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1、关于基因工程制药(5)现在学习的是第1页，共74页第三讲 基因工程制药 基因工程与药物概述 基因工程药物上游技术 基因工程药物下游技术 基因工程药物的质量控制 基因工程药物制造实例现在学习的是第2页，共74页第一节 概述 生物技术的核心就是基因工程，基因工程技术最成功的应用就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。现在学习的是第3页，共74页 基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的优势。应用基因工程技术可十分方便且有效地解决
2、上述提到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。现在学习的是第4页，共74页利用基因工程技术生产药品的优点：（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；现在学习的是第5页，共74页利用基因工程技术生产药品的优点：（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的
3、不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如IL-2的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，IL-2的活性以及热稳定性均有提高；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。基因工程技术可将不同种类和用途的基因，在原核细胞中表达的特性使其不仅在医药，而且在很多行业中都会有重要的应用。现在学习的是第6页，共74页第二节 基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。基
4、因工程药物制造的主要程序是：目的基因的克隆，构建DNA重组体，将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌，工程菌的发酵，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验等。以上程序中的每个阶段都包含若干细致的步骤，这些程序和步骤将会随研究和生产条件的不同而改变。现在学习的是第7页，共74页获得目的基因获得目的基因组建重组质粒组建重组质粒培养工程菌培养工程菌构建基因工程构建基因工程菌或细胞菌或细胞产物分离纯化产物分离纯化除菌过滤除菌过滤半成品检定半成品检定包装包装成品检定成品检定基因工程药物制备的一般过程基因工程药物制备的一般过程现在学习的是第8页，共74页基因工程药物生产的上游和下游 上游：主要指的是目的基因分
5、离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。现在学习的是第9页，共74页工程菌（或细胞）构建中重要的工具 该过程中重要的工具便是酶：限制性内切酶和连接酶是将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其他宿主菌（细胞）大量复制目的基因过程中的重要工具。同时为保证目的基因的正确性，对目的基因要进行限制性内切酶和核苷酸序列分析。基因表达系统就是上述的工程菌或细胞，有原核生物和真核生物两类表达系统；选择基因表达的系统主要考虑的是保证表达蛋白质的功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。
6、现在学习的是第10页，共74页下游阶段在产业化中是极其重要的 下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析，对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高效表达的发酵工艺，同时建立一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。现在学习的是第11页，共74页第三节 目的基因的获得 对于目的基因的获得需要根据目的基因的来源采取适当的
7、方法。对于真核细胞来源的目的基因，是不能直接进行分离的。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA中的很小一部分，即使多拷贝基因也是极少的，因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的。另外，原核表达系统是有局限性的，主要是由于真核基因的内含子及基因的后翻译过程，所以真核系统得到了相应发展。现在学习的是第12页，共74页第三节 目的基因的获得 目前克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学合成法 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的
8、作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。现在学习的是第13页，共74页第三节 目的基因的获得 一、逆转录法 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定现在学习的是第14页，共74页cDNA克隆示意图mRNA逆转录酶ss-DNADNA多聚酶IKlenow片段逆转录酶ds-c
9、DNAds-cDNA现在学习的是第15页，共74页1、mRNA的纯化 分离纯化目的基因的mRNA是极其困难的，细胞内含有3种以上的RNA，mRNA占细胞内总RNA总量的2%5%，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷酸组成。在真核细胞中mRNA的3末端常常含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，长达20250个腺苷酸，可采用Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。洗脱方法是高浓度盐溶液使mRNA特异结合于寡聚dT，再以低盐溶液和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较纯的mRNA。现在学习的是第16页，共74页2、cDNA第一链的合成 一般mRNA都带有
10、3-polyA，所以可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的dNTP掺入量，计算出cDNA的合成效率；在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件。一次好的逆转录反应可使寡聚dT选出的mRNA有5%30%被拷贝。现在学习的是第17页，共74页3、cDNA第二链的合成 先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。由于第一链cDNA链3末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二
11、链。此反应是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。发夹结构结构切除后，双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电泳进行测定。现在学习的是第18页，共74页4、cDNA克隆 用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌体DNA（如gt10、gt11等）。根据重组后插入的cDNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型和非表达型载体。pUC及gt11为表达型载体，在cDNA插入位置的上游具有启动基因顺序；而pBR322及gt10为非表达型载体。在cDNA克隆操作中应该根据不同的需要选择适当的载体。c
12、DNA插入片段小于10kb，可选质粒载体，如大于10kb则应选用噬菌体DNA为载体。选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。现在学习的是第19页，共74页cDNA文库 R.Young和R.Davis设计的gt10和gt11是噬菌体克隆载体，可用于构建cDNA文库。一方面它们具有较高的克隆效率，1ng cDNA可产生5000个克隆，另一方面又可容纳较大分子量的外源DNA片段。因为筛选噬菌斑在技术操作上较筛选细菌菌落更方便，因此gt10和gt11类载体在构建文库时优于质粒载体pBR322。现在学习的是第20页，共74页gt10载体 在合适的宿主中，gt10载体对于未携带cD
13、NA的噬菌体的裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA插入到gt10中可使噬菌体阻碍物基因（cI）失活。当用大肠杆菌c600的突变型hflA（高频溶原性）作为宿主时，只有携带cDNA插入片段的噬菌体可形成噬菌斑，而在非突变型大肠杆菌c600宿主菌中，带与不带cDNA插入片段的噬菌体都可形成噬菌斑。现在学习的是第21页，共74页gt11载体 gt11则没有类似gt10载体的选择作用，但它是蛋白质表达的cDNA克隆载体。gt11的宿主菌是大肠杆菌Y1090。gt11中cDNA插入片段是克隆在-半乳糖苷酶基因编码区（lacZ）的羧基端，在含IPTG（isopropylthio-D-galactosi
14、de,异丙基硫代-D-半乳糖苷）和X-gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside,5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）的平板上，带cDNA插入片段的gt11可形成清晰的无色噬菌斑，未带cDNA插入片段的gt11则形成蓝色噬菌斑。cDNA插入片段的翻转产物可表达成半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白。现在学习的是第22页，共74页cDNA片段与载体的连接 方法一：加同聚尾连接，用3末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与cDNA的3末端带上互补的同型多聚体序列，如载体加上polyC（或A）的尾巴，则cDNA加上polyG（或T）的尾巴，这两种粘性末端只能使载体与
15、cDNA连接而不能自我环化，借助同型多聚体的退火作用形成重组分子，最后用T4DNA连接酶封口。方法二：加人工接头连接，用T4DNA连接酶在平末端接上人工接头可以使DNA发生连接。所谓人工接头是指人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切位点的寡核苷酸片段。cDNA连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到粘性末端，从而能够与载体连接；cDNA中也可能也带有同样的限制酶切点，为了保护cDNA不受限制酶破坏，可在加接头前用甲基化酶修饰这些限制酶切位点。现在学习的是第23页，共74页5、将重组体导入宿主细胞 体外包装的噬菌体，感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑；或转化感受态大肠杆菌使质粒进入细胞内。现
16、在学习的是第24页，共74页6、cDNA文库的鉴定 根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。然后采用凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析测定等方法进行进一步筛选和鉴定。现在学习的是第25页，共74页7、目的cDNA克隆的分离和鉴定 从cDNA文库中分离特异的cDNA克隆，主要采用：（1）核酸探针杂交法。用层析和高分辨电泳等技术纯化微克量的目的蛋白质，根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。（2）免疫反应鉴定法。在既无可供选择的基因表型特征，又无合适探针的情况下，本法是重要途径。用表达型载体构
17、建的cDNA文库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各cDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异cDNA克隆。现在学习的是第26页，共74页 分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定，主要是进行限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序以及确定基因的转录方向、转录起始点等。1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。现在学习的是第27页，共74页二、化学合成法 人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，5060bp；二是人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变；三是费用较高。现在学习的是第28页，共74页第四节 基因表达 进行基因研究，我们主要关心的
18、是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此在进行基因表达设计时，需综合考虑各种影响因素以建立最佳基因表达体系。现在学习的是第29页，共74页一、宿主细胞的选择 对于宿主细胞其应该：容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行DNA重组技术操作；产物的产量、产率高，产物容易提取纯化。基因表达有两类宿主细胞：一类是原核细胞，目前常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；另一类是真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。现在学习的是第30页，共74页1、原核细胞
19、-1（1）大肠杆菌 大肠杆菌表达基因工程产物的形式：细胞不溶性表达（包含体）、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数情况下还可分泌到细胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且杂质的含量和种类也会变化。大肠杆菌中的表达的特点：不存在信号肽，产品多为胞内产物；分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，产物须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性；不存在翻译后修饰作用；翻译通常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应；产生的内毒素难以除去；产生的蛋白质酶会破坏蛋白质。现在学习的是第31页，共74页1、原核细胞-2（2）枯草芽孢
20、杆菌 分泌能力强，可以将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此在外源基因克隆表达的应用中受到影响。现在学习的是第32页，共74页1、原核细胞-3（3）链霉菌 其是重要的工业微生物，近年来作为外源基因表达体系正日益受到人们的重视。其主要特点是：不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可以作为理想的受体菌。现已构建了一系列有效的载体，下游培养工艺也已经成熟。现在学习的是第33页，共74页2、真核细胞-1（1）酵母 特点：真核生物细胞，故
21、有后翻译过程；基因组小，仅为大肠杆菌的4倍；世代时间短，有单倍体和双倍体两种形式；基因操作与原核生物相似；可以建立有分泌功能的表达系统，将产物分泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。在各种酵母中以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的应用历史最为悠久，研究资料也最丰富。现在学习的是第34页，共74页2、真核细胞-2（2）丝状真菌 近年来，已在约30种以上丝状真菌中建立了DNA转化系统，其特点是：有很强的蛋白分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等，而且其糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉等）等又确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺。现在学习的是第3
22、5页，共74页2、真核细胞-3（3）哺乳动物细胞 哺乳动物细胞由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，细胞培养成分完全由人控制，从而使产物纯化变得容易。哺乳动物细胞分泌的基因产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，产率低，且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。现在学习的是第36页，共74页二、大肠杆菌中的基因表达 1、载体 表达载体必须具备的条件（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前者在宿主细胞中拷贝数仅13个，后者在宿主细胞中拷贝数可高达3000个。（2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选，且克隆位点位于启动子序
23、列后，以便外源基因表达。（3）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA酶所识别。现在学习的是第37页，共74页表达载体必须具备的条件（4）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才进行转录。阻遏子的阻遏作用可以由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，因而可人为地选择启动子启始转录mRNA的时机，以获得外源蛋白质表达合成的最佳时机。外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。现在学习的是第38页，共74页表达载体必须具备的条件（5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时，很强
24、的终止子所产生的mRNA较为稳定。诱导表达时，由于强启动子所致的高水平转录反过来还会影响质粒DNA本身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象，因此表达载体需在外源基因的下游安置一个强转录终止子，以克服由质粒转录引进的质粒不稳定。现在学习的是第39页，共74页表达载体必须具备的条件（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列（Shine-Dalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。大家可以翻到书本73面，其中介绍了两个基因工程药物研究中常用的表达载体。pBV220系统和pET系统。现在学习的是第40页，共74页2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素（
25、1）外源基因的拷贝数（2）外源基因的表达效率：启动子的强度、核糖体结合位点的有效性、SD序列和起始密码ATG的间距、密码子的组成等都会不同程度地影响外源基因的表达效率。（3）表达产物的稳定性：组建融合蛋白；利用大肠杆菌的信号肽或真核多肽中自身的信号肽；采用位点突变的方法；选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，可能会减弱表达产物的降解。如黄嘌呤核苷（Ion）是大肠杆菌合成蛋白酶的主要底物，Ion-营养缺陷型大肠杆菌不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶，减少了表达产物在细胞体内的降解。现在学习的是第41页，共74页2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素（4）细胞的代谢负荷 外源基因的表达产物属于异
26、己物质，并可能对宿主细胞有毒性。调节表达物质的积累与细胞的生长和代谢之间的平衡有利于外源基因的高效表达。另外通过将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，或将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开两种手段也可以减轻细胞代谢的负荷。形成不溶性的包含体可以降低表达产物对宿主细胞的毒害作用现在学习的是第42页，共74页2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素（5）工程菌的培养条件 除宿主、载体和克隆基因三者之间的关系影响外源基因的高水平表达外，培养条件亦是非常值得研究的因素。以后会对其进行详细的介绍。现在学习的是第43页，共74页3、真核基因早大肠杆菌中的表达形式（1）融合蛋白的形式（2）非融合蛋白的形式
27、：指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含任何细菌多肽序列。为此，表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌或噬菌体的启动子细菌的核糖体结合位点（SD序列）真核基因的起始密码子结构基因终止密码。要表达非融合蛋白，要求SD序列与翻译起始密码ATG之间的距离要适合，SD序列与翻译起始密码ATG之间即使只改变23个碱基，表达效率也会受到很大的影响。非融合蛋白易被蛋白酶破坏，其N端常带有甲硫氨酸，可引起人免疫反应。现在学习的是第44页，共74页3、真核基因早大肠杆菌中的表达形式（3）分泌型表达蛋白药物基因：外源蛋白的表达是通过将外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游
28、来实现的。利用大肠杆菌的信号肽，构建分泌型表达质粒，常用的信号肽有碱性磷酸酶信号肽（phoA）、膜外周质蛋白信号肽（OmpA）、霍乱弧菌毒素B亚单位（CTXB）等。特点：一些可被胞内蛋白酶所降解的蛋白质在周质中是稳定的；由于有些蛋白质能按一定的方式折叠，所以在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌表达时却具有活性；蛋白信号肽和编码序列之间能被切割，因而分泌蛋白质不含起始密码ATG所编码的甲硫氨酸等。但是，产量不高、信号肽不被切割或不在特定位置上切割等。现在学习的是第45页，共74页三、酵母中的基因表达 酵母表达系统是随着酵母质粒和酵母转化技术的建立而逐步发展起来的，其与其它表达系统一样，包括载体、启动
29、子等控制序列和宿主细胞3个部分。现在学习的是第46页，共74页1、载体（1）载体的复制序列（1）载体的复制序列：根据来自酵母的复制序列的构成和特性。载体可以分为四大类：Yep类（yeast episomal plasmid，酵母附加体质粒），这类载体的复制序列为酵母2质粒成分。2质粒是多数酿酒酵母中天然存在的质粒，长6.3kb，可独立复制。将2质粒中复制起点区及REp3基因区的序列引入载体，就足以维持在大多数酵母株系中的复制能力。以2质粒为基础的载体，因具有较高的拷贝数、转化频率和稳定性而被广泛使用。Ypp类（yeast replication plasmid，酵母复制型质粒）此类载体的复制序
30、列是非2来源的自主复制序列（autonomous replication sequence，ARS），可来自酵母染色体，也可来自其他生物。此类载体稳定性差，拷贝数也少，转化频率为103105/g DNA。现在学习的是第47页，共74页1、载体（1）载体的复制序列 YCp；类（yeast centromeric plasmid，酵母着丝粒质粒）此类载体的复制序列也属于ARS，并且含有酵母染色体中心粒成分，有的还引入酵母染色体端粒成分。它们作为一种类似染色体的单位参与细胞有丝分裂和减数分裂，在子代细胞中精确地分配，因此有很好的稳定性。但它们的拷贝 数只有1个，转化频率为103104/g DNA。现
31、在学习的是第48页，共74页1、载体（1）载体的复制序列 YIp类（yeast inteegrative plasmid，酵母整合型质粒），此类载体含有可与酵母染色体重组的序列，可以完全整合到染色体中。因此它依靠酵母染色体进行复制，具有很好的稳定性。拷贝数只有一个，转化频率为1100/g DNA。现在学习的是第49页，共74页1、载体（2）克隆载体 从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段才转入酵母中，这就要求酵母载体也同时具有在大肠杆菌中复制和增殖的能力。为此，向酵母载体中引入大肠杆菌质粒pBR322的ori部分和Ampr或T
32、etr部分，这样构成的载体同时带有细菌和酵母的复制原点和选择标记。酵母最常使用的选择性标记是某些氨基酸或核苷酸合成酶系基因，也可以是利用抗性基因作为选择性标记。克隆载体既可以在细菌中进行质粒复制和表型选择，又能在酵母中进行质粒复制和表型选择。现在学习的是第50页，共74页1、载体（3）表达载体 将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入载体的适当位点后，就构成了酵母菌的表达载体。酵母菌的表达载体有两类：普通表达载体和精确表达载体，前者只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸是否增减并无严格要求。后者要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶点，以利于接入外
33、源基因，并使他在表达后加工后N末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸现在学习的是第51页，共74页2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素（1）外源基因的拷贝数 外源基因通常是由多拷贝的质粒载体导入宿主细胞的，质粒的拷贝数及其在宿主细胞内的稳定性对外源基因的表达起决定作用。有些质粒在导入宿主细胞后，在传代培养中很快丢失，不能用于工业生产。通过整合质粒，将外源基因整合到宿主染色体上，虽然很稳定，但通常只有一个拷贝，不能高效表达。高稳定的高拷贝数的质粒可使外源基因高效表达，但高拷贝数通常会引起细胞生长量的降低；而单拷贝数的质粒对细胞的最大生长没有影响，因而也能达到高效表达。现
34、在学习的是第52页，共74页（2）外源基因的表达效率启动子 外源基因在酵母中表达的效率主要与启动子、分泌信号和终止序列有关。启动子“表达框架”。启动子是由上游激活序列和保留的近端启动子组成。近端启动子含有一个转录所必需的TATA序列和mRNA起始转录位点起始密码子。终止区含有终止mRNA转录所需的信号。现在学习的是第53页，共74页（2）外源基因的表达效率启动子 在酵母菌中经常利用的启动子有组成型和诱导型启动子，不同启动子对不同外源基因的表达水平的调节作用明显不同。启动子类型 所用的基因 基因符号 组成型 磷酸甘油酸激酶 PGK 烯醇酶 ENOL 3-磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH 乙醇脱氢酶1
35、 ADH1 磷酸三糖异构酶 TRI 信息素-因子 MF 1诱导型 细胞色素C CYC1 酸性磷酸脂酶 PHO5 半乳糖激酶 GAL1 UDP-D-半乳糖-4-差向酶 GAL10现在学习的是第54页，共74页（2）外源基因的表达效率启动子 分泌信号的效率。分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物和前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。分泌信号是酵母菌表达蛋白的起始分泌、糖基化和蛋白折叠加工等不可缺少的因素。终止序列的影响：终止序列保证产物（mRNA）在适当部位终止和加上polyA尾部，这样形成的mRNA可能比较
36、稳定并被有效地翻译。在酵母中表达的人工合成基因一般不含终止序列，必须借用外加的终止序列或载体上现有的终止序列。常用的外加终止序列有ADH1、CYC1、MF1和PGK。现在学习的是第55页，共74页（3）外源蛋白的糖基化 外源蛋白在酵母细胞中可发生N-糖苷键（天冬酰胺连接）和O-糖苷键（丝氨酸或苏氨酸连接）的两种不同的糖基化，与哺乳动物中发生的糖基化相同。外源蛋白经酿酒酵母合成、氨基末端修饰、二硫键形成、蛋白质折叠和糖基化后，可靠有效地以活性型分泌到培养基中，而且某些蛋白质糖基化后更加稳定，便于分离精制。现在学习的是第56页，共74页（4）宿主菌株的影响 不同的酵母菌株及其生理状况对外源基因的表
37、达有明显的影响。表达用的酵母宿主菌株应具备下列要求：菌体生长力强；菌体内源蛋白酶要较弱；菌株性能稳定，常用的几乎是突变株，避免使用回复突变率高的不稳定体系；最好使用二倍体或多倍体菌株；分泌能力强。现在学习的是第57页，共74页四、动物中的基因表达 优点：产物类似于天然产物，容易分离纯化 缺点：动物细胞生长慢，培养条件苛刻，费用高培养液浓度较小。书中第82页表3-2对大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞3类主要基因工程表达体系简要进行了比较。现在学习的是第58页，共74页第五节 基因工程菌的稳定性 一、质粒不稳定产生的原因 工程菌的质粒由于分裂的原因而不稳定；质粒的拷贝数所决定的不稳定；培养条件：比生长
38、速率控制；质粒稳定性分析方法：先在不含抗性标记培养基中培养，再于含抗性标记培养基中培养，根据比值计算质粒的稳定性。现在学习的是第59页，共74页二、提高质粒稳定性的方法 为提高培养过程中质粒的稳定性，一般采用两阶段法，第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长，也是提高质粒稳定性的方法。采用适当的操作方式可使工程菌生长速率具有优势，并使工程菌和质粒丢失菌生长竞争趋于极端化。可调控的环境参数为温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。通过间隙供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性。现在学习的是第60页，共74页第六节 基因工
39、程菌生长代谢的特点 菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子核酸和蛋白质合成的综合表现，通常用比生长速率表示。碳源、补料或稀释速率可调控菌体生长。控制菌体生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产率方面都具有一定的意义。一、菌体的生长和能量的关系 二、菌体生长与前体供应的关系现在学习的是第61页，共74页第七节 基因工程菌发酵 基因工程菌的培养过程主要包括：通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案和顺序。现在学习的是第62页，共74页一、基因工程菌的培养方式 1、
40、补料分批培养 2、连续培养 3、透析培养 4、固定化培养现在学习的是第63页，共74页二、基因工程菌的发酵工艺 探索基因工程菌的培养影响因素，并进行优化或改进：1、培养基：选择好 2、接种量的影响：确定接种量是否优化；3、温度：选择适当的温度 4、溶解氧的影响 5、诱导时机的选择 6、pH的影响现在学习的是第64页，共74页三、基因工程菌的培养设备 参见书本第91页现在学习的是第65页，共74页第八节 基因工程药物的分离纯化 生物技术产品一般是活性肽或蛋白质，它们具有如下特点：初始物料中含量低；基体组成复杂；稳定性差；种类多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂而又性质
41、各异的生物活性物质；应用面广，要求质量、纯度高，无菌无热源等。现在学习的是第66页，共74页一、建立分离纯化工艺的根据 1、含目的产物的起始物料的特点 2、物料中杂质的种类和性质 3、目的产物特性 4、产品质量要求现在学习的是第67页，共74页二、分离纯化的基本过程 一般包括如下几个方面的过程：细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。书中给出了流程示意图（图3-7）。现在学习的是第68页，共74页三、分离纯化的技术 分离纯化要求：条件温和、选择性好收率高、两个技术之间能直接衔接以及整个过程要快，能满足高生产率的要求。1、细胞破碎与固液分离：收集破碎固液分离：离心、
42、萃取、膜技术等 2、目的产物的分离纯化：色谱方法 3、非蛋白质类杂质的去除：主要是DNA、热原质和病毒。现在学习的是第69页，共74页四、选择分离纯化方法的依据 1、根据产物表达形式来选择（分泌型、可溶性 2、根据单元之间的衔接来选择：正确选择分离纯化的次序；3、根据分离纯化工艺的要求来选择：稳定性和重复性、尽量少步骤、组成工艺的各技术或步骤之间要相互适应和协调、尽量少的使用试剂、时间尽可能短、工艺和技术必须高效、高收率。现在学习的是第70页，共74页第九节 基因工程药物的质量控制 一、原材料的控制 二、培养过程的质量控制 三、纯化工艺的质量控制 四、目标产品的质量控制 五、产品的保存；低温、稳定pH下保存、高浓度保存、加保护剂；另外固态保存比液态稳定，因此最好办法是制成干粉或晶体。现在学习的是第71页，共74页第十节 基因工程药物制造示例现在学习的是第72页，共74页现在学习的是第73页，共74页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第74页，共74页