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1、基因克隆的载体质粒第一页，讲稿共四十九页哦第二页，讲稿共四十九页哦 载体载体（vectorvector）是指能携带）是指能携带外源基因进入宿主细胞的运载工外源基因进入宿主细胞的运载工具。具。早期：质粒、病毒、噬菌体早期：质粒、病毒、噬菌体 新增：人工微小染色体、新增：人工微小染色体、YACYAC载体载体第三页，讲稿共四十九页哦作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：1 1、具备、具备自主复制的能力自主复制的能力；即能独立于染色体而进行自主复制；即能独立于染色体而进行自主复制；2 2、具有合适的、具有合适的选择标记选择标记，便于重组，便于重组DNADN
2、A分子的检测；分子的检测；3 3、要有尽可能多种、要有尽可能多种限制酶的切割位点限制酶的切割位点，便于外源基因插入，便于外源基因插入；4 4、载体分子中有一段不影响它们扩增的、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域非必须区域，插入其，插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增；增；5 5、具有较好的、具有较好的安全性安全性，不能任意转移，避免基因非控制性，不能任意转移，避免基因非控制性扩增。扩增。第四页，讲稿共四十九页哦第五页，讲稿共四十九页哦第六页，讲稿共四十九页哦质粒质粒*受体细胞受体细胞结构结构插入片断插入片断举例举例 E
3、.coliE.coli环状环状 8kb 8kbp pUCUC18/19,T-18/19,T-载体载体pGEM-3zpGEM-3z等等 噬菌体噬菌体E.coliE.coli线状线状9-24kb9-24kbEMBLEMBL系列，系列，gt gt系列系列丝状噬菌体及噬菌粒丝状噬菌体及噬菌粒E.coliE.coli环状环状 10 kb 10 kbM13mpM13mp系列系列粘粒载体粘粒载体E.coliE.coli环状环状35-45kb35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCV pWE15/16,pCV BAC(Bacteria
4、l BAC(Bacterial Artificial ChroArtificial Chromomosome)some)E.coliE.coli环状环状300 kb300 kbPel oBACPel oBAC系列系列PAC(P1-derived PAC(P1-derived Artificial chromosome)Artificial chromosome)E.coliE.coli环状环状100-2000 kb100-2000 kbPCYPAC1PCYPAC1YAC(Yeast Artificial YAC(Yeast Artificial chromosome)chromosome)酵母
5、细胞酵母细胞线性染色体线性染色体100-2000 kb100-2000 kbMAC(Mammalian MAC(Mammalian Artificial Chromosome)Artificial Chromosome)哺乳类细胞哺乳类细胞线性染色体线性染色体 1000 kb 1000 kb病毒载体病毒载体动物细胞动物细胞环状环状SV40 SV40 载体，昆虫载体，昆虫杆状病毒载体杆状病毒载体穿梭载体穿梭载体动物细胞动物细胞和细菌和细菌环状环状pSVK3pSVK3质粒，质粒，PBV,PBV,TiTi质粒质粒载体的种类和特征载体的种类和特征第七页，讲稿共四十九页哦第一节第一节 质粒（质粒（pla
6、smid）载体）载体一、质粒定义与其基本特征一、质粒定义与其基本特征二、质粒的类型二、质粒的类型三、质粒的构型（存在形式）三、质粒的构型（存在形式）四、质粒的命名规则四、质粒的命名规则五、质粒的不亲合性五、质粒的不亲合性六六 、质粒、质粒DNADNA的分离与纯化的分离与纯化七、重要的大肠杆菌质粒载体七、重要的大肠杆菌质粒载体第八页，讲稿共四十九页哦一、质粒定义与其基本特征一、质粒定义与其基本特征 质粒质粒（plasmidplasmid）是一种独立于染色）是一种独立于染色体外的能自主复制的共价、闭合环状双链体外的能自主复制的共价、闭合环状双链DNADNA分子。分子。主要存在于细菌中，在霉菌、酵母
7、及主要存在于细菌中，在霉菌、酵母及动、植物细胞中也发现有。动、植物细胞中也发现有。大小大小1200kb1200kb，约，约10103 310105 5kDkD；目前用作载体的质粒大多是由天然目前用作载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的。质粒经人工适当改造而成的。第九页，讲稿共四十九页哦质粒（质粒（plasmidplasmid）常常 有有1 31 3个个抗药性基因抗药性基因，以利于，以利于 筛选。筛选。第十页，讲稿共四十九页哦二、质粒的类型二、质粒的类型（一）根据质粒（一）根据质粒基因编码的特性基因编码的特性将质粒分为五大类将质粒分为五大类：F F质粒质粒：又称：又称F F因子、性质粒
8、，可转移基因到新受因子、性质粒，可转移基因到新受体细胞；体细胞；R R质粒质粒：含有青霉素或四环素等抗性基因；：含有青霉素或四环素等抗性基因；AmpRAmpR（氨苄青霉素抗性）（氨苄青霉素抗性）、TetRTetR（四环素抗性）（四环素抗性）。ColCol质粒质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于如存在于E.coli E.coli 中的中的ColE1ColE1。降解质粒降解质粒:可以降解特殊的分子如：甲苯，水可以降解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。杨酸。致瘤质粒致瘤质粒：农杆菌：农杆菌TiTi质粒质粒第十一页，讲稿共四十九页哦（二）根据质粒（二）根据质粒自身
9、传递的性质自身传递的性质分为两大类：分为两大类：1 1、结合型质粒结合型质粒：能自我复制，含转移基因：能自我复制，含转移基因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到另一组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到另一个寄主细胞。个寄主细胞。如：如：F F质粒，部分质粒，部分R R质粒、质粒、ColCol质粒。质粒。2 2、非结合型质粒非结合型质粒：能自我复制，不含转移基：能自我复制，不含转移基因组，不能自主在细胞间传递。因组，不能自主在细胞间传递。如：如：R R质粒、质粒、ColCol质粒质粒第十二页，讲稿共四十九页哦（三）根据质粒的（三）根据质粒的复制特性复制特性分为两大类：分为两大类：1 1、严紧型质
10、粒严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒，每：是一类低拷贝数的质粒，每个细胞中仅含有一个或几个质粒；个细胞中仅含有一个或几个质粒；拷贝（数）拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细胞中是指一种质粒在一个寄主细胞中存在的数目。存在的数目。2 2、松弛型质粒松弛型质粒：是高拷贝数的质粒，：是高拷贝数的质粒，2020拷贝拷贝/细胞。该类基因工程中常用。细胞。该类基因工程中常用。第十三页，讲稿共四十九页哦三、三、质粒的构型（存在形式）L L构型：构型：线性线性DNADNA（线状双螺旋）（线状双螺旋）OCOC构型：构型：开环开环DNADNA（开环双螺旋）（开环双螺旋）SCSC构型：构型：共价闭合环形共价闭合环形DN
11、ADNA （cccDNAcccDNA）第十四页，讲稿共四十九页哦LOCSC不同构型质粒不同构型质粒DNA电泳电泳移动速度比较移动速度比较第十五页，讲稿共四十九页哦四、质粒的命名规则例：pBR322质粒载体“p”表示是一种质粒（plasmid）；“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”，或者是实验室名称缩写；“322”表示实验编号。第十六页，讲稿共四十九页哦五、质粒的五、质粒的不亲合性不亲合性 是指在没有选择压力的情况下，两是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共
12、存的在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象，也称作现象，也称作不相容性不相容性。彼此不相容的质粒属于同一个彼此不相容的质粒属于同一个不亲不亲合群合群。主要是由于它们在复制功能之间的主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。相互干扰造成的。第十七页，讲稿共四十九页哦第十八页，讲稿共四十九页哦六六 、质粒、质粒DNADNA的分离与纯化的分离与纯化 1 1、氯化铯密度梯度离心法；、氯化铯密度梯度离心法；2 2、碱变性法；、碱变性法；3 3、微量碱变性法。、微量碱变性法。第十九页，讲稿共四十九页哦1.氯化铯密度梯度离心法 1、质粒DNA占总DNA的1%2%；2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量
13、的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。第二十页，讲稿共四十九页哦流程：流程：首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDSSDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。来促进大肠杆菌的细胞裂解。将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，菌裂解液中，EBEB会嵌入到会嵌入到DNADNA链的碱基中去链的碱基中去。在在EBEB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度达到饱和时，进行氯化铯密度
14、梯度离心。离心。第二十一页，讲稿共四十九页哦第二十二页，讲稿共四十九页哦第二十三页，讲稿共四十九页哦2.2.碱变性法：碱变性法：根据共价闭合环状质粒根据共价闭合环状质粒DNADNA与线性染色体与线性染色体DNADNA片片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在在PHPH值值12.012.012.512.5范围内时，线性的范围内时，线性的DNADNA会被会被变性而共价闭合环状质粒变性而共价闭合环状质粒DNADNA却不会被变性。却不会被变性。通过冷却或恢复中性通过冷却或恢复中性PHPH值使之复性，线性染色体值使之复性，线性染色体形成网状结构，而形成网状结构，而
15、cccDNAcccDNA可以准确迅速复性，通过可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有离心去除线性染色体，获得含有cccDNAcccDNA的上清液，的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒最后用乙醇沉淀，获得质粒DNADNA第二十四页，讲稿共四十九页哦碱变性法步骤：碱变性法步骤：1 1、取、取1.51.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心离心管中，离心收集细胞沉淀收集细胞沉淀；2 2、加入、加入100100微升冰冷的微升冰冷的溶液溶液，（，（50mM50mM葡萄糖，葡萄糖，25mM 25mM Tris-HCl PH=8.0,10m
16、M EDTATris-HCl PH=8.0,10mM EDTA，45mg45mg溶菌酶）静置溶菌酶）静置5 5分钟；分钟；3 3、加入、加入200200微升微冷的溶液微升微冷的溶液（0.2NaOH0.2NaOH，1.0%SDS1.0%SDS）缓）缓缓混匀置室温缓混匀置室温5 5分钟。分钟。6565度水浴一段时间会加强染色体度水浴一段时间会加强染色体DNADNA的变性作用。的变性作用。4 4、加入、加入150150毫升冰冷的毫升冰冷的PH=4.8PH=4.8的的3M3M醋酸钠，振荡后，冰醋酸钠，振荡后，冰浴浴5 5分钟。分钟。5 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒、离心的上清液用
17、苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNADNA。第二十五页，讲稿共四十九页哦七、重要的大肠杆菌质粒载体七、重要的大肠杆菌质粒载体 1 1、pSC101pSC101质粒载体；质粒载体；2 2、ColE ColE 1 1质粒载体；质粒载体；3 3、pBR322pBR322质粒载体；质粒载体；4 4、pUCpUC质粒载体；质粒载体；第二十六页，讲稿共四十九页哦1.1.pSC101pSC101质粒载体质粒载体 一种一种严紧型复制严紧型复制的大肠杆菌质粒载体。的大肠杆菌质粒载体。1212个拷贝个拷贝/细胞；细胞；9.09kb9.09kb，编码有一个，编码有一个四环素抗性四环素抗性基因（基因（TetTetr
18、 r ）。有有HindHind 、EcoREcoR、BamH BamH 、Sal Sal 、Xho Xho 、PvuPvu、Sma Sma 等等核酸内切限制核酸内切限制酶酶酶切位点酶切位点。其中在其中在HindHind 、BamH BamH、Sal 3Sal 3个位个位点克隆外源点克隆外源DNADNA，都会导致，都会导致TetTetr r 基因失活。基因失活。是第一个真核生物的克隆载体。是第一个真核生物的克隆载体。第二十七页，讲稿共四十九页哦第二十八页，讲稿共四十九页哦应用pSC101质粒作基因克隆载体 在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA 用核酸内切酶EcoR消化非洲爪蟾的核糖体DNA（rDNA）
19、，与EcoR消化的pSC101质粒进行重组。在挑取的55个转化子中，经 EcoR 酶切，电泳后13个转化子含有外源片断。转化率23.6第二十九页，讲稿共四十九页哦第三十页，讲稿共四十九页哦2.2.ColE ColE 1 1质粒载体质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝的质粒，能产生细菌素。细菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用（复制、转录、转译能量代谢等）。但含有对细菌素的免疫基因。第三十一页，讲稿共四十九页哦第三十二页，讲稿共四十九页哦3.pBR322质粒载体“P”表示是一种质粒；“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号
20、。第三十三页，讲稿共四十九页哦 四环素抗性基因氨苄青霉素 抗性基因O r i Pst Sal Pvu Ava Bam HHind Eco RpBR322(amp(ampr r)(ter(terr r)(Tetr)第三十四页，讲稿共四十九页哦pBR322pBR322的构建：的构建：为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能
21、力）移能力）第三十五页，讲稿共四十九页哦第三十六页，讲稿共四十九页哦pBR322pBR322的结构来源的结构来源第三十七页，讲稿共四十九页哦pBR322pBR322质粒载体的优点：质粒载体的优点：1 1、具有、具有较小的分子量较小的分子量；它的分子量为它的分子量为4363bp4363bp。克隆载体的大小不要超过。克隆载体的大小不要超过10kb10kb。2 2、具有两种抗菌素具有两种抗菌素抗性基因抗性基因可供作转化子的选择记可供作转化子的选择记号。号。共有共有2424种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7 7种内切种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，酶的识
22、别位点在四环素抗性基因内部，2 2种识别位点在于这种识别位点在于这个基因的启动区内，所以个基因的启动区内，所以9 9个限制酶切位点插入外源片断个限制酶切位点插入外源片断可以导致可以导致TetTetr r 基因的失活；基因的失活；另外有另外有3 3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因种限制酶在氨苄青霉素抗性基因AmpAmpr r有单一的识有单一的识别位点，别位点，第三十八页，讲稿共四十九页哦Example:a.在pBR322质粒的BamH或Sal位点插入外源DNA片断，切断了tettetr r基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出Ampr rTets s表型的重组pBR322质粒，转化入Amps s
23、Tets s的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr r菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。第三十九页，讲稿共四十九页哦B X BBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX第四十页，讲稿共四十九页哦 3 3、具有、具有较高的拷贝数较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累之后每个细胞中可积累1000300010003000个拷贝。个拷贝。第四十一页，讲稿共四十九页哦 pBR322pBR322质粒载体的改良质粒载体的改良 为了更加实
24、用，人们对为了更加实用，人们对pBR322pBR322质粒进行质粒进行了改良，得到许多了改良，得到许多pBR322pBR322质粒衍生质粒，它质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。们各自具有不同的特点。第四十二页，讲稿共四十九页哦4.4.pUCpUC质粒载体质粒载体 人们应用多克隆位点技术，在人们应用多克隆位点技术，在pBR322pBR322的基础上，组入了一个在的基础上，组入了一个在其其5 5-端带有一段多克隆位点的端带有一段多克隆位点的lacZlacZ基因，而发展的具有双功能检测特基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。性的新型质粒载体系列。第四十三页，讲稿共四十九页哦 一种典
25、型的一种典型的pUCpUC系列的质粒载体，包括以下四个系列的质粒载体，包括以下四个部分：部分：1 1、来自、来自pBR322pBR322质粒的复制起点（质粒的复制起点（oriori）；）；2 2、氨苄青霉素抗性基因（、氨苄青霉素抗性基因（ampampr r ）,但它的但它的DNADNA核苷核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点。制酶的识别位点。3 3、大肠杆菌、大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZlacZ）的启动子）的启动子及编码及编码-肽链的肽链的DNADNA序列，此结构称之为序列，此结构称之为lacZla
26、cZ基基因；因；4 4、位于、位于lacZlacZ基因中的靠近基因中的靠近5 5-端的一段多克隆位点（端的一段多克隆位点（MCSMCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。）区段。但它并不破坏该基因的功能。第四十四页，讲稿共四十九页哦AmproripUC18(3 kb)MCS(Multiple cloning sites,多克隆位点）Lac promoterlacZ第四十五页，讲稿共四十九页哦pUCpUC质粒载体的形体图质粒载体的形体图第四十六页，讲稿共四十九页哦pUC质粒载体的优点第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发
27、生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500700个拷贝。第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。第三，具有多克隆位点MCS区段 方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。第四十七页，讲稿共四十九页哦八、质粒载体的构建与类型八、质粒载体的构建与类型 1.1.天然质粒天然质粒：没有经过以基因克隆为目标：没有经过以基因克隆为目标 的体外修饰改造的质粒。的体外修饰改造的质粒。2、人工构建（改造）质粒、人工构建（
28、改造）质粒：在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有粒有ColE1、RSF2124和和pSC101等，但存在一定等，但存在一定的局限性。的局限性。第四十八页，讲稿共四十九页哦 第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含有一个，它含有一个EcoR酶切位点，一个四环素酶切位点，一个四环素抗性选择记号（抗性选择记号（Tetr），插入外源片断后不），插入外源片断后不影响其复制功能，但该质粒分子量较大，影响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。用插入失活技术选择重组分子。第四十九页，讲稿共四十九页哦