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1、关于基因克隆的质粒载体第一页，讲稿共一百二十一页哦目的基因目的基因克隆载体克隆载体工具酶工具酶受体系统受体系统第二页，讲稿共一百二十一页哦 单独的基因不易进入细胞单独的基因不易进入细胞 进入后不能维持进入后不能维持.三、什么是克隆载体？三、什么是克隆载体？vector通过不同途径能将承载的外源通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受片段带入受体细胞，并在其中得以维持的体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为分子称为DNA克隆载体或基因克隆载体。克隆载体或基因克隆载体。第三页，讲稿共一百二十一页哦载体具有如下功能载体具有如下功能:1.1.运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞
2、2.2.为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力3.3.为外源基因的扩增或表达提供条件为外源基因的扩增或表达提供条件 第四页，讲稿共一百二十一页哦1.1.有有1 1至多个克隆位点，供外源至多个克隆位点，供外源DNADNA片段组入克隆载体片段组入克隆载体DNADNA分子。分子。2.2.能自我复制，或整合到染色体能自我复制，或整合到染色体DNADNA上随染色体上随染色体DNADNA的复制而同步复制的复制而同步复制。3.3.必须具有用于选择克隆子的标记基因。必须具有用于选择克隆子的标记基因。4.4.必须是安全的。必须是安全的。第五页，讲稿共一百二十一页哦根据来源可分为：根据来
3、源可分为：质粒载体质粒载体 病毒或噬菌体载体病毒或噬菌体载体 质粒质粒DNA与病毒或噬菌体与病毒或噬菌体DNA组成的克隆载体组成的克隆载体 质粒质粒DNA与染色体与染色体DNA片段组成的克隆载体等片段组成的克隆载体等第六页，讲稿共一百二十一页哦第七页，讲稿共一百二十一页哦第八页，讲稿共一百二十一页哦第九页，讲稿共一百二十一页哦第十页，讲稿共一百二十一页哦第十一页，讲稿共一百二十一页哦根据其复制或存在方式根据其复制或存在方式可分为可分为:自主复制型载体和附自主复制型载体和附加载体加载体 第十二页，讲稿共一百二十一页哦第十三页，讲稿共一百二十一页哦质粒是存在于质粒是存在于细胞质细胞质中的一类中的一
4、类独立于染色体独立于染色体的的自主复制自主复制的的遗传成份遗传成份.Plasmid一词由一词由Joshua Lederberg于于1952年提出。年提出。质粒的命名质粒的命名:例例:pBR322一、与构建克隆载体相关的质粒性质一、与构建克隆载体相关的质粒性质p代表质粒代表质粒;“BR”代表两位研究者代表两位研究者Bolivar和和Rogigerus姓氏的字首姓氏的字首,“322”是实验编号是实验编号.第十四页，讲稿共一百二十一页哦已在形形色色的细菌类群中发现，大多数质粒的宿主范围已在形形色色的细菌类群中发现，大多数质粒的宿主范围较窄，只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。较窄，只能生存于亲缘
5、关系很近的少数细菌种类中。是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝并将质粒分子精确地分配给子代细胞。并将质粒分子精确地分配给子代细胞。1.质粒的特点：质粒的特点：第十五页，讲稿共一百二十一页哦其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。这些基因可赋予宿主迥然不同的特征，其中不少具有这些基因可赋予宿主迥然不同
6、的特征，其中不少具有重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生抗生重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生抗生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶，以及降解复素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶，以及降解复杂的有机化合物等。杂的有机化合物等。第十六页，讲稿共一百二十一页哦质粒通过合成长质粒通过合成长效致死物和短效效致死物和短效解毒剂得以在细解毒剂得以在细菌中生存菌中生存.第十七页，讲稿共一百二十一页哦第十八页，讲稿共一百二十一页哦第十九页，讲稿共一百二十一页哦第二十页，讲稿共一百二十一页哦什么是超螺旋什么是超螺旋(superhelix 或或supercoil)？DNADNA是以双
7、螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺 旋旋DNADNA的这个轴再弯曲缠绕时，的这个轴再弯曲缠绕时，DNADNA就处于超螺旋状态，就处于超螺旋状态，DNADNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNADNA三级结构三级结构 的一个重要特征。的一个重要特征。正超螺旋正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与盘绕方向与DNA双螺旋方同相同双螺旋方同相同 负超螺旋负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与盘绕方向与DNA双螺旋方向相反双螺旋方向相反 第二十一页，讲稿共一百二十一页哦第二十二页
8、，讲稿共一百二十一页哦第二十三页，讲稿共一百二十一页哦5、质粒的类型质粒的类型第二十四页，讲稿共一百二十一页哦F质粒的质粒的tra区包含细菌接合所需的基因区包含细菌接合所需的基因第二十五页，讲稿共一百二十一页哦第二十六页，讲稿共一百二十一页哦质粒的转移与迁移质粒的转移与迁移.转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞.迁移则指本身不能转移迁移则指本身不能转移,在另一个接合型质粒存在下在另一个接合型质粒存在下,从一个细从一个细胞移至另一种细胞胞移至另一种细胞.质粒迁移的条件质粒迁移的条件（自身编码）（自身编码）bom位点位点(col E1
9、)nic 位点位点.mob基因基因.结合动员基因结合动员基因.编码迁移蛋白编码迁移蛋白,实质是一种核酸酶实质是一种核酸酶,切割切割nic位点位点.迁移作用迁移作用(mobiligation):由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.第二十七页，讲稿共一百二十一页哦第二十八页，讲稿共一百二十一页哦因为从理论上存在着发生使跨越生物种间遗传屏障因为从理论上存在着发生使跨越生物种间遗传屏障的潜在危险的潜在危险.而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另一种细胞一种细胞,这种方法叫这种方法叫三亲杂
10、交法三亲杂交法.一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌 三者共培养过夜三者共培养过夜.在基因工程中得到大量的应用在基因工程中得到大量的应用.第二十九页，讲稿共一百二十一页哦辅助质粒重组质粒供体细胞 受体细胞接合DNA转移三亲杂交法三亲杂交法第三十页，讲稿共一百二十一页哦第三十一页，讲稿共一百二十一页哦第三十二页，讲稿共一百二十一页哦根据质粒的表现分为根据质粒的表现分为:定义：质粒除了与控制本身复制和转移相关的基因外，定义：质粒除了与控制本身复制和转移相关的基因外，有的质粒还携带一些其他的基因，宿主细胞由于含有有的质粒还携带一些其他的基因，宿主细胞由于含有这样的质粒而呈
11、现出新的性状，这样的质粒称为显性质这样的质粒而呈现出新的性状，这样的质粒称为显性质粒。粒。相反，即使宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表露，相反，即使宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表露，这样的质粒称为隐蔽质粒。这样的质粒称为隐蔽质粒。受检测手段的限制，现定为隐蔽型的质粒未必是真正的受检测手段的限制，现定为隐蔽型的质粒未必是真正的隐蔽质粒。隐蔽质粒。显性质粒和隐蔽质粒显性质粒和隐蔽质粒第三十三页，讲稿共一百二十一页哦人工构建的质粒根据其功能及用途分为:(1)多拷贝质粒多拷贝质粒 (2)测序质粒测序质粒 (3)整合质粒整合质粒 (4)穿梭质粒穿梭质粒 (5)表达质粒表达质粒 (6)探针质粒探针
12、质粒第三十四页，讲稿共一百二十一页哦质粒的复制子决定其拷贝数。质粒的复制子决定其拷贝数。复制子是一个遗传单位，包括复制子是一个遗传单位，包括DNA复制起点复制起点,相关的调控相关的调控元件元件,复制终点。复制终点。复制起点是一段特定的复制起点是一段特定的DNA片段，长约几百碱基对，其相关片段，长约几百碱基对，其相关的顺式作用调控元件中含有参与的顺式作用调控元件中含有参与DNA合成起始的由质粒或宿合成起始的由质粒或宿主编码的可扩散因子的结合位点。主编码的可扩散因子的结合位点。定义：质粒定义：质粒DNA中能自主复制并维持正常拷贝数的一段最小中能自主复制并维持正常拷贝数的一段最小的核酸序列单位。的核
13、酸序列单位。第三十五页，讲稿共一百二十一页哦 与一个起始点相连而没有被终点隔断的任何序列与一个起始点相连而没有被终点隔断的任何序列,都是作为复制子的一部分而被复制都是作为复制子的一部分而被复制.起始点是一种顺式作用位点起始点是一种顺式作用位点,只能作用于该位点所只能作用于该位点所在的在的DNA分子分子.第三十六页，讲稿共一百二十一页哦质粒的拷贝数定义质粒的拷贝数定义:(1)通常定义通常定义:生长在标准培养条件下生长在标准培养条件下(LB培养基培养基)每个细菌细胞每个细菌细胞中平均所含有的质粒的拷贝数中平均所含有的质粒的拷贝数.(2)特殊定义特殊定义:在营养富有余的培养基中在营养富有余的培养基中
14、,每个细胞当中每条每个细胞当中每条染色体所拥有的平均质粒染色体所拥有的平均质粒DNA分子数分子数.(3)中定义中定义:在在LB液体培养基中生长的每个细胞液体培养基中生长的每个细胞,如果具有如果具有20个及以上的个及以上的质粒质粒DNA分子分子,就叫高拷贝质粒就叫高拷贝质粒,如果低于如果低于20个则叫低拷贝质个则叫低拷贝质粒粒.第三十七页，讲稿共一百二十一页哦 质粒就其复制方式而言分为两类：质粒就其复制方式而言分为两类：严紧型严紧型（stringent plasmid)每个寄主细胞中仅有份的拷每个寄主细胞中仅有份的拷贝。贝。松弛型松弛型（relaxed plasmid)每个寄主细胞中仅有份的每个
15、寄主细胞中仅有份的拷贝。拷贝。一般接合型的质粒是严紧型，具有较高的分子量。而非接合型一般接合型的质粒是严紧型，具有较高的分子量。而非接合型的质粒是松驰型的，具有较低的分子量。的质粒是松驰型的，具有较低的分子量。例外例外，接合型的质粒，接合型的质粒6K分子量较小分子量较小，为松驰型。，为松驰型。质粒中已鉴定的复制子已逾质粒中已鉴定的复制子已逾30个，但分子克隆中常用的几个，但分子克隆中常用的几乎都带有一个来源于乎都带有一个来源于pMB1的复制子，可使每个细菌细胞中维持的复制子，可使每个细菌细胞中维持个拷贝。个拷贝。第三十八页，讲稿共一百二十一页哦即同一种质粒在不同的寄主类型中可能属于严紧型的，也
16、可能属于松驰型的。如ColE1-K30在大肠杆菌中属于松弛型的,在奇异变形杆菌中是严紧型的。第三十九页，讲稿共一百二十一页哦氯霉素扩增氯霉素扩增:pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。第四十页，讲稿共一百二十一页哦 另外两种质粒（另外两种
17、质粒（psc101和和p15A）的复制子）的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。复制。第四十一页，讲稿共一百二十一页哦第四十二页，讲稿共一百二十一页哦第四十三页，讲稿共一百二十一页哦第四十四页，讲稿共一百二十一页哦指指在没有选择压力下在没有选择压力下，两种，两种亲缘关系密切亲缘关系密切的不同质粒，的不同质粒，不能够共存于同一个寄主细胞系中的现象。不能够共存于同一个寄主细胞系中的现象。只有当两种只有当两种质粒在同一寄主细胞中都不受限制时质粒在同一寄主细胞中都不受
18、限制时，才能判断。，才能判断。亲缘关系较近的质粒，彼此之间互不相容，它们属于同亲缘关系较近的质粒，彼此之间互不相容，它们属于同一种不亲和群。一种不亲和群。大肠杆菌质粒中至少已鉴别出种以上的不亲和群。大肠杆菌质粒中至少已鉴别出种以上的不亲和群。第四十五页，讲稿共一百二十一页哦 质粒不相容性现象与质粒的拷贝数及分离的调控有关。质粒不相容性现象与质粒的拷贝数及分离的调控有关。携带相同复制子的不同质粒属于同一不相容组。带有携带相同复制子的不同质粒属于同一不相容组。带有不可互换成分的复制子的质粒则属于不同的不相容组。不可互换成分的复制子的质粒则属于不同的不相容组。大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻
19、遏蛋白质，大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度与质粒的拷贝数成正比。其浓度与质粒的拷贝数成正比。阻遏蛋白通过同其靶序列间的相互作用，使双链阻遏蛋白通过同其靶序列间的相互作用，使双链中的一条断裂从而导致质粒复制的启动。并建立起一中的一条断裂从而导致质粒复制的启动。并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环。当质粒面临高拷贝数和高种调节质粒拷贝数的负反馈环。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。反之，复制浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。反之，复制反应继续进行。反应继续进行。第四十六页，讲稿共一百二十一页哦第四十七页，讲稿共一百二十一页哦(1)(1)氯化
20、铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法(2)(2)碱变性法碱变性法(3)(3)微量碱变性法微量碱变性法第四十八页，讲稿共一百二十一页哦氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法1 1、质粒、质粒DNADNA占总占总DNADNA的的1%1%2%2%；2 2、在细胞裂解及、在细胞裂解及DNADNA分离过程中，大分子量的分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质粒细菌染色体易断裂成线性片段，而质粒DNADNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；3 3、染色剂溴化乙锭（、染色剂溴化乙锭（EBEB）能掺入到）能掺入到DNADNA链的碱链的碱基中，导致链的解旋；
21、而且形成的基中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNAEB-DNA复复合物中，合物中，EBEB含量越高，密度会越低。含量越高，密度会越低。第四十九页，讲稿共一百二十一页哦流程：流程：首先加入首先加入溶菌酶溶菌酶或或十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（SDSSDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。来促进大肠杆菌的细胞裂解。将将溴化乙锭溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，杆菌裂解液中，EBEB会嵌入到会嵌入到DNADNA链的碱基中链的碱基中去。去。在在EBEB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。心。第五十页，讲稿共一百二十一页哦第五十一页，讲
22、稿共一百二十一页哦第五十二页，讲稿共一百二十一页哦碱变性法：碱变性法：根据共价闭合环状质粒根据共价闭合环状质粒DNADNA与线性染色体与线性染色体DNADNA片段片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在在PHPH值值12.012.012.512.5范围内时，范围内时，线性的线性的DNADNA会被变会被变性性而而共价闭合环状质粒共价闭合环状质粒DNADNA却不会被变性却不会被变性。通过冷却或恢复中性通过冷却或恢复中性PHPH值使之复性，值使之复性，线性染色线性染色体形成体形成网状网状结构结构，而而cccDNAcccDNA可以准确迅速复性可以准确迅速复性，通过
23、离心通过离心去除线性染色体去除线性染色体，获得含有，获得含有cccDNAcccDNA的上清的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNADNA第五十三页，讲稿共一百二十一页哦流程：流程：1 1、取、取1.51.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；离心管中，离心收集细胞沉淀；2 2、加入、加入100100微升冰冷的微升冰冷的液，（液，（50mM50mM葡萄糖葡萄糖，25mM 25mM Tris-HCl PH=8.0,10mM Tris-HCl PH=8.0,10mM EDTAEDTA，45mg45mg
24、溶菌酶）静溶菌酶）静置置5 5分钟；分钟；3 3、加入、加入200200微升微冷的微升微冷的液（液（0.2NaOH0.2NaOH，1.0%SDS1.0%SDS）缓缓缓缓混匀置室温混匀置室温5 5分钟。分钟。65 65度水浴一段时间会加强染色体度水浴一段时间会加强染色体DNADNA的变性作用。的变性作用。4 4、加入、加入150150毫升冰冷的毫升冰冷的PH=4.8PH=4.8的的3M3M醋酸钠醋酸钠，振荡后，振荡后，冰浴冰浴5 5分钟。分钟。5 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNADNA。第五十四页，讲稿共一百二十一页哦影响质
25、粒影响质粒DNADNA产量的因素：产量的因素：1 1、寄主寄主菌株的遗传背景菌株的遗传背景 使用使用endAendA基因发生突变的菌株，编码核酸内切酶基因发生突变的菌株，编码核酸内切酶从野生型的菌株中提取质粒须采取的措施从野生型的菌株中提取质粒须采取的措施：选择最适的培养条件，以限制在细胞生长期间，体选择最适的培养条件，以限制在细胞生长期间，体内核酸内切酶内核酸内切酶 的表达；的表达；在纯化质粒在纯化质粒DNADNA的过程中，用加热法的过程中，用加热法核酸内切酶核酸内切酶使失活；使失活；采用最佳的实验流程，减少采用最佳的实验流程，减少核酸内切酶核酸内切酶的污染的污染并在纯化了质粒并在纯化了质粒
26、DNADNA之后，迅速除去污染的核酸酶。之后，迅速除去污染的核酸酶。第五十五页，讲稿共一百二十一页哦 2 2、质粒的、质粒的拷贝数拷贝数及分子的大小及分子的大小 插入分子量大的外源插入分子量大的外源DNADNA会引起质粒拷会引起质粒拷贝数的下降。贝数的下降。第五十六页，讲稿共一百二十一页哦 第五十七页，讲稿共一百二十一页哦构建质粒克隆载体的基本策略：构建质粒克隆载体的基本策略：()质粒载体应该能在转化的受体细胞中进行有效的复制。质粒载体应该能在转化的受体细胞中进行有效的复制。作为质粒的克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。作为质粒的克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。所以含有能在受体
27、细胞内有效复制的质粒复制起始位点所以含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点（ori)，最好是松弛型质粒的复制起始位点。最好是松弛型质粒的复制起始位点。()必须含有允许外源必须含有允许外源DNA片段克隆的位点，且这样的片段克隆的位点，且这样的克隆位点尽可能多。克隆位点尽可能多。为了便于多种类型末端的为了便于多种类型末端的DNA片段的克隆，质粒克隆片段的克隆，质粒克隆载体中往往组装一个含多种限制性核酸内切酶识别序列的载体中往往组装一个含多种限制性核酸内切酶识别序列的多克隆位点多克隆位点(MCS)连杆。连杆。第五十八页，讲稿共一百二十一页哦()必须含有供选择克隆子的标记基因。必须含有供选择克隆
28、子的标记基因。(4)质粒载体本身质粒载体本身DNA分子应尽可能小。分子应尽可能小。()根据需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种根据需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种元件元件，构建，构建成不同用途的质粒克隆载体。成不同用途的质粒克隆载体。如在克隆位点上游组装强的启动子，下游组装相应的终止如在克隆位点上游组装强的启动子，下游组装相应的终止子，就成为强表达质粒克隆载体。或者在质粒克隆载体的合适子，就成为强表达质粒克隆载体。或者在质粒克隆载体的合适位置组入受体细胞染色体位置组入受体细胞染色体DNA的同源序列，成为基因整合平台的同源序列，成为基因整合平台系统的供体质粒克隆载体。系统的供体质粒克隆载体。
29、第五十九页，讲稿共一百二十一页哦质粒克隆载体的设计和构建过程应遵循的原则质粒克隆载体的设计和构建过程应遵循的原则：()选用合适的出发质粒。选用合适的出发质粒。()正确获得构建质粒克隆载体的元件。正确获得构建质粒克隆载体的元件。()组装合适的选择标记基因。组装合适的选择标记基因。()选用合适的启动子。选用合适的启动子。()在能达到预期目的前提下，构建过程应力求简单。在能达到预期目的前提下，构建过程应力求简单。第六十页，讲稿共一百二十一页哦（三）、质粒载体的构建与类型（三）、质粒载体的构建与类型 1.1.天然质粒天然质粒：没有经过以基因克隆为目标：没有经过以基因克隆为目标 的体外修饰改造的质粒。的
30、体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有然质粒有EolE1、RSF2124和和pSC101等，但存等，但存在一定的局限性。在一定的局限性。第六十一页，讲稿共一百二十一页哦 第一个第一个用于基因克隆的天然质粒用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含有一个，它含有一个EcoR酶切位点，一酶切位点，一个四环素抗性选择记号（个四环素抗性选择记号（Tetr），插入外源片），插入外源片段后不影响其复制功能，但该质粒段后不影响其复制功能，但该质粒分子量较大分子量较大，拷贝数低拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，只具有抗菌素抗性基因，无法使用无法使用插
31、入失活技术插入失活技术选择重组分子。选择重组分子。第六十二页，讲稿共一百二十一页哦 ColE1 ColE1质粒在其唯一的单切割位点质粒在其唯一的单切割位点EcoRlEcoRl中克中克隆外源隆外源DNADNA片段后，可根据对大肠杆菌素片段后，可根据对大肠杆菌素E1E1的免的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素E1E1的菌落的菌落是具有重组质粒的转化子。是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌素但对大肠杆菌素E1E1的的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。第六十三页，讲稿共一百二十一页哦2.2.理想的质粒载体必须具备的基本条件理想的质粒载体
32、必须具备的基本条件 (1)具有复制起点具有复制起点 自我增殖的基本条件，一般具自我增殖的基本条件，一般具一个一个复制子。复制子。(2)具有抗菌素抗性具有抗菌素抗性 理想的质粒载体具有理想的质粒载体具有两种两种抗菌素抗性基因。抗菌素抗性基因。(3)具有若干限制酶切具有若干限制酶切单一单一位点（位点（MCS）(4)具有较小的分子量和较高的拷贝数具有较小的分子量和较高的拷贝数 低分子量的质粒易于操作，克隆外源片段后仍能低分子量的质粒易于操作，克隆外源片段后仍能有效的转化给受体细胞，同时低分子量的质粒对限制有效的转化给受体细胞，同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数，酶具
33、有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数，可获得大量的克隆基因。可获得大量的克隆基因。第六十四页，讲稿共一百二十一页哦以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。（4363bp）第六十五页，讲稿共一百二十一页哦 3.质粒载体的选择记号质粒载体的选择记号 新陈代谢特性；新陈代谢特性；对大肠杆菌素对大肠杆菌素E1的免疫性；的免疫性；抗菌素抗性；抗菌素抗性；四环素抗性、氨苄青霉素抗性、四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素抗性链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因；大多数质粒本身带有抗菌素基因；
34、抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。第六十六页，讲稿共一百二十一页哦二、质粒载体的选择标记第六十七页，讲稿共一百二十一页哦4.4.不同类型的质粒载体不同类型的质粒载体（1 1）高拷贝的质粒载体高拷贝的质粒载体 克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因（2 2）低拷贝的质粒载体低拷贝的质粒载体 有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码编码表面结构蛋白质表面结构蛋白质的一些基因、调节的一些基因、调节细胞基础代谢细胞基
35、础代谢活活动的蛋白质编码基因以及动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编编码基因等。码基因等。第六十八页，讲稿共一百二十一页哦 (3)(3)失控的质粒载体失控的质粒载体 复制控制是复制控制是温度敏感型温度敏感型的的低拷贝低拷贝的质粒。的质粒。ExampleExample：pBEU1 pBEU1和和pBEU2pBEU2质粒，在质粒，在3030度下，每个寄主细胞只含有度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过适量的拷贝数，当培养温度超过3535度时，质粒的复制将失去度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，控制，每个细
36、胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续2323小时小时。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒存活能力，积累的质粒DNADNA占细胞总占细胞总DNADNA的的50%50%。第六十九页，讲稿共一百二十一页哦(4)(4)插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体 将外源将外源DNA片段插入在质粒上会导致片段插入在质粒上会导致选择记号基因失活选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的
37、素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。机会。ExampleExample：在在pBR329质粒载体的质粒载体的EcoR1位点插入外位点插入外源片段，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的源片段，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片段的重组体质粒的几率会显著上升。段的重组体质粒的几率会显著上升。第七十页，讲稿共一百二十一页哦(5)(5)正选择的质粒载体正选择的质粒载体正向选择：应用只有突变体或重组体才能正常生长正向选择：应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养条件进行选择。这种质粒载体具有直接选的培养条件进行选择。这种
38、质粒载体具有直接选择记号并可择记号并可 赋予寄主细胞相应的表型。赋予寄主细胞相应的表型。第七十一页，讲稿共一百二十一页哦ExampleExample：质粒质粒pKN80pKN80有来自有来自MuMu噬菌噬菌体体DNADNA的的EcoR1-CEcoR1-C的片段，的片段，编码一种致死功能的编码一种致死功能的kilkil基基因。因。该质粒在该质粒在MuMu噬菌体的噬菌体的溶源溶源菌株中正常复制菌株中正常复制；在；在非非溶源菌株中是致死溶源菌株中是致死的。的。在在HindHind 或或Hpa Hpa 位点插位点插入外源入外源DNADNA片段后，片段后，会产生具会产生具AmpAmpr表型的表型的MuM
39、u噬菌体的噬菌体的非溶源的转非溶源的转化子菌株化子菌株。第七十二页，讲稿共一百二十一页哦正向选择质粒载体的条件限制：正向选择质粒载体的条件限制：1、需要特殊的寄主菌株或选择培养基、需要特殊的寄主菌株或选择培养基 2、可使用的克隆位点少、可使用的克隆位点少 3、假阳性水平高假阳性水平高 4、不能够调节插入序列表达活性、不能够调节插入序列表达活性第七十三页，讲稿共一百二十一页哦 (6)表达型的质粒载体表达型的质粒载体表达载体：表达载体：按特殊设计构建的，能按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正
40、常转录并转译成相应蛋白质的中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。克隆载体。第七十四页，讲稿共一百二十一页哦主要包括：大肠杆菌的主要包括：大肠杆菌的启动子启动子、及、及操纵位操纵位点序列点序列、多克隆位点多克隆位点、转录及转译信号转录及转译信号、质粒载体的质粒载体的复制起点复制起点及及抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因。待表达的真核基因编码序列被克隆待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，而且必须是其编码的蛋白质而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末端氨基酸末端这一头靠近启动子方向插入这一头靠近启动子方向插入，才能在启动，才能在启动子控制下进行有效
41、的转录。子控制下进行有效的转录。第七十五页，讲稿共一百二十一页哦 第七十六页，讲稿共一百二十一页哦四、重要的大肠杆菌质粒载体四、重要的大肠杆菌质粒载体 1 1、pSC101pSC101质粒载体；质粒载体；2 2、ColE ColE 质粒载体；质粒载体；3 3、pBR322pBR322质粒载体；质粒载体；4 4、pUCpUC质粒载体；质粒载体；5.5.其它的重要的质粒载体其它的重要的质粒载体第七十七页，讲稿共一百二十一页哦1.1.pSC101pSC101质粒载体质粒载体 一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有粒载体。平均每个寄
42、主细胞仅有1212个拷贝；分个拷贝；分子量子量9.09kb9.09kb，编码有一个四环素抗性基因，编码有一个四环素抗性基因（tettetr r ）。有）。有HindHind 、EcoREcoR、BamH BamH 、Sal Sal 、Xho Xho 、PvuPvu、Sma Sma 7 7种核酸内切种核酸内切限制酶。限制酶。其中在其中在HindHind 、BamH BamH、Sma Sma 3 3个位点克隆外源个位点克隆外源DNADNA，都会导致，都会导致tettetr r 基因基因失活失活。是第一个真核生物的克隆载体。是第一个真核生物的克隆载体。第七十八页，讲稿共一百二十一页哦第七十九页，讲稿
43、共一百二十一页哦（1）应用pSC101质粒作基因克隆载体 葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达 金黄色葡萄球菌的质粒p1258,编码若干种能 在大肠杆菌检测的结构基因；能被核酸限制酶 EcoR 切割成4段。第八十页，讲稿共一百二十一页哦第八十一页，讲稿共一百二十一页哦（2）应用pSC101质粒作基因克隆载体 在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA 用核酸内切酶EcoR 消化非洲爪蟾的核糖体DNA（rDNA），与EcoR 消化的pSC101质粒进行重组。在挑取的55个转化子中，经 EcoR 酶切，电泳后13个转化子含有外源片段。转化率23.6第八十二页，讲稿共一百二十一页哦第八十三页，讲稿共一百二十一页哦
44、2.2.ColE ColE 1 1质粒载体质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝的质粒，能产生细菌素。细菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用（复制、转录、转译能量代谢等）。但含有对细菌素的免疫基因。第八十四页，讲稿共一百二十一页哦第八十五页，讲稿共一百二十一页哦 用 ColE 1质粒特征为基础建立的转化细胞系，存在一定的缺陷性：1、应用大肠杆菌素免疫作为标记操作上不方便；2、在细菌群体中，能够以相当高的频率自发的产生出抗菌素的突变体细胞。第八十六页，讲稿共一百二十一页哦3.pBR322质粒载体 四环素抗性基因氨苄青霉素 抗性基因O r i Pst Sal Pvu Ava Bam HHind Eco
45、 RpBR322(amp(ampr r)(ter(terr r)第八十七页，讲稿共一百二十一页哦pBR322pBR322的构建：的构建：为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能力）。的稳定性（克服质粒的结合转移能力）。第八十八页，讲稿共一百二十一页哦第八十九页，讲稿共一百二十一页哦pBR322pBR322的结构来源的结构来源第九十页，讲稿共一百
46、二十一页哦pBR322pBR322质粒载体的质粒载体的优点优点：1 1、具有较小的分子量、具有较小的分子量 它的分子量为它的分子量为4363bp4363bp。克隆载体的分子量大小不要超。克隆载体的分子量大小不要超过过10kb10kb。2 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号号 pBR322 DNApBR322 DNA分子中总共有分子中总共有2424种核酸内切酶只具种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中有单一的酶切识别位点。其中7 7种内切酶的识别位点在四种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，环素抗性基因内部，2 2种识别位点在于这个基
47、因的启动区内，种识别位点在于这个基因的启动区内，所以所以9 9个限制酶切位点插入外源片段可以导致个限制酶切位点插入外源片段可以导致tettetr r 基因的基因的失活失活；另外有；另外有3 3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点。识别位点。第九十一页，讲稿共一百二十一页哦Example:a.在pBR322质粒的BamH或Sal位点插入外源DNA片段，切断了tettetr r基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出Ampr rTets s表型的重组pBR322质粒，转化入Amps sTets s的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选
48、出具Ampr r菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片段的重组质粒不能在这种培养基上生长。第九十二页，讲稿共一百二十一页哦B X BBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX第九十三页，讲稿共一百二十一页哦 b.在Pst或Sca识别位点插入外源片断会导致Ampr r基因的失活，产生Amps sTetr r表型的质粒。转化大肠杆菌之后，获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Ampr r表型的细胞可以合成 内酰胺酶，它能使青霉素转变成青霉酮酸，而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子，经37
49、度培养过夜后，在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素 内酰胺酶Ampr r的菌落，其周围的碘指示剂溶液变得明亮，而Amps s菌落无此反应。第九十四页，讲稿共一百二十一页哦 3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累10003000个拷贝。第九十五页，讲稿共一百二十一页哦 pBR322pBR322质粒载体的质粒载体的改良改良 为了更加实用，人们对为了更加实用，人们对pBR322pBR322质粒进行了质粒进行了改良，得到许多改良，得到许多pBR322pBR322质粒衍生质粒，它们各质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。自具有不同的特点。第九十六页，讲稿共一百二十一页哦应用应
50、用pBR322pBR322质粒作为基因克隆载体质粒作为基因克隆载体 水稻叶绿体光诱导基因水稻叶绿体光诱导基因psbApsbA的结构分析的结构分析 基因基因psbApsbA编码的蛋白质，与光合作用系统编码的蛋白质，与光合作用系统相关相关，并且它能与除草剂阿特拉津结合，并且它能与除草剂阿特拉津结合，它的第它的第264264位氨基位氨基酸发生取代反应，由丝氨酸变为甘氨酸，可导致其酸发生取代反应，由丝氨酸变为甘氨酸，可导致其失去与失去与除草剂阿特拉津结合的能力除草剂阿特拉津结合的能力，推测是三维结，推测是三维结构发生了改变构发生了改变 ；在原生生物衣藻、蓝色细菌中，；在原生生物衣藻、蓝色细菌中，此蛋白