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1、沙门氏菌的检测现在学习的是第1页，共45页沙门氏菌的检测授课教师：汪清美现在学习的是第2页，共45页一、实验目的 1.掌握沙门氏菌属的检测方法 2.了解沙门氏菌的基本生化反应及原理现在学习的是第3页，共45页二、实验器材 1.菌种：沙门氏菌、大肠杆菌 2.检样：鲜鸡蛋 3.培养基：四硫磺酸钠黄绿（TTB）增菌液；氯化镁孔雀绿增菌液（MM)；亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液；亚硫酸铋（BS）琼脂；HE 琼脂；SS琼脂；三塘铁琼脂（TSI）4.设备：冰箱、恒温培养箱、均质器、振荡器、电子天平、无菌锥形瓶、无菌吸管、无菌培养皿、无菌试管、无菌毛细管现在学习的是第4页，共45页1.四硫磺酸钠黄绿（TTB）
2、增菌液 基础液 900 mL 硫代硫酸钠溶液 100 mL 碘溶液 20.0 mL 煌绿水溶液 2.0 mL 牛胆盐溶液 50.0 mL 临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另 一种成分。现在学习的是第5页，共45页 蛋白胨蛋白胨 10.0 g 蒸馏水蒸馏水 1 000 mL pH 7.00.2 牛肉膏牛肉膏 5.0 g 氯化钠氯化钠 3.0 g 碳酸钙碳酸钙 45.0 g（碳酸钙可以调节碳酸钙可以调节ph,ph,是培养基在养菌过程是培养基在养菌过程中维持一定中维持一定ph,ph,否则否则phph过低过低,影响菌株生长影响菌株生长 另外还有筛选另外还
3、有筛选产酸菌的作用）产酸菌的作用）除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节碳酸钙，调节pH，高压灭菌，高压灭菌121，20 min基础液基础液现在学习的是第6页，共45页硫代硫酸钠溶液 硫代硫酸钠（含硫代硫酸钠（含5 5 个结晶水）个结晶水）50.0 g 50.0 g 蒸馏水蒸馏水 加至加至100 mL100 mL 高压灭菌高压灭菌121 121，20 min20 min。（硫代硫酸钠作为中和剂，硫代硫酸钠作为中和剂，可以灭菌可以灭菌121,15min121,15min，没有影响的，检验含有次氯酸钠的，没有影响的，检验含有
4、次氯酸钠的消毒水微生物，需要加入消毒水微生物，需要加入1.5%1.5%硫代硫酸钠溶液；培养基中硫代硫酸钠溶液；培养基中硫代硫酸钠和磺所生成的四硫磺酸，能抑制大部分大肠埃硫代硫酸钠和磺所生成的四硫磺酸，能抑制大部分大肠埃希氏菌的生长，而伤寒与副伤寒沙门氏菌仍能生长，因为希氏菌的生长，而伤寒与副伤寒沙门氏菌仍能生长，因为沙门氏菌具有四硫磺酶，能分解四硫磺酶。）沙门氏菌具有四硫磺酶，能分解四硫磺酶。）现在学习的是第7页，共45页培养基使用方法和注意事项 1.使用方法：称取本品93.55g，溶解于1050ml蒸馏水中，加热溶解，临用前加入20碘液20ml,0.5g煌绿2ml。2.注意事项：培养基不加碘
5、液可在4-10度冰箱保存。加入碘液后必须在几小时内使用。培养基中有白色碳酸钙沉淀为正常现象。现在学习的是第8页，共45页 3.原理：四硫酸钠是由硫代硫酸钠和碘经氧化生成而来，它对大肠菌群有抑制作用，对沙门氏菌无影响。因沙门氏菌具有四硫磺酸酶，能分解四硫磺酸钠，而大肠菌群没有这种酶，故生长受抑制。碳酸钙为缓冲剂，可使沙门氏菌不致因酸碱度改变而死亡。现在学习的是第9页，共45页2.氯化镁孔雀绿增菌液（MM)甲液：胰蛋白胨5g；磷酸二氢钾1.6g；氯化钠8g蒸馏水1000ml；2.乙液：氯化镁40g；蒸馏水100ml 3.丙液：0.4%孔雀绿水溶液:上述成分配好后，121度高压灭菌15min，临用时
6、取甲液90ml；乙液9ml 丙液0.9ml现在学习的是第10页，共45页MM增菌液各成分的作用 胰蛋白胨提供氮源和碳源满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；磷酸二氢钾是缓冲剂；氯化镁可以增加培养基的渗透压；孔雀绿抑制非沙门氏菌的生长，较低的pH结合氯化镁和孔雀绿使培养基具有较高的选择性。现在学习的是第11页，共45页3.亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液 成分 蛋白胨蛋白胨 5.0 g 乳糖乳糖 4.0 g 磷酸氢二钠磷酸氢二钠 10.0 g 亚硒酸氢钠亚硒酸氢钠 4.0 g L-胱氨酸胱氨酸 0.01 g 蒸馏水蒸馏水 1 000 mL pH 7.00.2制法 除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，
7、将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/L L-胱氨酸溶液10 mL（称取0.1 g L-胱氨酸，加1mol/L 氢氧化钠溶液15mL，使溶解，再加无菌蒸馏水至100mL 即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节pH。现在学习的是第12页，共45页SC增菌液各成分的作用蛋白胨提供碳源满足细菌生长的需求，提供碳源满足细菌生长的需求，乳糖乳糖是可发酵的糖类；是可发酵的糖类；亚硒酸氢钠亚硒酸氢钠抑制革兰氏阳性菌和非沙门氏菌的大多数革兰抑制革兰氏阳性菌和非沙门氏菌的大多数革兰氏阴性菌的生长，氏阴性菌的生长，磷酸盐磷酸盐是缓冲剂，是缓冲剂，L-L-胱氨酸胱氨
8、酸为还原剂。为还原剂。现在学习的是第13页，共45页4.亚硫酸铋（BS）琼脂 蛋白胨 10.0g 牛肉膏 5.0g 葡萄糖 5.0g 硫酸亚铁 0.3g 磷酸氢二钠 4.0g 煌 绿 0.025g 或5.0gL 水溶液5.0mL 柠檬酸铋铵 2.0g 亚硫酸钠 6.0g 琼 脂 18.0g20g 蒸馏水 1000mL pH7.50.2现在学习的是第14页，共45页 将前三种成分加入300 mL 蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20 mL 和30mL 蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20 mL 和30 mL 蒸馏水中，琼脂加入600 mL 蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，
9、煮沸溶解。冷至80 左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50 55。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。制法制法现在学习的是第15页，共45页BS培养基的原理 1.蛋白胨、牛肉膏粉提供碳源和氮源；2.葡萄糖提供能源 3.亚硫酸铋抑制剂，抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群，但不影响沙门氏菌的生长；4.磷酸氢二钠 缓冲剂 5.硫酸亚铁用于产生硫化氢，并与铁反应生成黑色沉淀，使阳性培养物在平板上具有金属光泽的棕色或黑色菌落 6.琼脂是凝固剂现在学习的是第16页，共45页5.HE 琼脂 基础成分
10、：蛋白胨 12.0g 牛肉膏 3.0g 乳糖 12.0g 蔗糖 12.0g 水杨素 2.0g 胆盐 20.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 18.0g20.0g 蒸馏水 1000mL 0.4溴麝香草酚蓝溶液16.0mL Andrade 指示剂 20.0 mL 甲液 20.0mL 乙液 20.0mL pH 7.50.2现在学习的是第17页，共45页 甲液的配制 硫代硫酸钠34.0g 柠檬酸铁铵4.0g 蒸馏水100mL 乙液的配制 去氧胆酸钠 10.0g蒸馏水 100mL Andrade 指示剂 酸性复红0.5g 1mol/L氢氧化钠溶液 16.0mL 蒸馏水100 mL，将复红溶解于蒸馏水中,加入
11、氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1mL2mL。现在学习的是第18页，共45页 制法 将前面七种成分溶解于400mL 蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600 mL 蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内，调节pH。再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至50 55 倾注平皿。注:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。现在学习的是第19页，共45页.HE 琼脂的原理蛋白胨、牛肉膏粉蛋白胨、牛肉膏粉提供碳源、氮源、维生素和矿物质提供碳源、氮源、维生素和矿物质乳糖、蔗糖和水杨素乳糖、蔗糖和水杨素为可发酵的糖类为可发酵的糖类胆盐、去
12、氧胆酸钠胆盐、去氧胆酸钠抑制革兰氏阳性菌抑制革兰氏阳性菌氯化钠氯化钠维持均衡的渗透压维持均衡的渗透压硫代硫酸钠和柠檬酸铁铵硫代硫酸钠和柠檬酸铁铵用于检测硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色用于检测硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色琼脂琼脂是培养基的凝固剂是培养基的凝固剂溴麝香酚蓝和酸性复红溴麝香酚蓝和酸性复红为为PH指示剂指示剂发酵糖产酸发酵糖产酸的菌落呈红色，的菌落呈红色，不发酵糖的菌落不发酵糖的菌落为蓝绿色为蓝绿色现在学习的是第20页，共45页6.SS琼脂配方 牛肉粉 月示胨 乳糖 三号胆盐 枸橼酸钠 硫代硫酸钠 枸橼酸铁 中性红 煌绿 琼脂 pH值7.0 0.1 5.0 5.00 10.0 8.5
13、 8.5 8.5 1.0 0.025 0.00033 17.0 现在学习的是第21页，共45页 月示胨、牛肉粉提供碳源、氮源、维生素和矿物质；乳糖、葡萄糖为可发酵的糖类；三号胆盐、枸橼酸钠和煌绿抑制革兰氏阳性菌及大多数的大肠菌群和变形杆菌，但不影响沙门氏菌的生长；硫代硫酸钠和枸橼酸铁用于检测硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色；中性红为pH指示剂，可把分解乳糖和不分解乳糖的细菌鉴别开，前者为红色菌落，后者为无色菌落 发酵糖产酸的菌落呈红色，不发酵糖的菌落为无色；琼脂是培养基的凝固剂。SSSS琼脂的原理琼脂的原理现在学习的是第22页，共45页1.1.前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的沙门菌恢复
14、活力;2.2.选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，大多数其它细菌受到抑制;3.3.选择性平板分离培养：分离出所需的细菌;4.4.生化试验：鉴定分离出来的细菌是否符合所检项目的细菌;5.5.血清学鉴定：进一步鉴定。1.基本步骤（程序）基本步骤（程序）：现在学习的是第23页，共45页加工过的样品：称取25g（mL）样品放入盛有225mL缓冲蛋白胨水（BPW）的无菌均质杯，以8000 10000r/min均质12 min，或置于盛有225mL BPW的无菌均质袋，拍击式均质拍打12 min 。液体样品不需均质，振摇混匀。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中（如使用均质袋，可直接培养），361培养818h
15、。冷冻产品，应在45 以下不超过15min，或2 5 不超过18h解冻。未加工样品：。（1）前增菌前增菌现在学习的是第24页，共45页 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mL四硫磺酸钠煌绿（TTBTTB）增菌液内，42 1 培养1824h。同时，另取1mL，转种于10mL亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液内，361培养1824h。SC更适合伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌增菌，最适增菌温度为36 1，时间为1824h。TTB更适合其他沙门氏菌增菌，最适增菌温度为42 1，时间为1824h。增菌时，必须同时使用SCSC和TTBTTB，提高检出率，以防漏检。（2）增菌增菌现在学习的是第2
16、5页，共45页（3）分离-选择性平板分离分别用接种环取增菌液一环，划线接种于选择性培养基上，分离培养 一个亚硫酸铋（BS）琼脂平板，361培养4048h 一个木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基），361培养1824h。观察各平板上生长的菌落，各平板上的菌落的特征见附表。现在学习的是第26页，共45页选择选择性琼性琼脂脂亚属亚属、亚属亚属（亚利桑那菌）（亚利桑那菌）BS菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基
17、不变落，周围培养基不变黑黑色有金属光泽色有金属光泽HE蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。为黄色，中心黑色或几乎全黑色。乳糖阳性的菌株为黄色、中心黑色乳糖阳性的菌株为黄色、中心黑色或几乎全黑色，乳糖迟缓阳性或阴或几乎全黑色，乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色色或几乎全黑色SS无色半透明，产硫化氢菌株有的菌无色半透明，产硫化氢菌株有的菌落中心落中心带黑色带黑色，但不明显。，但不明显。乳糖迟缓阳性或阴性的菌株，与亚乳糖迟缓阳性或阴性的菌株，与亚属
18、属、相同；相同；乳糖阳性乳糖阳性的菌株为粉红色，中心黑色，的菌株为粉红色，中心黑色，但中但中心无黑色形成时与大肠埃希氏不能心无黑色形成时与大肠埃希氏不能区别区别现在学习的是第27页，共45页SS琼脂平板 现在学习的是第28页，共45页 现在学习的是第29页，共45页BS琼脂现在学习的是第30页，共45页BS上的菌落上的菌落DHL上的菌落上的菌落SS上的菌落上的菌落现在学习的是第31页，共45页BS BS XLDHE科玛嘉显色培养基平板科玛嘉显色培养基平板 一种培养基不可能适合所有沙门氏菌的分离，一种培养基不可能适合所有沙门氏菌的分离，BSBS选择性强选择性强，更适合分离伤寒沙门氏菌。，更适合分
19、离伤寒沙门氏菌。分离沙门氏菌要同时用两种以上的培养基，互补，可提分离沙门氏菌要同时用两种以上的培养基，互补，可提高检出率，以防漏检。其中必须有高检出率，以防漏检。其中必须有BSBS。现在学习的是第32页，共45页（4）生化试验 选择性琼脂平板上符合沙门氏菌特征的菌落，只能称其疑为沙门氏菌，也可能是其他杂菌。五项生化试验：三糖铁(TSI)试验 赖氨酸脱羧酶试验 靛基质试验 尿素琼脂培养 氰化钾培养基现在学习的是第33页，共45页 1.三糖铁(TSI)试验 自选择性琼脂平板上分别挑取两个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再底层穿刺，用一空白培养基作对照试验。2 赖氨酸脱羧酶试验：接
20、种三糖铁琼脂的接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于361培养1824h，必要时可延长至48h。现在学习的是第34页，共45页 培养基：乳糖：蔗糖：葡萄糖=10：10：1；加有酚红 本试验可同时观察糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。原理：只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。35现在学习的是第35页，共45页三糖铁(TSI)试验测定细菌对葡萄糖、乳糖、蔗糖的分解和产硫化氢情况:不
21、分解乳糖、蔗糖，分解葡萄糖 不产酸，碱性不产酸，碱性粉红色（粉红色（-）；产酸产酸黄色（黄色（+）；产生产生H2S黑色（黑色（+）；）；不产生不产生H2S（-）。现在学习的是第36页，共45页思考题 1.志贺菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多数不发酵乳糖，不产生硫化氢，应该是几号？2.大肠杆菌，能分解葡萄糖，产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生硫化氢，应该是几号管？3.沙门氏菌能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生硫化氢，多说产气，应该是几号管？现在学习的是第37页，共45页赖氨酸脱羧酶试验(1)原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱羧生成胺和二氧化碳。胺使培养基变为碱性，可用指示剂指示出来
22、。(2)方法：将待检菌分别接种于1支赖氨酸脱羧酶试验管和1支对照管，各覆盖至少0.5cm高度的无菌石蜡油，35孵育14d，观察结果。(3)结果：若为溴甲酚紫指示剂，阳性试验管培养初期（1012h）因发酵葡萄糖产酸变黄，继续培养由于氨基酸脱羧产生胺类而使培养基由酸变碱，故又由黄变为紫色。阴性试验管则始终呈黄色。对照管应为黄色。现在学习的是第38页，共45页39现在学习的是第39页，共45页3 进一步生化试验：进一步生化试验：接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基及对照培养基各1管。于361培养1824h，必要时
23、可延长至48h 现在学习的是第40页，共45页 细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。色氨酸 吲哚（无色）对二甲基氨基苯甲醛 玫瑰吲哚（红色，+大肠杆菌）不产吲哚（无色，-产气杆菌）试验方法：取培养24h培养液，先加入少量乙醚，摇动试管以提取和浓缩吲哚，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入吲哚试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。应用：用于肠道杆菌的鉴定41现在学习的是第41页，共45页现在学习的是第42页，共45页 有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。酚红：黄色 红色（+普通变形杆菌）黄色（-大肠杆菌）试验方法：挑取1824h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇匀，于361培养，观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。培养24h左右，观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。43现在学习的是第43页，共45页现在学习的是第44页，共45页作业 1.沙门氏菌检测的基本步骤？2.三糖铁试验的原理及试验现象？现在学习的是第45页，共45页