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1、分子生物学之基因诊断与基因治疗第一页，讲稿共二十六页哦第一节第一节基基 因因 诊诊 断断Gene Diagnosis第二页，讲稿共二十六页哦基因诊断的优势：基因诊断的优势：可在源头上识别基因正常与否，属于可在源头上识别基因正常与否，属于“病因诊断病因诊断”针对特定基因，特异性强针对特定基因，特异性强 所用的所用的PCR等技术具有放大效应，故灵敏度高等技术具有放大效应，故灵敏度高 适用性强，诊断范围广适用性强，诊断范围广 是指利用分子生物学技术和方法直接检测是指利用分子生物学技术和方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。作出诊断
2、的方法。基因诊断的定义：基因诊断的定义：第三页，讲稿共二十六页哦n、基因诊断的主要对象和样品来源、基因诊断的主要对象和样品来源主要是主要是DNA分子，涉及到功能分析时，还可定分子，涉及到功能分析时，还可定量检测量检测RNA（主要是（主要是mRNA）和蛋白质等分子。）和蛋白质等分子。临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。对象：对象：样品来源：样品来源：第四页，讲稿共二十六页哦二、基因诊断技术二、基因诊断技术分类分类定性分析定性分析 定量分析定量分析 基因分型基因分型 检测基因
3、突变检测基因突变 测定基因拷贝数测定基因拷贝数 测定基因表达产物量测定基因表达产物量 基本流程：基本流程：基因诊断的基础基因诊断的基础 核酸抽提核酸抽提 目的序列的扩增目的序列的扩增分子杂交分子杂交信号检测信号检测核酸分子杂交核酸分子杂交DNA序列分析技术序列分析技术几种技术联合使用几种技术联合使用第五页，讲稿共二十六页哦（一）基因缺失或插入的诊断（一）基因缺失或插入的诊断 1DNA印迹法印迹法 其可以区分正常和突变样品的基因型，并可获得基因缺其可以区分正常和突变样品的基因型，并可获得基因缺失或插入片段大小等信息。失或插入片段大小等信息。DNA印迹一般可以显示印迹一般可以显示50 bp20 k
4、bp的的DNA片段，片段大小的信息是该技术诊断基因缺陷片段，片段大小的信息是该技术诊断基因缺陷的重要依据。的重要依据。2PCR法法 裂口裂口PCR（gap-PCR），简便灵敏而更适用于临床诊断），简便灵敏而更适用于临床诊断。该方法的思路是：设计并合成一组序列上跨越突变（缺失。该方法的思路是：设计并合成一组序列上跨越突变（缺失或插入）断裂点的引物，从扩增片段的大小直接判断是否存或插入）断裂点的引物，从扩增片段的大小直接判断是否存在缺失或插入突变。在缺失或插入突变。第六页，讲稿共二十六页哦（二）基因点突变的诊断（二）基因点突变的诊断1等位基因特异性寡核苷酸分子杂交等位基因特异性寡核苷酸分子杂交 检
5、测点突变的有效技检测点突变的有效技术是等位基因特异性术是等位基因特异性寡核苷酸（寡核苷酸（allele specific oligonucleotide，ASO）分子杂交。）分子杂交。第七页，讲稿共二十六页哦2反向点杂交反向点杂交 反向点杂交（反向点杂交（reverse dot blot，RDB）是改进的）是改进的 ASO技术技术。一次检测可以同时筛查多种突变，大大提高了基因诊断效率。一次检测可以同时筛查多种突变，大大提高了基因诊断效率。3变性高效液相色谱变性高效液相色谱 DHPLC技术的基本原理是利用待测样品技术的基本原理是利用待测样品DNA在在PCR扩扩增过程的单链产物可以随机与互补链相结
6、合而形成双链的特性增过程的单链产物可以随机与互补链相结合而形成双链的特性，依据最终产物中是否出现异源双链来判断待测样品中是否存，依据最终产物中是否出现异源双链来判断待测样品中是否存在点突变。在点突变。4DNA序列分析序列分析 用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断。用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断。第八页，讲稿共二十六页哦三、基因诊断的医学应用三、基因诊断的医学应用（一）遗传性疾病诊断和风险预测（一）遗传性疾病诊断和风险预测基因诊断目前可用于基因诊断目前可用于遗传筛查遗传筛查和和产前诊断产前诊断。疾病致病基因突变类型诊断方法地中海贫血珠蛋白缺失为主Gap-PCR、DN
7、A杂交、DHPLC地中海贫血珠蛋白点突变为主反向点杂交、DHPLC甲型血友病凝血因子点突变为主PCR-RFLP乙型血友病凝血因子点突变、缺失等PCR-STR连锁分析苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶点突变PCR-STR连锁分析、ASO分子杂交 马凡综合症原纤蛋白点突变、缺失PCR-VNTR连锁分析、DHPLC我国部分代表性常见单基因遗传病基因诊断我国部分代表性常见单基因遗传病基因诊断 第九页，讲稿共二十六页哦（二）多基因常见病的预测性诊断（二）多基因常见病的预测性诊断预测性诊断可为被测者提供某些疾病发生风险的评估意见。预测性诊断可为被测者提供某些疾病发生风险的评估意见。（三）传染病病原体检测（三）传染病
8、病原体检测适用情况适用情况 病原微生物的现场快速检测，确定感染源；病原微生物的现场快速检测，确定感染源；病毒或致病菌的快速分型，明确致病性或药物敏感性；病毒或致病菌的快速分型，明确致病性或药物敏感性；需要复杂分离培养条件，或目前尚不能体外培养的病原微生物的需要复杂分离培养条件，或目前尚不能体外培养的病原微生物的鉴定。鉴定。第十页，讲稿共二十六页哦（四）疗效评价和用药指导（四）疗效评价和用药指导nPCR等基因诊断技术已成为临床上检测和跟踪微小残留病等基因诊断技术已成为临床上检测和跟踪微小残留病灶的常规方法。灶的常规方法。n在系统阐明人类药物代谢酶类及其他相关蛋白的编码基因在系统阐明人类药物代谢酶
9、类及其他相关蛋白的编码基因遗传多态性的基础上，通过对不同药物代谢基因靶点的药遗传多态性的基础上，通过对不同药物代谢基因靶点的药物遗传学检测，将为真正实现个体化用药提供技术支撑。物遗传学检测，将为真正实现个体化用药提供技术支撑。第十一页，讲稿共二十六页哦（五）（五）DNA指纹鉴定是法医学个体识别的核指纹鉴定是法医学个体识别的核心技术心技术人与人之间的某些人与人之间的某些DNA序列特征具有高度的个体特异性和终生序列特征具有高度的个体特异性和终生稳定性，正如人的指纹一般，故称为稳定性，正如人的指纹一般，故称为DNA指纹指纹（DNA fingerprinting）。STR等位基因在家庭中等位基因在家庭
10、中遗传示意图遗传示意图 第十二页，讲稿共二十六页哦第二节第二节基基 因因 治治 疗疗Gene Therapy第十三页，讲稿共二十六页哦是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗，即通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的，即通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。它针对的是方法。它针对的是疾病的根源疾病的根源，即异常的基因本身。，即异常的基因本身。基因治疗的定义基因治疗的定义第十四页，讲稿共二十六页哦一、基因治疗的基本策略一、基因治疗的基本策略（一）缺陷基因精确的原
11、位修复（一）缺陷基因精确的原位修复基因矫正基因矫正gene correction基因置换基因置换gene replacement致病基因的突变碱基进行纠正致病基因的突变碱基进行纠正用正常基因通过重组原位替换致病基因用正常基因通过重组原位替换致病基因这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整个基因组的结构，又可达到治疗疾病的目的，是最为理想的治个基因组的结构，又可达到治疗疾病的目的，是最为理想的治疗方法。疗方法。第十五页，讲稿共二十六页哦（二）基因增补（二）基因增补不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位不删除突变的致病基因，而在基因组的
12、某一位点额外插入正常基因，在体内表达出功能正常的蛋点额外插入正常基因，在体内表达出功能正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的。这种对基因进行异位白质，达到治疗疾病的目的。这种对基因进行异位替代的方法称为替代的方法称为基因添加基因添加（gene augmentation）或）或称称基因增补基因增补，是目前临床上使用的主要基因治疗策是目前临床上使用的主要基因治疗策略略。第十六页，讲稿共二十六页哦（三）基因沉默或失活（三）基因沉默或失活 有些疾病是由于某一或某些基因的过度表达有些疾病是由于某一或某些基因的过度表达引起的，向患者体内导入有抑制基因表达作用的引起的，向患者体内导入有抑制基因表达作用的核酸，如反
13、义核酸，如反义RNA、核酶、干扰小、核酶、干扰小RNA等，可降解等，可降解相应的相应的mRNA或抑制其翻译，阻断致病基因的异或抑制其翻译，阻断致病基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的。这一策略称常表达，从而达到治疗疾病的目的。这一策略称为为基因失活基因失活（gene inactivation）或）或基因沉默基因沉默（gene silencing）。）。第十七页，讲稿共二十六页哦二、基因治疗的基本程序二、基因治疗的基本程序基因治疗的基本过程基因治疗的基本过程可分为可分为5个步骤：个步骤：选择治疗基因选择治疗基因 选择携带治疗基因的载体选择携带治疗基因的载体 选择基因治疗的靶细胞选择基因治疗的靶
14、细胞 在细胞和整体水平导入治疗基因在细胞和整体水平导入治疗基因 治疗基因表达的检测治疗基因表达的检测第十八页，讲稿共二十六页哦（一）选择治疗基因（一）选择治疗基因许多分泌性蛋白质如生长因子、多肽类激素许多分泌性蛋白质如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体（人工构建的去除膜结、细胞因子、可溶性受体（人工构建的去除膜结合特征的受体），以及非分泌性蛋白质如受体、合特征的受体），以及非分泌性蛋白质如受体、酶、转录因子的正常基因都可作为治疗基因。简酶、转录因子的正常基因都可作为治疗基因。简言之，只要清楚引起某种疾病的突变基因是什么言之，只要清楚引起某种疾病的突变基因是什么，就可用其对应的正常基因或
15、经改造的基因作为，就可用其对应的正常基因或经改造的基因作为治疗基因。治疗基因。第十九页，讲稿共二十六页哦（二）选择携带治疗基因的载体（二）选择携带治疗基因的载体 基因治疗用载体有基因治疗用载体有病毒载体病毒载体和和非病毒载体非病毒载体两大类，多选两大类，多选用病毒载体。用病毒载体。野生型病毒必须经过改造，剔除其复制必需的基因和野生型病毒必须经过改造，剔除其复制必需的基因和致病基因，消除其感染和致病能力。致病基因，消除其感染和致病能力。目前用作基因转移载体的病毒有目前用作基因转移载体的病毒有逆转录病毒逆转录病毒（retrovirus）、）、腺病毒腺病毒（adenovirus）、）、腺相关病毒腺相
16、关病毒（adeno-associated virus,AAV）、）、单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）等）等。第二十页，讲稿共二十六页哦1.逆转录病毒载体逆转录病毒载体 逆转录病毒属于逆转录病毒属于RNA病毒，其基因组中有编码逆转录病毒，其基因组中有编码逆转录酶和整合酶（酶和整合酶（integrase）的基因。）的基因。逆转录病毒载体有基因转移效逆转录病毒载体有基因转移效率高、细胞宿主范围较广泛、率高、细胞宿主范围较广泛、DNA整合效率高等整合效率高等优点优点。缺点缺点一是有感染性病毒的可能一是有感染性病毒的可能；二是增加了肿瘤发生机会。；二是增加了肿
17、瘤发生机会。第二十一页，讲稿共二十六页哦2.腺病毒载体腺病毒载体 腺病毒属腺病毒属DNA病毒，可引起人上呼吸道和眼部上皮细胞的病毒，可引起人上呼吸道和眼部上皮细胞的感染。感染。安全性高安全性高 转染效率高转染效率高 可用细胞范围广可用细胞范围广 缺点缺点 基因组较大，构建复杂基因组较大，构建复杂 不能长期表达不能长期表达 免疫原性较强，易被排斥免疫原性较强，易被排斥 优点优点第二十二页，讲稿共二十六页哦（三）选择基因治疗的靶细胞（三）选择基因治疗的靶细胞 靶细胞通常是靶细胞通常是体细胞体细胞（somatic cell），包括病变组织细），包括病变组织细胞或正常的免疫功能细胞。胞或正常的免疫功能
18、细胞。1.造血干细胞造血干细胞：造血干细胞（造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）是骨髓中具有高度）是骨髓中具有高度自我更新能力的细胞，能进一步分化为其他血细胞，并能保持基因组自我更新能力的细胞，能进一步分化为其他血细胞，并能保持基因组DNA的稳定。的稳定。2.皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞：皮肤成纤维细胞具有易采集、可在体外扩增培养、易于移皮肤成纤维细胞具有易采集、可在体外扩增培养、易于移植等优点。植等优点。3.肌细胞肌细胞：肌细胞有特殊的肌细胞有特殊的T管系统利于注射的质粒管系统利于注射的质粒DNA经内吞作用进入。环状经内吞作用进入。环状质粒不整合入基因组质粒不
19、整合入基因组DNA，能在肌细胞内较长时间保留。，能在肌细胞内较长时间保留。第二十三页，讲稿共二十六页哦（四）将治疗基因导入人体（四）将治疗基因导入人体将外源基因直接注入体内有关的组织器将外源基因直接注入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。官，使其进入相应的细胞并进行表达。基因递送基因递送gene delivery间接体内疗法间接体内疗法ex vivo直接体内疗法直接体内疗法in vivo将需要接受基因的靶细胞从体内取将需要接受基因的靶细胞从体内取出，在体外培养，将携带有治疗基出，在体外培养，将携带有治疗基因的载体导入细胞内，筛选出接受因的载体导入细胞内，筛选出接受了治疗基因的细胞
20、，繁殖扩大后再了治疗基因的细胞，繁殖扩大后再回输体内，使治疗基因在体内表达回输体内，使治疗基因在体内表达相应产物。相应产物。第二十四页，讲稿共二十六页哦基因导入细胞基因导入细胞生物学法生物学法非生物学法非生物学法病毒载体所介导的基因导病毒载体所介导的基因导入，是通过病毒感染细胞入，是通过病毒感染细胞实现的，其特点是基因转实现的，其特点是基因转移效率高，但安全问题需移效率高，但安全问题需要重视。要重视。用物理或化学法，将治疗基因用物理或化学法，将治疗基因表达载体导入细胞内或直接导表达载体导入细胞内或直接导入人体内，操作简单、安全，入人体内，操作简单、安全，但是转移效率低。但是转移效率低。第二十五页，讲稿共二十六页哦（五）治疗基因表达的检测（五）治疗基因表达的检测 无论以何种方法导入基因，都需要检无论以何种方法导入基因，都需要检测这些基因是否能被正确表达。被导入基测这些基因是否能被正确表达。被导入基因的因的表达状态表达状态可以用可以用PCR、RNA印迹印迹、蛋白蛋白印迹印迹及及ELISA等方法去检测。对于导入基因等方法去检测。对于导入基因是是否整合否整合到基因组以及到基因组以及整合的部位整合的部位，可以用，可以用DNA印迹技术印迹技术进行分析。进行分析。第二十六页，讲稿共二十六页哦