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1、抗 体 制 药第1页，此课件共73页哦 3 3、19601960年发现多发性骨髓瘤细胞有多种免疫球蛋白。年发现多发性骨髓瘤细胞有多种免疫球蛋白。由于病由于病原微生物是含有多种抗原决定族的抗原物质，因此制的这些抗体制剂原微生物是含有多种抗原决定族的抗原物质，因此制的这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称为也是多种抗体的混合物，故称为多克隆抗体多克隆抗体。易出现非特异性交叉反。易出现非特异性交叉反应。应。4 4、19751975年年K Khler and Milsteinhler and Milstein等首次等首次利用利用B B淋巴细胞杂交瘤技淋巴细胞杂交瘤技术制备出术制备出 McAb.McAb
2、.在临床上主要用于诊断和治疗。在临床上主要用于诊断和治疗。McAbMcAb由一个B细胞克隆产生的，只能识别某一个抗原表位的高度特异性抗体。第2页，此课件共73页哦 McAb 在免疫导向疗法中存在的困难（障碍）：在免疫导向疗法中存在的困难（障碍）：A、McAb均是均是鼠源性抗体鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有56h，难以维持有效药物作用，难以维持有效药物作用靶组织时间；靶组织时间；B、完整的抗体分子的、完整的抗体分子的相对分子质量过大相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤
3、组织，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。达不到有效的治疗浓度。解决问题的方法或途径解决问题的方法或途径基因工程技术基因工程技术 A、降低、降低McAb的免疫源性；的免疫源性；B、降低、降低McAb的相对分子质量。的相对分子质量。第3页，此课件共73页哦5、1984年报道了人年报道了人鼠嵌合抗体，鼠嵌合抗体，之后制备出了改型之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的只有完整抗体分子的1/801/3
4、。6、1994年年Winter创建了噬菌体抗体库 技术,以基因工程方法制备抗体并发展成抗体工程抗体工程。它是抗体研究领域的一它是抗体研究领域的一次技术革命，它不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全次技术革命，它不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体。用基因工程技术制备人源性抗体。第4页，此课件共73页哦第二节第二节 单克隆抗体及其改造（单克隆抗体及其改造（Monoclonal AntibodyMonoclonal Antibody）一、制备单克隆抗体的一般流程一、制备单克隆抗体的一般流程 McAbMcAb是将是将抗体产生细胞抗体产生细胞与具有与具有无限增殖能力的骨髓瘤细
5、胞无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。第5页，此课件共73页哦第6页，此课件共73页哦第7页，此课件共73页哦 1、抗原与动物免疫、抗原与动物免疫 免疫方法：体内免疫和体外免疫免疫方法：体内免疫和体外免疫 抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原 免疫动物：免疫动物：B
6、ALB/c小鼠和小鼠和Lou大鼠大鼠 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 基本方法：取适量脾细胞（基本方法：取适量脾细胞（1 108）与骨髓瘤细胞（）与骨髓瘤细胞（2 1073 107）进行混合，在）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释融合液缓慢稀释。第8页，此课件共73页哦第9页，此课件共73页哦 用于细胞融合的骨髓瘤细胞的条件：用于细胞融合的骨髓瘤细胞的条件：1、融和率高、融和率高2、自身不分泌抗体、自身不分泌抗体3、所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力
7、强且长期稳定。、所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定。第10页，此课件共73页哦 PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为40%50%，相对，相对分子质量分子质量4000为佳。相对分子质量在为佳。相对分子质量在4006000，浓度在，浓度在10%60%范围内范围内的的PEG都能使细胞发生融合。都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在为了提高融合率，在PEG 溶液中加入溶液中加入DMSO（二甲基亚砜二甲基亚砜），），以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但
8、必须严格限制接触时以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。间。（1）细胞融合液中的细胞类型：）细胞融合液中的细胞类型：4或或5种。种。（2）如何去除脾如何去除脾-瘤融和细胞以外的细胞？常用选择性培养瘤融和细胞以外的细胞？常用选择性培养基基第11页，此课件共73页哦第12页，此课件共73页哦 细胞融合后，可产生多种融合细胞，如脾脾脾脾、脾脾瘤瘤、瘤瘤瘤瘤的融合细胞，而且还有许多未融合的骨髓瘤细胞未融合的骨髓瘤细胞。这些细胞比脾脾瘤融合瘤融合的杂交瘤的杂交瘤细胞增殖更快，并能将其淘汰。为此，可再将融合后的细胞立即移入选择性培养基中进行培养。常用的选择培养基为HATHAT培养基培
9、养基，它是用次黄嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶配制的。其中氨基喋吟(A)能阻断DNA合成的主要途径，瘤瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾脾融合细胞和瘤细胞在这样的组织培养条件下，几天内亦迅速死亡。由于骨髓瘤细胞都是次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺乏株缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT酶，用次黄嘌吟(H)和胸腺嘧啶合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。第13页，此课件共73页哦 在最适的培养条件下大约有105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活。
10、在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞。所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖。常用的饲养细胞饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。一般认为饲养细胞能释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，故应用的较多。第14页，此课件共73页哦3 3、筛选阳性克隆与、筛选阳性克隆与克隆化克隆化 常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术免疫技术 常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。常用的克隆化方法：有限稀释
11、法和软琼脂法。有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到9696孔孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用应用HTHT培养液，以后的克隆化可用不含培养液，以后的克隆化可用不含HTHT的的RPMI 1640RPMI 1640培养培养液。液。软琼脂法：在培养液中加入软琼脂法：在培养液中加入0.5%0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入，移入9696孔板培养。
12、孔板培养。第15页，此课件共73页哦 筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆与克隆化 因为抗体产生细胞只占所有脾细胞的5左右，所以要进行每孔培养上清的抗体活性的筛选工作，以选择出阳性克隆，然后进行克隆化培养。并检测大批标本。免疫酶技术免疫酶技术因不需进行放射性核素操作，方法简便，又适于检测大批标本等优点而被广泛采用。通过引入生物素亲和素等放大系统可进一步提高灵敏性。一般说来免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测。适用于可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测，特别是制备以检测患者活检组织检测患者活检组织标本为
13、目的的抗体时，免疫荧光法则更有意义，在筛选抗体的同时，还能对所识别的抗原进行定位判定。下面以酶联免疫吸附试验筛选抗破伤风毒素抗体为例进行说明。第16页，此课件共73页哦第17页，此课件共73页哦4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定染色体分析染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。，全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体：小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为细胞为6268，NS-1为为5464，有中部和亚中部着丝点。有中部和亚中部着丝点。杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色
14、体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，则反。之，则反。第18页，此课件共73页哦5 5、单克隆抗体的大量制备、单克隆抗体的大量制备 （1 1）体外培养法：用于抗原免疫性极弱）体外培养法：用于抗原免疫性极弱 获得的抗体较少。多采用获得的抗体较少。多采用RPMI 1640RPMI 1640培养液，添加培养液，添加10%-20%10%-20%胎牛或小牛血清。胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白
15、量可达但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100 100 g/mlg/ml以上，给纯化带来困难以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。交瘤细胞的生长。改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。血清。此法虽可减少污染
16、，但产量不高。悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可达悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可达2 2 10107 7/ml,/ml,收集的单克隆收集的单克隆抗体可达抗体可达400 400 g/mlg/ml。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达10108 8/ml/ml。第19页，此课件共73页哦（2）动物体内诱生法：）动物体内诱生法：用于抗原免疫性较强。用于抗原免疫性较强。常用常用 基本程序：接种前基本程序：接种前12周，小鼠腹腔注射周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降植烷）（降植烷）或用液体石蜡，然后注射或用液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞
17、，杂交瘤细胞，712d便有腹水生成，待便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。第20页，此课件共73页哦6 6、单克隆抗体的纯化、单克隆抗体的纯化 根据根据IgIg的类和亚类以及用途选择不
18、的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。同的纯化方法。体外诊断试剂体外诊断试剂IgGIgG类类-沉淀处理沉淀处理+亲和层析亲和层析 IgMIgM类类-沉淀处理沉淀处理+凝胶过滤凝胶过滤 体内诊断试剂或治疗用药体内诊断试剂或治疗用药-亲和亲和层析层析+阴离子交换层析，并注意除去毒素阴离子交换层析，并注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。、病毒、核酸等微量的污染物。第21页，此课件共73页哦动物体内诱生法制备的动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序：纯化的一般程序：（1）澄清和沉淀处理：）澄清和沉淀处理：a.1000g 离心离心5min，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块，去除沉淀物（
19、红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和脂质）和脂质）b.20 000g 高速离心高速离心30min,去除残留的小颗粒物质去除残留的小颗粒物质c.用用0.2 m微孔滤膜过滤，去除细菌、支原体微孔滤膜过滤，去除细菌、支原体d.饱和硫酸铵沉淀抗体（饱和硫酸铵沉淀抗体（50%饱和硫酸铵能回收饱和硫酸铵能回收90%以上的抗体以上的抗体）。）。第22页，此课件共73页哦（2 2）分离）分离 A A、凝胶过滤：用于、凝胶过滤：用于IgGIgG和和IgMIgM类。常用类。常用SephadexG 200 SephadexG 200 作为分离介质，可收集到作为分离介质，可收集到3 3个峰，最高峰为个峰，最高峰为IgMI
20、gM，另外两个峰为，另外两个峰为 IgGIgG。抗体回收率达。抗体回收率达5080%5080%，能去除污染的微，能去除污染的微量杂蛋白，抗体纯度可达量杂蛋白，抗体纯度可达95%95%以上。以上。B B、阴离子交换层析：用于、阴离子交换层析：用于IgGIgG类的分离纯化。在类的分离纯化。在pH7.4pH7.4条件下，条件下，IgG1IgG1和和IgG2IgG2能能结合在结合在DEAEDEAE填料上，其中填料上，其中IgG2aIgG2a可在较低离子强度下洗脱下来，其纯度很高。可在较低离子强度下洗脱下来，其纯度很高。IgG2bIgG2b和和IgG3IgG3在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提
21、高产量，但其纯度相在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。对较低。C C、亲和层析：多用蛋白、亲和层析：多用蛋白A A亲和层析。适用于亲和层析。适用于IgGIgG类。类。IgGIgG类与蛋白类与蛋白A A的结合与的结合与pH pH 有密切的关系。鼠源性单抗在有密切的关系。鼠源性单抗在 pH8.0pH8.0时，时，IgG2bIgG2b、IgG3IgG3几乎全部结合在蛋白几乎全部结合在蛋白 A A柱柱上，上，IgG1IgG1稍差，用稍差，用 pH3.5pH3.5缓冲液可洗脱下缓冲液可洗脱下 IgG2bIgG2b，pH4.0pH4.0缓冲液可洗脱下缓冲液可洗脱下 IgG
22、3IgG3，pH4.5pH4.5缓冲液可洗脱下缓冲液可洗脱下IgG2aIgG2a，pH6.0pH6.0可洗脱下可洗脱下IgG1IgG1。用蛋白。用蛋白A A亲和层析收获的抗体纯亲和层析收获的抗体纯度和很高，但也有极微量的杂蛋白。度和很高，但也有极微量的杂蛋白。第23页，此课件共73页哦二、鼠源性单克隆抗体的改造二、鼠源性单克隆抗体的改造 目的：一是降低免疫源性；目的：一是降低免疫源性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。二是降低相对分子量，增加组织通透性。原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（子的可变区（V V），生物功能则决定于抗体分子），生
23、物功能则决定于抗体分子的稳定区（的稳定区（C C）。）。第24页，此课件共73页哦第25页，此课件共73页哦第26页，此课件共73页哦第27页，此课件共73页哦第28页，此课件共73页哦鼠源性单克隆抗体的改造鼠源性单克隆抗体的改造 1 1、人、人鼠嵌合抗体（鼠嵌合抗体（chimeric antibodychimeric antibody）：把：把鼠源性单克隆抗体的鼠源性单克隆抗体的V V区基因分离出区基因分离出来，分别与来，分别与人人IgIg的的C C区区基因连接，即成为人基因连接，即成为人鼠嵌合抗体的基因，再共转染骨髓瘤细胞，鼠嵌合抗体的基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的就能表达出完
24、整的Chimeric Antibody.Chimeric Antibody.2 2、改型抗体、改型抗体(Reshaping antibody)(Reshaping antibody)：用：用鼠源性单克隆抗体的鼠源性单克隆抗体的CDRCDR序列替换人序列替换人 IgIg分子中的分子中的CDRCDR序列序列，则可使人的，则可使人的 IgIg分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源部分分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫源性。这种改型抗体也称只占很小比例，可基本消除免疫源性。这种改型抗体也称CDRCDR移植抗体移植抗体 (CDR g
25、rafting(CDR grafting antibody)antibody)。3 3、小分子抗体：小分子抗体仅表达、小分子抗体：小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的鼠源性单克隆抗体的V V区区片段，其相对分子质量仅为原片段，其相对分子质量仅为原抗体的抗体的1/801/31/801/3。(1)Fab(1)Fab片段抗体：片段抗体：V VH H+C+CH1H1 (3)(3)单链抗体：单链抗体：V VH H-Linker-V-Linker-VL L (2)FV (2)FV抗体：抗体：V VH H+V+VL L (4)(4)单域抗体：单域抗体：V VH H或或V VL L （5 5）最小识别单位（）最
26、小识别单位（MRUMRU）：单个）：单个CDRCDR区构成区构成 第29页，此课件共73页哦 4、双功能抗体：双特异性抗体、双功能抗体：双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb)。是。是一种非天然性抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。一种非天然性抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。5、抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功能抗体范畴。是、抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功能抗体范畴。是20世纪世纪90年代发展的研究领域。类型如下：年代发展的研究领域。类型如下：（1）配基）配基配基型融合蛋白，如配基型融合蛋白，如 CD4-Fc.（2）配基）配基Ig型嵌合抗体，如型嵌合抗体
27、，如 IL-2-Ig （3）配基）配基FV型嵌合蛋白，如型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 (4)受体受体FV型融合蛋白型融合蛋白 （5）酶）酶抗体型融合蛋白（抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶）抗体酶）第30页，此课件共73页哦第三节第三节 抗体工程抗体工程抗体研究的三个阶段：抗体研究的三个阶段：以以18901890年年BehringBehring发现白喉抗毒素为代表，其特点发现白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体多克隆抗体；以以19751975年年K Khlerhler创建杂交瘤技术制备创建杂交瘤技术制备单克隆抗体单克隆抗体为为代表；代表；以
28、以19941994年年WinterWinter完全用基因工程技术制备人源性抗体完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还能通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物，而且还能通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体。在此基础上发展成大规模生产抗体。在此基础上发展成抗体工程抗体工程。他。他创建了噬菌体抗体库技术创建了噬菌体抗体库技术,克服了人体不能随意免克服了人体不能随意免疫的缺点，用人外周血制备抗体文库，从而获得人源疫的缺点，用人外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体。性基因工程抗体。第31页，此课件共73页哦 一、噬菌体抗体库技术的基本方法一、噬菌体抗体库技术的基本方法 1、获取目
29、的基因、获取目的基因 2、抗体库技术的载体：、抗体库技术的载体：3、淘筛（、淘筛（panning）：）：4、表达与鉴定：。、表达与鉴定：。第32页，此课件共73页哦 1获取目的基因 提取RNA经反转录PCR(RTPCR)获取抗体某一特定基因区段，如重链和轻链可变区(VH、VL)基因。抗体基因的组合形式多为单链抗体SCFV，也用连接链(G4S)3组合成功能分子。第33页，此课件共73页哦 2抗体库技术的载体 现在普遍使用噬菌粒载体噬菌粒载体，它具有噬菌体和质粒的共同特点。因为它的转化效率高有利于提高文库容量。抗体蛋白和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式表达在载体表面，再感染后，能使目的克隆得以扩增。
30、琥珀终止码在适当位置上引人载体是抗体库的关键性技术。而克隆位点后的基因序列则有利于对可溶性表达产物的鉴定和纯化。第34页，此课件共73页哦 3淘筛 基本过程是，抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量地扩增目的克隆，且使目的克隆大量地扩增。4表达与鉴定 目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达。产物用Western-blot分析确定后，就完成了全过程。第35页，此课件共73页哦Western Blotting免疫印迹Western BlotWestern
31、Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针探针”是抗体，是抗体，“显色显色”用标记的二抗。经过用标记的二抗。经过PAGEPAGE分离分离的蛋白质样品，转移到固相载体（硝酸纤维素薄膜）上，固相的蛋白质样品，转移到固相载体（硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗原，与对应的抗体起免疫反
32、应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。平的表达。第36页，此课件共73页哦第37页，此课件共73页哦典型的印迹实验包括三个步骤：蛋白质的电泳分离电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上。免疫学检测。第38页，此课件共73页哦二、噬菌体抗体库技术的特点二、噬菌体抗体库技术的特点 1、模拟天然全套抗体库：抗体文库可以达到或超过、模拟天然全套抗体库：抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能
33、包含库容，所以能包含B细胞全部克隆。建库的细胞全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的反转录形成的cDNA扩增，这是人体多克隆细胞的扩增，这是人体多克隆细胞的总总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和和VL基因的随机重组也增加了基因的随机重组也增加了抗体的多样性。抗体的多样性。2、避开了人工免疫和杂交瘤技术：由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基、避开了人工免疫和杂交瘤技术：由于抗体库
34、的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。3、可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库技术中，、可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库技术中，VH和和VL基因的随机重组模拟了体内抗体基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。源化抗体。第39页，此课件共73页哦三、基因工程抗体的表达三、基因工程抗
35、体的表达 在筛选出阳性克隆后，按其目的不同，可选用原核细胞、真核细胞、转基因植物和动物等不同表达方式进行表达。1 1原核细胞表达原核细胞表达 抗体表达，又分融合表达融合表达和分泌型表达分泌型表达两种。融合表达有利于对抗体文库进行淘筛，且有利于对克隆和抗体活性进行鉴定。分泌型表达则利用琥珀终止密码的终止作用，在无琥珀抑制基因的菌株中进行表达，形成的可溶性抗体就是应用抗体。第40页，此课件共73页哦无义突变的三种昵称，三个终止密码子UAA叫赭石密码子；UAG叫琥珀密码子；UGA叫蛋白石密码子。琥珀突变琥珀突变（AAGUAGUAG）就是当ORF中的一个密码子突变为琥珀型终止子后，生物体采取了一种措施
36、，原来此密码子对应的反密码子也突变为与琥珀密码子配对，从而是ORF阅读后的产物和突变后的产物一样这样就对突变进行了抑制 第41页，此课件共73页哦 2 2真核细胞表达真核细胞表达 用于表达基因工程抗体的真核细胞有酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌等，而且这些细胞的表达都是分泌型表达分泌型表达。3 3转基因植物表达转基因植物表达 抗体基因能转入植物中表达，这方面研究较多且潜力较大的是烟草叶中的表达表达的抗体称为植物抗体。目前完整的抗体分子、单链抗体和Fab片段均已在烟草叶烟草叶和拟拟南芥菜南芥菜植物中得到表达，其产量可达植物叶片总蛋白量13，其高表达产量使抗体成本大幅度下降，而且转基因植物表达
37、可使抗体大规模农业化生产。4 4转基因动物表达转基因动物表达 即将人的Ig基因组转移到动物体内，让动物产生人源化抗体。目前只在单基因水平单基因水平上做转基因鼠的实验，大的基因片段的转移难度很大。第42页，此课件共73页哦 第四节第四节 抗体药物抗体药物一、抗体诊断试剂一、抗体诊断试剂二、抗体治疗药物二、抗体治疗药物第43页，此课件共73页哦 一、抗体诊断试剂一、抗体诊断试剂 抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某种反应。在体内，可表抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某种反应。在体内，可表现为现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故抗体类药物可用于治疗
38、。等作用，故抗体类药物可用于治疗。在体外，由于抗原性状和反应条件不同，可发生在体外，由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集或沉淀凝集或沉淀等可见反应，故等可见反应，故可用已知抗体来鉴定抗原，做病原学诊断和血型测定，称为血清学鉴定。抗体诊可用已知抗体来鉴定抗原，做病原学诊断和血型测定，称为血清学鉴定。抗体诊断药物基本分为三类：断药物基本分为三类：1、血清学鉴定抗体制剂。、血清学鉴定抗体制剂。2、免疫标记技术用的抗体制剂。、免疫标记技术用的抗体制剂。3、体内导向诊断抗体制剂。、体内导向诊断抗体制剂。习惯上体外试验用的称试剂，体内导向诊断用的称药物。习惯上体外试验用的称试剂，体内导向诊断用的称药物。
39、第44页，此课件共73页哦1 1、血清学鉴定用的抗体类试剂、血清学鉴定用的抗体类试剂 （1 1）鉴定病原菌用的抗体试剂）鉴定病原菌用的抗体试剂 A A、常用诊断血清的品种和用途、常用诊断血清的品种和用途 B B、诊断血清的制备步骤、诊断血清的制备步骤 a a、制备细菌抗原：细菌接种、制备细菌抗原：细菌接种-培养培养-收集菌苔收集菌苔-沸水沸水2.5h-2.5h-制成菌制成菌液。液。b b、免疫动物和制备抗体血清：抗原稀释后免疫动物：家兔、马、羊、免疫动物和制备抗体血清：抗原稀释后免疫动物：家兔、马、羊、豚鼠。豚鼠。免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数3-73
40、-7次，每次间隔次，每次间隔3-4d3-4d，末次注射后末次注射后6-8d6-8d取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。C C、诊断血清的诊断方法：直接凝集反应，镜检、诊断血清的诊断方法：直接凝集反应，镜检第45页，此课件共73页哦第46页，此课件共73页哦（2）乙型肝炎病毒表面抗原（）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂的反向被动血凝诊断试剂 A A、试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能、试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的吸附蛋白质，当纯化的抗抗HBs血清吸附其上时便具
41、有抗体活性，若待测样品中存在有血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。异性结合而使血细胞发生凝集。B、制备步骤：先用、制备步骤：先用HBsAg免疫豚鼠免疫豚鼠-获得抗获得抗HBs血清血清-硫酸铵盐析硫酸铵盐析/柱层析柱层析-取其取其 IgG-在在pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞-洗去多余蛋白成分，用含洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。稀释液稀释至一定浓度，分装即成。C、诊断方法：、诊断方法：RPHA（reverse passive hemagglutina
42、tion)反向被动血凝试反向被动血凝试验，即用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原验，即用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原 在在V型血凝板上进行，阴性样品不凝集，血细胞沉积于型血凝板上进行，阴性样品不凝集，血细胞沉积于V型孔底部，呈尖点状；阳性型孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集成块状。样品血细胞凝集成块状。第47页，此课件共73页哦（3 3）妊娠诊断试剂）妊娠诊断试剂 妇女妊娠后，血液和尿液中的妇女妊娠后，血液和尿液中的HCGHCG含量增含量增高，在高，在3 3个月内可达到高峰。此时检测尿个月内可达到高峰。此时检测尿液中的液中的HCGHCG，就可确定是否怀孕，就可确定是否怀孕（4 4）
43、抗）抗ABOABO血型系统血清血型系统血清第48页，此课件共73页哦为保证输血的安全，供血者和受血者均需检验血型并做血交叉反应。血型有多个系统，其中重要的是ABO血型系统。按人红细胞表面带有的A或B种凝集原可将血型分为A、B、AB和O型4种。单克隆抗体是应用B淋巴细胞杂交瘤技术生产抗A或抗B血清，以鉴别ABO血型。但单克隆抗体持异性极高，而血型物质又太复杂，易得出错误的结果，其阴性结果往往不能说明没有该血型物质，需用多株单克隆抗体混合才能克服这一缺点。但用单克隆抗体进行血型物质组成的研究，则是有用的工具。血型鉴定的方法，最常用的是玻片直接凝集方法第49页，此课件共73页哦第50页，此课件共73
44、页哦2 2、免疫标记技术用的抗体类试剂、免疫标记技术用的抗体类试剂 给抗体标记核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以给抗体标记核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外，还能为探讨发病机制提供手段。组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外，还能为探讨发病机制提供手段。（1）荧光抗体诊断试剂：荧光抗体是用荧光色素）荧光抗体诊断试剂：荧光抗体是用
45、荧光色素,如异硫氰酸荧光素（如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（）、罗丹明（RB200）、藻红素（、藻红素（PE）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。和定位的目的。（2）免疫酶抗体诊断试剂：用酶标记抗体检验抗原的方法）免疫酶抗体诊断试剂：用酶标记抗体检验抗原的方法 a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试
46、剂 b、HBeAg(乙型肝炎乙型肝炎e抗原抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂 c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂 d、测定、测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂 e、AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂（甲胎蛋白）酶标诊断试剂 用于原发性肝癌的辅助诊断用于原发性肝癌的辅助诊断 f、CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂（癌胚抗原）酶标诊断试剂 用于消化道恶性肿瘤的鉴别诊断用于消化道恶性肿瘤的鉴别诊断第51页，此课件共73页哦 免疫酶抗体诊断技术免疫酶抗体诊断技术 免疫酶技术是用酶标记抗体来检测抗原的方法。(1)免疫酶染色法（酶
47、标抗体）免疫酶染色法（酶标抗体）酶标抗体与抗原发生特异性结合，当加人酶的底物时，底物在酶的催化作用下发生反应，产生有色物质。该物质不需特殊仪器，在光学显微镜下即能观察。目前常用的酶是辣根过氧化物酶，底物为二氨基联苯胺两者作用可生成棕褐色沉淀物，使玻片上的抗原所在部分呈色。第52页，此课件共73页哦(2)酶免疫测定法酶免疫测定法 酶免疫测定是在液相内微量待检抗原物质的定量测定方法。是在液相内微量待检抗原物质的定量测定方法。用酶标记已知抗体或抗免疫球蛋白(抗抗体)，与待查抗原混合形成抗原抗体结合物后，加入酶的底物进行显色，根据呈色程度使用分光光度计测知待测物质的含量。酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试
48、验(ELSA)是酶免疫测定在方法上的一个重大改进，其特点是利用抗原或抗体等蛋内质容易吸附于聚苯乙烯塑料等表面的性质，使抗原抗体反应在塑料管使抗原抗体反应在塑料管(孔孔)壁表面上进行壁表面上进行，简化了抗 原抗体结合物的分离手续。本法用途广泛，敏感性高，既可定性检测微量抗原，也可定量测定微生物成分、激素等微量抗原物质。第53页，此课件共73页哦第54页，此课件共73页哦（3 3）放射免疫用抗体诊断试剂）放射免疫用抗体诊断试剂 把核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立把核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出的检测技术。能测出ng/mln
49、g/ml，甚至，甚至pg/mlpg/ml水平的微量抗原物质水平的微量抗原物质。常用的标记抗体试剂：常用的标记抗体试剂：a、HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度标记，灵敏度0.1 ng/ml b、HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂：抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度标记，灵敏度0.1 ng/ml。e抗原为阳性表明病毒正在大量的繁殖，而且病毒数量比较的多，传染性强，需要马上治疗。c、HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂：抗原放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记标记 d、AFP放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125
50、I 标记，灵敏度标记，灵敏度15 ng/ml e、CEA放射性核素标记抗体诊断试剂：放射性核素标记抗体诊断试剂：125I 标记，灵敏度标记，灵敏度1 ng/第55页，此课件共73页哦3、导向诊断药物、导向诊断药物 由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，所以导向药物还未在临床广泛究之中，所以导向药物还未在临床广泛应用。应用。第56页，此课件共73页哦（1）放射免疫显像的优点）放射免疫显像的优点：在体内有确切定位肿瘤的作用准确性可达90以上，灵敏度几乎达100。在体内可检出05cm大小的病灶，并可检出肺、脑等部位的转移灶。小分子抗体容易到达肿瘤部位，可明显提高T(