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1、分类号： U D C ： 密级： 学号： 405604611027 南 昌 大 学 硕 士 研 究 生 学位论文 基于固态纳米孔的蛋白质 BSA 单分子检测及红曲菌中桔霉 素和 Monacolin K 合成基因的研究 BSA protein molecule detection based on solid-state nanopores and the research of synthetic gene about citrinin and Monacolin K in Monascus spp. 唐梦醒 培养单位（院、系 ）： 生命科学与食品工程学院 指导教师姓名、职称：李燕萍副教授 申
2、请学位的学科门类：理学 学科专业名称：微生物学 论文答辩日期： 2014.5.30 答辩委员会主席 : 评阅人： 年月曰 一、 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得 南昌大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者签名（手写 ）： 签字日期： 年月日 二、学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文
3、的规定，同意学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限 公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社 将本学位论文收录到中国学位论文全文数 据库和中国优秀博硕士学位论文全文数据库中全文发表，并通过网络向社会公众 提供信息服务，同意按 “ 章程 ” 规定享受相关权益。 学位论文作者签名（手写 ）： 导师签名（手写 ）： 签字日期： 年月日 签字日期： 年月日 论文题目 姓 名 学号 论 文 级 别 博 士
4、 口 硕 士 口 院 /系 /所 专业 联系电话 E m ail 通信地址 (邮编 )： 备注： 公开 保密（向校学位办申请获批准为 “ 保密 ” ， _ 年 _月后公开 ) 摘要 纳米孔作为高灵敏传感领域最有潜力的方法之一，引起了科学家们的广泛 关注，因此固态纳米孔传感就成为单分子检测与分析通用的方法，它除了被用 于 DNA 的检测外，纳米孔检测技术还被应用于更多种类生物大分子样品如蛋白 质分子及纳米颗粒的检测。纳米孔是在薄膜上制备或组装的，尺寸一般在 HT1 1 2 纳米量级之间。在处于电解液溶液下的纳米孔薄膜两侧施加偏置电压时，带电 颗粒就在电场力作用下穿过该纳米孔。带电样品穿过纳米孔通
5、道的这个过程， 被称为易位。易位行为将引起离子电流的瞬间变化，表现为短时的尖峰。每个 尖峰对应一个易 位事件。通过对电流变化及易位时间的分析可用于颗粒大小， 表面性质及运动行为的表征。 红曲菌是一种重要的丝状真菌，能够产生具有生物活性的产物，可以用作 食品添加剂和降血脂的药物，但同时又能产生对人类有害的結霉素，因此控制 結霉素的含量是红曲菌研宄中的重中之重。本文就是利用基因敲除方法对桔霉 素合成途径及其相关基因进行研宄，为了解红曲菌中桔霉素的代谢途径提供参 考。 本论文主要包括两大部分内容，第一部分以牛血清白蛋白 (BSA)和金纳米棒 (AuNPs)为样品，通过对其易位行为的研宄，为纳米孔传感
6、器在蛋白质方面的 研究提供实验方法和数据分析方面的支持和参考。第二部分是以实验室现存的 34 株红曲菌为材料，用 PCR扩增方法分别对桔霉素与 Monacolin K 合成相关基因 进行扩增，最后对基因缺失菌株进行验证及用 HPLC 方法检测菌株次级代谢 产物桔霉素和色素的含量，为红曲菌种以后的研究提供了参考。主要内容如下 : 第一部分： 1. 使用氮化硅材料纳米孔芯片，初步研宄了 BSA 和金纳米棒的易位行为。建立 了使用纳米孔检测蛋白质生物分子样品和纳米颗粒样品的方法。 2. 对蛋白质分子及纳米颗粒的易位信号进行统计与分析。建立了分子易位运动 模型，根据实际易位实验条件参数计算所得的结果与
7、实验统计结果吻合，实现 了分子真实易位事件的分析。根据实验中所得易位信号，总结了常见的易位信 号类型。 I 3. 根据实验结果对固态纳米孔周围及孔内电场进行了模拟，得到同一纳米孔在不 同电压下电场强度的比较。电压越大，分布在孔周围的电场越强，分子易位的 速度就越快，易位的分子就越多。 本部分旨在探宄氮化硅纳米孔在蛋白质检测中的应用，为后续纳米孔传感 器在蛋白质的研宄提供实验和理论基础。 第二部分： 1. 对 34 株红曲菌进行活化，提取活化菌株的基因组 DNA， 以此为模板，设计出 扩增引物，进行桔霉素合成相关基因的扩增及 Monacolm K 合成相关基因的扩 增，并对Monacolin K
8、 合成基因 wo/tS 和调节基因 OTO 好 /进行打点杂交的验证。 2. 根据核糖体 RNA的大亚基 (LSU)的 M)2区域的基因序列，利用 Oligo软件进 行引物设计，对 34 株红曲菌基因组 DNA 进行 PCR 扩增，随后对扩增产物进行 测序，得到只有菌种 5 和菌种 6 在约 71bp 位置处的一个碱基 A 与其他菌种在此 位置的 G不同，此结果与对桔霉素合成相关基 因的扩增结果可以表明菌种 5 和 菌种 6 属于红色红曲菌。 3. 对转入了 基因的打靶载体的转化子进行筛选验证获得基因缺失株， 并对原始菌株 As3.4384和缺失株的次级代谢产物桔霉素及红曲色素的含量进行 测定
9、比较，发现缺失菌株結霉素产量较出发菌株降低约 34%;红曲色素的 产量比出发菌株降低约 72%,从而验证 c 加 F 基因与桔霉素和红曲色素的合成相 关。 本课题旨在对红曲菌在分子方面进行研宄，为后续进一步对红曲菌种的分子分 型研究提供实验基础。 关键词：固态纳米孔； BSA;信号检测；红曲菌；基因敲除；桔霉素 ； HPLC ABSTRACT Nanopore widely attracted scientists attention as one of the most potential methods in the highly sensitive sensor field, so th
10、e solid-state nanopore sensor has become the general method in the detection and analysis of the single molecules.Except using in DNA detection, the nanopore technology has been applied in diverse biological macromolecular samples such as protein molecules and nanoparticles.Nanopore is prepared and
11、assembled on the thin film, which size is approximatelylO1 102 nm. In electrolyte solution and the applied bias voltage on the both sides of the pore film, the charged particles would go through the nanopore under the effect of electric field force. This process of the charged samples going through
12、the nanopore channel called translocation. Translocation behavior will cause the instantaneous ion current changes, which are characterized as short-term spikes. Each peak corresponds to a translocation event. Through the analysis of the current change and translocation time, we can analyze the part
13、icle size, surface properties and their motor behaviors. Monascus is a kind of important filamentous fungi, which can produce bioactive substances. It can be used as a food additive and some cholesterol-lowering drugs, but at the same time the strains can produce citrinin, it is harmful to the human
14、, therefore controlling the content of citrinin is the key of the research on Monascus. This article is using the gene knockout technology to study the citrinin synthesis related genes, which provides the reference to understand metabolic pathways of citrinin in Monascus. This topic mainly includes
15、two parts. The first part is using bovine serum albumin (BSA) and gold nanorods (AuNPs) as samples to research the their translocation and data analysis for nanopore sensor in protein research.The second part is using PCR amplification and hybridization method based on laboratory existing 34 Monascu
16、s strains to conduct the citrinin and Monacolin K synthesis related gene, finally we verified ctnF gene disruption mutants in Monascus spp As3.4384 and use HPLC method to detect the secondary metabolites citrinin HI content,which provides reference for the research about monascus strains. The main c
17、ontents are as follows: The first part: 1. We used the silicon nitride nanopores chips to preliminary to study the translocation behavior of the BSA and gold nanorods. Finally we successfully established the method using the nanopores to detect protein samples and nanoparticles. 2. We carried out th
18、e statistics and analysisthe for the translocation signals of protein molecules and nanoparticles. We established the molecular translocation motion model and calculated the results according to the actual translocation experiment condition parameters, which were in accordance with the experimental
19、results, eventually realizing the molecular real translocation events analysis. According to the translocation signals from the experiment, we summarized the common type of translocation signals. 3. According to the experimental results, we simulated the electric field of the inner and around of the
20、 solid-state nanopores to get the comparison of the electric field intensity about the same nanopores under different voltage. The bigger was the voltage, the stronger was the electric field distribution around the pore.The faster were the molecules moving, the more were the molecular translocation.
21、 This topic aims to explore the silicon nitride nanopore application in protein detection, which provides experimental and theoretical basis for subsequent nanopores sensing in protein research. The second part: 1. We activated the laboratory existing 34 Monascus strains, extracted genome DNA as tem
22、plates and designed the amplification primers to conduct the citrinin synthesis related genes and the Monacolin K synthesis related gene, and verified the synthetic genetic mokB and regulate gene mokH of Monacolin K by DNA dot hybridization. 2. According to the large subunit ribosomal RNA (LSU) D1/D
23、2 area, we used the oligo software to design primers for PCR amplification, then to sequencing the amplification products. We got that the A base in about 71bp location of strain 5 and IV strain6 diflferent with the G base of other species in this position. The result and the amplification results a
24、bout citrinin synthesis related genes that indicate strain 5 and strain 6 belong to red Monascus. 3. To verify the gene disruption mutants about transformants which have been transfered ctnF gene targeting vector, and compare the secondary metabolites of citrinin and monascus pigment between the ori
25、ginal strain As3.4384 and gene disruption mutants, we found the content of citrinin in ctnF gene disruption mutants is lower about 34 % than the original strain; The production of monascus pigment reduce 72 %, so we could confirm ctnF gene is associated with the synthesis of monascus pigment and cit
26、rinin. This topic aims to research the existing monascus strains in molecules, which provides the experimental basis for subsequent further molecules studies about monascus strains. Key words:solid-state nanopores; BSA; signal &QtQ Xion Monascus strains; gene knockout; citrinin; HPLC v Abbreviations
27、+J 缩略语 （ Abbreviations) 缩略语 英文名 中文名 AuNRs Gold Nanorods 金纳米棒 PECVD Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition 等离子体增强化学汽相沉积 RIE Reactive Ion Etching 反应离子刻蚀 OD optical density 光密度 Be Degree Baume 波美度 DNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 bp Base Pair 碱基对 Kb Kilobase pairs 千碱基对 dNTP Deoxynucleoside triphosph
28、ate 脱氧核苷三磷酸 HPLC High performance liquid chromatography 高效液相色谱 hph hygromycin B resistant gene 潮霉素 B 抗性基因 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 PEG Polyethylene Glycol 聚乙二醇 PKS Polyketide Synthase 聚酮合酶 Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane 三轻甲基氨基甲烧 MES Ma
29、lt solid medium 麦芽汁固体培养基 VI 目录 . I ABSTRACT . Ill 缩略语 (Abbreviations) . VI 第一部分基于固态纳米孔的蛋白质 BSA 单分子检测 第 1 章 综 述 . 1 1.1 引言 . 1 1.2 纳米孔检测技术的基本原理 . 1 1.3 纳米孔的分类 . 2 1.3.1 生物纳米孔 . 3 1.3.2 固态纳米孔 . 3 1.3.3 混合纳米孔 . 5 1.4 固态纳米孔的制备 . 5 1.4.1 FIB 制备 . 6 1.4.2 固态纳米孔的表征及磨破的分析 . 7 1.5 纳米孔在分子检测和诊断学中的应用 . 7 1.5.1
30、基于纳米孔的 DNA 及病毒颗粒的检测 . 7 1.5.2 基于纳米孔的蛋白质的检测 . 8 1.6 纳米孔对蛋白质检测的研宄意义及前景 . 9 1.7 本课题研宄内容及技术路线 . 10 1.7.1 研宄巨标 . 10 1.7.2 第一部分研宄内容 . 10 1.7.3 技术路线 . 10 第 2 章固态纳米孔检测蛋白质 BSA . 11 2.1 弓丨胃 . 11 2.2 实验材料 . 11 VII 2.3 实验设备 . 12 2.4 实验步骤 . 12 2.5 蛋白质检测的结果与分析 . 15 2.5.1 蛋白质 BSA 粒径的检测及其同源建模 . 15 2.5.2 易位事件的定义 . 1
31、5 2.5.3 易位信号的统计分析 . 16 2.5.4 蛋白质 BSA 与尿素 （ Urea)相互作用的荧光光谱的分析 .18 2.5.5 经尿素变性后蛋白质 BSA 的固态纳米孔检测结果的分析 .19 2.6 讨论 . 20 2.6.1 芯片完整性对固态纳米孔检测实验的影响 . 20 2.6.2 蛋白质 BSA 分子在纳米孔中易位的运动状态的分析 . 21 2.7 本章小结 . 22 第 3 章固态纳米孔检测金纳米棒 . 23 3.1 引言 . 23 3.2 实验材料与设备 . 23 3.3 实验步骤 . 23 3.4 金纳米棒易位结果与分析 . 23 3.4.1 固态纳米孔芯片和金纳米棒
32、的表征 . 23 3.4.2 金纳米棒易位事件的分类 . 24 3.4.3 金纳米棒在不同电压下的易位事件的统计分析 . 26 3.5 纳米孔周围及孔内电场的模拟 . 28 3.5.1 Comsol 模拟软件的建模方法 . 28 3.5.2 同一孔径不同电压下的电场模拟 . 29 3.6 讨论 . 30 3.6.1 固态纳米孔孔径大小的选择 . 30 3.6.2 KC1 电解液浓度对检测样品的影响 . 31 3.6.3 外加电压的选择对纳米孔检测实验的影响 . 31 3.7 本章小结 . 32 第二部分红曲菌中結霉素和 Monacolin K 合成基因的研宄 VIII 第 4 章 综 述 .
33、34 4.1 to m . 34 4.2 桔霉素及其合成相关基因 . 34 4.3 Monacolin K 及其合成相关基因 . 37 4.4 红曲菌基因敲除 . 37 4.4.1 基因敲除 . 37 4.4.2 基因敲除菌株的筛选及验证 . 37 4.4.3 基因敲除方法在红曲菌种的应用 . 38 4.5 本课题研宄内容，目的及意义 . 38 4.5.1 本实验研宄的主要内容 . 38 4.5.2 本实验研宄的目的意义 . 39 第 5 章红曲菌种中产桔霉素和 Monacolin K 菌株的验证 . 40 5.1 弓丨 W . 40 5.2 实验材料与设备 . 40 5.2.1 菌种和质粒
34、. 40 5.2.2 酶和试齐 II . 40 5.2.3 缓冲溶液 . 40 5.2.4 咅养基 . 41 5.2.5 实验设备 . 42 5.3 实验步骤 . 42 5.3.1 菌种的培养 . 42 5.3.2 基因组 DNA 的提取 . 43 5.3.3 引物序列 . 43 5.3.4 PCR 扩增 . 45 5.3.5 探针的标记 . 47 5.3.6 红曲菌打点杂交 . 47 5.3.7As3.4383 和 ctnF 缺失菌株次级代谢产物桔霉素及红曲色素含量 白勺酸. 48 5.4 实验结果与分析 . 50 IX 5.4.1 红曲菌种基因组 DNA 的提取 . 50 5.4.2 結霉
35、素合成相关基因在红曲菌中的分布 . 50 5.4.3 MonacolinK 合成相关基因在红曲菌中的分布 . 52 5.4.4 通过扩增核糖体大亚基 LSU 的 D/D2 区域片段对红曲菌分子 分型的研宄 . 55 5.4.5 結霉素合成相关基因 ctnF 缺失菌株的验证 . 56 5.4.6 ctnF 缺失菌株代谢产物桔霉素含量的测定 . 60 5.5 本章小结 . 65 5.6 i 寸 i 仑 . 66 5.6.1 34 株红曲菌及转化子基因组 DNA 的提取 . 66 5.6.2 长片段聚合酶链式反应 . 66 5.6.3 c 沉 F 基因功能分析 . 67 第 6 章总结与展望 . 6
36、8 6.1 第一部分 . 68 6.1.1 工作总结 . 68 6.1.2 前景展望 . 69 6.2 第二部分 . 69 6.2.1 工作总结 . 69 6.2.2 下一步工作计划 . 70 参考文献 . 71 至文 i 射 . 77 个人简介 . 78 第一部分基于固态纳米孔的蛋白质 BSA单分子检测 第一章综述 1.1 引言 最近几年，纳米孔的单分子检测技术因其无需标记 1、检测速度快、成本低 及几乎无限阅读能力等特点，逐渐成为最具有发展前景的第三代 DNA 测序方法。 偏置电压施加到纳米级孔洞两侧后，它能驱使带电颗粒通过纳米孔。由于颗粒 通过纳米孔时会引起电流的瞬时变化，主要反映出该颗粒的大小，形状及其表 面性质 2。纳米孔检测技术具有纳米量级的检测精度及高通量，因此除了应用于 传统测序，在其他生物样品，如：蛋白质分子，病毒颗粒及纳米颗粒等的