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1、显 微 镜 知 识我们的眼睛能看到数百万光年外的星系，却不一定能看到眼前细小的物体。在大尺度上观察物质的运动，毫无疑问能得到强烈的美感。那么从极其微小的尺度上呢？威廉 布莱克在一首诗中写道：一花一世界，一沙一天堂，掌中握无限，霎那成永恒。天真的预言（Auguries of Innocence），1863如果除去其中的神秘主义和宗教意味，那么这首诗恰好与微观世界的某些特点不谋而合。例如一朵花包含数以万计的细胞，而一粒沙确实是由无数的氧原子和硅原子组成的(SiO2)。不过，即使把一朵花握于掌中，你也决不会肉眼分辨出其中的“世界”。一个视力正常的人，只能看清大约25 厘米之外的物体，如果继续靠近，晶
2、状体就无法把物体的像正确的投影在视网膜上。即使在25 厘米的明视距离上，你也只拥有1 分的分辨率。或者说，在这个距离上，你恰好能把两条相距0.075 毫米的线分开。从生物学的角度可以解释这种现象。当两条线的距离小于0.075 毫米的时候，它们的像就会落在视网膜的同一个视觉感受器视锥细胞或者视杆细胞 上面。那么你就没法把它们分辨开来。很早以前，人们就知道某些光学装置能够“放大”物体。比如在墨经里面就记载了能放大物体的凹面镜。至于凸透镜是什么时候发明的，可能已经无法考证。凸透镜 有的时候人们把它称为“放大镜”能够聚焦太阳光，也能让你看到放大后的物体，这是因为凸透镜能够把光线偏折。你通过凸透镜看到的
3、其实是一种幻觉，严格的说，叫做虚像。当物体发出的光通过凸透镜的时候，光线会以特定的方式偏折。当我们看到那些光线的时候，或不自觉地认为它们仍然是沿笔直的路线传播。结果，物体就会看上去比原来大。单个凸透镜能够把物体放大几十倍，这远远不足以让我们看清某些物体的细节。公元 13 世纪，出现了为视力不济的人准备的眼镜 一种玻璃制造的透镜片。随着笼罩欧洲一千年的黑暗消失，各种新的发明纷纷涌现出来，显微镜（microscope）就是其中的一个。大约在 16 世纪末，荷兰的眼镜商詹森（Zaccharias Janssen）和他的儿子把几块镜片放进了一个圆筒中，结果发现通过圆筒看到附近的物体出奇的大，这就是现在
4、的显微镜和望远镜的前身。据说，几百年前列文虎克把他制作显微镜的技术视为秘密。今天，显微镜 至少是光学显微镜已经成了一种非常普通的工具，让我们了解这个小小的大千世界。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 9 页 -复合式显微镜詹森制造的是第一台复合式显微镜。使用两个凸透镜，一个凸透镜把另外一个所成的像进一步放大，这就是复合式显微镜的基本原理。如果两个凸透镜一个能放大 10 倍，另一个能放大20 倍，那么整个镜片组合的的放大倍数就是10*20=200倍。1665 年，英国科学家罗伯特 胡克（人们可能更熟悉他的另一个发现：胡克定律）用他的显微镜观察软木切片的时候，惊奇的发现其
5、中存在着一个一个“单元”结构。胡克把它们称作“细胞”。不过，詹森时代的复合式显微镜并没有真正显示出它的威力，它们的放大倍数低得可怜。荷兰人安东尼 冯 列文虎克（Anthony Von Leeuwenhoek，1632-1723)制造的显微镜让人们大开眼界。列文虎克自幼学习磨制眼镜片的技术，热衷于制造显微镜。他制造的显微镜其实就是一片凸透镜，而不是复合式显微镜。不过，由于他的技艺精湛，磨制的单片显微镜的放大倍数将近300倍，超过了以往任何一种显微镜。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 9 页 -罗伯特 虎克的显微镜列文虎克的显微镜当列文虎克把他的显微镜对准一滴雨水的时候
6、，他惊奇的发现了其中令人惊叹的小小世界：无数的微生物游曳于其中。他把这个发现报告给了英国皇家学会，引起了一阵轰动。人们有时候把列文虎克称为“显微镜之父”，严格的说，这不太正确。列文虎克没有发明第一个复合式显微镜，他的成就是制造出了高质量的凸透镜镜头。在接下来的两个世纪中，复合式显微镜得到了充分的完善，例如人们发明了能够消除色差（当不同波长的光线通过透镜的时候，它们折射的方向略有不同，这导致了成像质量的下降）和其他光学误差的透镜组。与19 世纪的显微镜相比，现在我们使用的普通光学显微镜基本上没有什么改进。原因很简单：光学显微镜已经达到了分辨率的极限。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-
7、第 3 页，共 9 页 -如果仅仅在纸上画图，你自然能够“制造”出任意放大倍数的显微镜。但是光的波动性将毁掉你完美的发明。即使消除掉透镜形状的缺陷，任何光学仪器仍然无法完美的成像。人们花了很长时间才发现，光在通过显微镜的时候要发生衍射 简单的说，物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。如果两个衍射光斑靠得太近，你就没法把它们分辨开来。显微镜的放大倍数再高也无济于事了。对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是0.2 微米。任何小于0.2 微米的结构都没法识别出来。暗视场显微镜在日常生活中，室内空气里的微粒灰尘是不容易看见的，但在黑暗的房间中，若有一束光线从门缝斜射进来，
8、灰尘微粒便粒粒可见了，这就是光学上的丁达尔现象，这也是在白天我们不能而在夜晚就能清晰地看到天上星星的原因。暗视场显微镜 就是利用此原理设计的，观察血细胞的清晰度比普通亮背景显微镜有了大大提高，以暗视场显微镜所看到的是衬托在黑背景中发亮的细胞轮廓及其细节。显微镜的最高分辨率为0.2 微米，而暗视场显微镜能大大提高样品的细节构造分辨率，可看到 0.004 微米以上微细颗粒的存在，即可以看到亚显微结构，特别适合用来观察微细的颗粒与细菌等。在医学、林业、农业等众多领域研究中有着广泛用途。暗视场显微镜观察相差显微镜观察相差显微镜相差显微镜的基本原理是通过仪器，把透过显微标本的可见光的相位差变成振幅差，从
9、而大大提高了标本内显微结构间的对比度，使标本结构更加清晰可辨。是介于光学显微镜与电子显微镜之间的一种显微检查技术，用于观察生活细胞或未经染色细胞的形态结构。生物细胞无色透明，细胞内各种结构间的反差很小，在一般光学显微镜下难以清晰观察到细胞的轮廓及内部结构，必须使用相差显微镜显微镜的光学系统名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 4 页，共 9 页 -显微镜，最重要的指标是清晰度要高。没有清晰度，放大倍数便毫无意义，这取决于光学系统，显微系统虽然都是由物镜目镜组成，但是系统不同,效果大不相同，就好象普通电视和数字电视，都可以看，档次效果却不一般。目前各种显微镜主要分二大类型光学系统：1
10、、有限远显微光学系统普通。2、无限远显微光学系统 清晰度高，国外如德国、日本、美国的仪器设计采用。电子显微镜提高显微镜分辨率的途径之一就是设法减小光的波长，或者，用电子束来代替光。根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度越快，它的“波长”就越短。如果能把电子的速度加到足够高，并且汇聚它，就有可能用来放大物体。1938 年，德国工程师Max Knoll 和 Ernst Ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜（TEM）。1952 年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜（SEM）。电子显微镜是20 世纪最重要的发明之一。由于电子的速度可以加到很高
11、，电子显微镜的分辨率可以达到纳米级（10-9m）。很多在可见光下看不见的物体 例如病毒 在电子显微镜下现出了原形。（电子显微镜下的蚊子）扫描隧道显微镜用电子代替光，这或许是一个反常规的主意。但是还有更令人吃惊的。1983年，IBM 公司苏黎世实验室的两位科学家Gerd Binnig和 Heinrich Rohrer发明了所谓的扫描隧道显微镜（STM）。这种显微镜比电子显微镜更激进，它完全失去了传统显微镜的概念。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 5 页，共 9 页 -诺贝尔奖：Ernst Ruska，Gerd Binnig和 Heinrich Rohrer（从左至右）分别因为发明
12、电子显微镜和扫描隧道显微镜而分享1986 年的诺贝尔物理学奖很显然，你不能直接“看到”原子。因为原子与宏观物质不同，它不是光滑的、滴溜乱转的削球，更不是达 芬奇绘画时候所用的模型。扫描隧道显微镜依靠所谓的“隧道效应”工作。如果舍弃复杂的公式和术语，这个工作原理其实很容易理解。隧道扫描显微镜没有镜头，它使用一根探针。探针和物体之间加上电压。如果探针距离物体表面很近大约在纳米级的距离上 隧道效应就会起作用。电子会穿过物体与探针之间的空隙，形成一股微弱的电流。如果探针与物体的距离发生变化，这股电流也会相应的改变。这样，通过测量电流我们就能知道物体表面的形状，分辨率可以达到单个原子的级别。扫描隧道显微
13、镜：图中的“IBM”是由单个原子构成的名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 6 页，共 9 页 -因为这项奇妙的发明，Binnig 和 Rohrer 获得了 1986 年的诺贝尔物理学奖。这一年还有一个人分享了诺贝尔物理学奖，那就是电子显微镜的发明者Ruska。显 微 镜 的 调 整为了更好地发挥显微镜的各种功能，提高工作效率，保证在显微观察及显微摄象过程中取得最佳效果，使用人员必须了解和掌握显微镜正确的调试方法和使用方法。尤其是多功能高倍显微镜，能进行多种显微镜检方法观察，正确的试调方法和使用方法就显得尤为重要。下面简述调试及使用方法。1.显微镜照明光路系统的调整为了使显微镜的视
14、野能受到均匀而又充分的照明，在显微镜初次安装和调试时，就必须把照明光路系统调整好，这是正确使用显微镜，并获得正确、可靠结果的重要手段和最基本的要求。此外，正确掌握照明光路系统的调整，是使用显微镜过程中更换光源灯泡后所必经的步骤，也是在日常使用过程中不时地检验显微镜性能的必要手段。显微镜照明光路系统的调整主要有以下4 项内容：(1)照明光源灯室在显微外的初步调整 首先将灯室的外壳打开，压弹簧夹子将卤素灯泡装入插座中，安装时避免手指直接接触灯泡（可用柔软的布或纸隔住），以免灯泡上留有指纹等脏物，影响灯泡的使用寿命。把灯室摆在桌面上，接通电源后，用专用的螺丝刀调节灯的调焦旋钮孔（标有“”），使灯丝投
15、影在1-2m 外的墙上，将灯丝成像调至清晰；然后调节灯的高低位置调节丝孔（标有“”）使灯丝位置高低适当；再调节灯的左右位置调节螺丝孔（标有“”），使灯丝左右位置合适。(2)光源发光体（灯丝）在显微镜内位置的检验和校正目的是为了把发光体的像端端正正地调入物镜的视域范围内，从光源的角度去确保显微镜的视域受到充分而均匀的照明，这是调整库勒照明系统的前提条件。(3)库勒照明（Kohler）系统的正确调整显微镜的正确调试，主要工作之一是照明光路系统的调整，而其中的关键是库勒照明系统的调整。对于每一位使用显微镜的人员，特别是作显微照像的人员来说，应该对库勒照明系统的原理及其调整步骤有一定的了解和掌握，才能
16、充分发挥显微镜应有的功能，拍出来的照片才能在效果上比较一致而又完善。库勒照明系统的原理简单来说就是：光源发光体上任意一点发出的光，可以照明显微镜的视域范围，而光源发光体上每一点所发出的光汇集起来，在显微镜的视域中就实现了非常充分而又均匀的照明。调整库勒照明系统的目的，是为了使所观察的视域能获得均匀而又充分的照明，防止杂散光对照像系统造成影响或干扰，以名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 7 页，共 9 页 -免照像时在底片形成灰雾。库勒照明系统调整好以后，整个视域照明均匀，拍摄的显微照片明亮清晰，反差正常。在日后使用过程中应特别注意：a.视场光阑不可任意开大，但可随物镜倍数的增大而
17、将视场光阑收小，随物镜倍数的减小而b.聚光镜的高低位置不准乱调，否则会破坏已调整好的库勒照明系统；c.关于物镜倍数与视场光阑大小配合问题，在实际使用过程中，作为一般观察不一定要收小或开大视场光阑，但作显微照相时，为了避免杂散光线对照相系统的干扰，以便能拍摄到较完善的照片，则应在使用每一个倍数的物镜时，把视场光阑调节到正好消失于所观察的视域边上，这是比较繁复的工作，但又非做不可。较为简便的方法是把与各个倍数物镜相对应的视场光阑事先调整好，并作好记号，以后使用时根据记号直接调至相应的位置。(4)孔径光阑的正确使用由于聚光镜的孔径光阑可以影响显微镜的分辨率，使用时应掌握正确的使用方法。过去由于对孔径
18、光阑的认识不足，往往把它当作是调节视野亮度的工具。虽然调节孔径光阑在一定程度上可以改变视野的亮度，但会直接影响成像的反差、对比度及分辨率，在使用过程中应尽可能避免。为了发挥聚光镜孔径光阑的作用，以便在观察时，尤其在作显微照相时获得最佳分辨率，在每换用一个倍数的物镜时，在样品调焦清晰后，需要调节孔径光阑，使它的大小正好等于所用物镜数值孔径（物镜孔径像）的2/3。2.显微镜成像光路系统的调整及显微镜检术概要显微镜成像光路系统的调整，是根据不同显微镜检术的需要而进行的。所谓显微镜检术（microscopy），概括而言就是以显微镜观察样品时所使用的照明方法，以及如何使样品所成的像能获得更良好反差的技术
19、与方法。以下简述显微镜检术中已成熟的几种方法及对应的显微镜成像光路系统的调整方法。(1)透射光明视野（brightfield）这是自显微镜发明以来最传统、最普遍的应用方法。基本部件：a.物镜：任何物镜都可作明视野观察；b.聚光镜：各种聚光镜均可，最好配有孔径光阑。调整方法：在上述显微镜的库勒照明系统调整好后，即可应用明视野法。适用范围：所有已染色的组织切片、血液涂片等。注意事项：a.使用明视野方法观察时，一定要将库勒照明系统调整好；名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 8 页，共 9 页 -b.视场光阑不可任意开大，使用10、10 以下和 10 以上物镜时，要将聚光镜前端透镜分别摆
20、事实出和摆进光路中；c.不可用聚光镜的孔径光阑来调节视野的亮度，更不要乱调聚光镜的高低位置，否则，会降低显微镜的分辨率和破坏已调整好的库勒照明系统；d.作显微照相时，每换用一个倍数的物镜，就要调节聚光镜的孔径光阑，使它的大小正好等于所用物镜数值孔径的2/3。(2)落射光激发的荧光法（简称为落射荧光法）是近代显微镜检术中新发展出来的一种强有力的反差增强法。它将激发荧光用的光源改在物镜的上方，光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品，从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光镜而由目镜观察。该方法较简便，效率高，50W的光源强度比透射荧光法的250W 还强。荧光方法是利用波长较短的紫外光、紫光、蓝紫光
21、、蓝光及绿光等去激发样品，只要样品中含有可产生荧光的成分，它便吸收短波的激发光而释放出波长较长的荧光。不同物质只能吸改特定波长的激发光，而释放的荧光也会有特定的波长，因而用作特异性的鉴定十分有效，如某些致病的细菌和螺旋体，受紫外光激发后能发出它们特有的荧光，很容易作出鉴定，这种利用物质吸收激发光后放出特有荧光的方法称为自发荧光法。某些物质自身不会吸收激发光，或吸收后不能释放荧光，但可以吸收或吸附特定的荧光色素或染料，而这些特定的荧光色素或染料也只能吸收特定的激发光，再释放出特定的荧光，从而间接地鉴别出某种物质，这称为间接荧光法。上述荧光方法广泛应用于医学、生物学及工业的特异性研究和鉴别上。显微
22、镜的保养显微镜是一种精密的光学仪器，价格普遍较高。从结构上看，显微镜由许多光学部件和较精密的金属零件组成，在使用过程中应特别注意做好保养工作。1.严格按照有关操作规则使用显微镜，避免因使用不当造成损毁。2.显微镜在储存和使用过程中，普遍存在着生霉起雾问题，霉和雾会使显微镜的视场模糊，分辩率下降。为了使显微镜保持良好的工作状态，延长使用寿命，显微镜的工作环境应保持清洁、干燥、防尘。3.显微镜在每次使用完毕后应及时做好清洁工作，特别是目镜、物镜等容易污染的光学部件，如发现表现表面有灰尘、指纹、脏物等，应及时用镜头纸清洁干净。4.显微镜工作室最好能安装空调、抽湿及防尘装置。5.如发现光学部件内部有生霉等现象，最好及时联系厂家派人清洁、维修。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 9 页，共 9 页 -