米通道成了现在单分子检测的热点。 2 2核酸内切酶 青岛科技大学研 宄生学位论文 2.1核酸内切酶简介 内切酶，即限制性核酸内切酶，亦称限制性核酸酶。它是一种能催化多核苷 酸的链断裂的酶，只对脱氧核糖核酸内一定碱基序列中特定位置发生作用，把这 位置的链切
29、开。通过内切酶可以把某一个遗传基因片段剪切下来，若再连接在别 的生物细胞的遗传基因上，便可使这生物细胞具有新的遗传特性。 当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以 NEB为代表 的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了某些病毒以外，限制性内切酶只 在原核生物中被发现。现在人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新 的限制 性内切酶。而对己测序的原核基因组数据分析表明，限制性内切酶在原核生物中 普遍存在，所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。 限制性酶的功能是在 DNA分子的内部拆卸水解，甲基化酶作用是修饰， DNA 分子经修饰后，就可逃避限制性酶的识别，从而避免了限
30、制性酶对自身 DNA的 破坏。 2.2核酸内切酶的分类 核酸内切酶主要分为三类： 内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点 附近的一些核苷酸上切割 DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一 性，是随机的； 内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置 上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总 能得到同样核苷酸顺序的 DNA片段，并能构建来自不同基因组的 DNA片段，形 成杂合 DNA分子； 内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它 在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任 意的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA片段，具有各种单 链末端。 2.3