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1、第第2626章章基因基因诊诊断与基因治断与基因治疗疗 人民人民卫卫生出版社生出版社PEOPLES MEDICAL PUBLISHING HOUSE目录第一节 基因诊断第二节 基因治疗人民卫生出版社PSOFLESMEDICALFIIBUSHING HOUSE命令教师重点难点掌握基因诊断与基因治疗的概念熟悉基因诊断技术、基因治疗的基本策略和基本程序了解基因诊断和基因治疗在医学中的应用人民卫生出版社PSOFLESNEDICALFIIBUSHING HOUSE第第1 1节节基因基因诊诊断断人民人民卫卫生出版社生出版社 PEOPLES MEDICAL PUBLISHING HOUSE命合教育一、基因诊断
2、的概念与特点(1)基因诊断的概念：是指利用分子生物学技术和方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。(2)基因诊断的特点：(1)基因诊断的特异性强(2)基因诊断的灵敏度高强(3)基因诊断可进行快速和早期判断(4)基因诊断适用性强、诊断范围广人民卫生出版社PSOFLESMEDICAL FIBUSHING HOUSE命合教材命合教材二、基因二、基因诊诊断的断的对对象及象及样样品来源品来源(1)(1)基因基因诊诊断的断的对对象象主要是DNA分子，涉及到功能分析时，还可定量检测RNA(主要是mRNA)和蛋白质等分子。(2)(2)基因基因诊诊断的断的样样品来源：品来源：临床上可
3、用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。人民人民卫卫生出版社生出版社PSOPLESNEDICAL FIBUSHING HOUSE命合教材三、基因诊断的基本技术(一)核酸分子杂交技术1.Southern 印迹法其可以区分正常和突变样品的基因型，并可获得基因缺失或插入片段大小等信息。DNA印迹一般可以显示50 bp20 kbp的DNA片段，片段大小的信息是该技术诊断基因缺陷的重要依据。2.Northern 印迹法Northern印迹法(Northern blot)能够对组织或细胞的总RNA或mRNA进行定性或定量分析，及基因表达分析。Northern印迹杂交对样品R
4、NA纯度要求非常高，限制了该技术在临床诊断中的应用。人民卫生出版社PSOFLESMEDIOAL FIBUSHINGHOUSE命合教育三、基因诊断的基本技术(一)核酸分子杂交技术3.斑点杂交(dot blot hybridization)是核酸探针与支持物上的DNA或RNA样品杂交，以检测样品中是否存在特异的基因或表达产物，该技术可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性与定量分析。4.原位杂交(in situ hybridization,ISH)是细胞生物技术与核酸杂交技术相结合的一种核酸分析方法，核酸探针与细胞标本或组织标本中核酸杂交，可对特定核酸序列进行定量和定位分析。人民卫生出版社PSOP
5、LESMEDIOAL PIBUSHING HOUSE命合教育命合教育三、基因三、基因诊诊断的基本技断的基本技术术(一一)核酸分子核酸分子杂杂交技交技术术5.5.荧荧光原位光原位杂杂交交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是将荧光素或生物素等标记的寡聚核苷酸探针与细胞或组织变性的核酸杂交，可对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。在基因诊断中，FISH的优势在于对任何给定的基因组区域进行特异性杂交，对中期分裂象染色体及间期细胞核进行分析，可以获得传统显带技术所无法检测
6、到的染色体信息。人民人民卫卫生出版社生出版社命合教材命合教材三、基因三、基因诊诊断的基本技断的基本技术术(二二)PCR)PCR 技技术术1.1.直接采用直接采用PCRPCR技技术进术进行基因行基因诊诊断断裂 因其简便灵敏而更适用于临床诊断。该方法的思路是：设计并合成一组序列上跨越突变(缺失或插入)断裂点的引物，将待测DNA样本进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，从扩增片段的大小直接判断是否存在缺失或插入突变。多重PCR是一种实用可靠的检测DNA缺失的常用方法，其基本原理是在一次PCR反应中加入多种引物，对一份DNA样本中的不同系列片段进行扩增，每对引物扩增的产物长度不一。可以根据电泳图谱上
7、不同长度DNA片段存在与否，判断某些基因片段是否发生缺失或突变。人民人民卫卫生出版社生出版社PEOPLES MEDIOAL PIBUSHNG HOUSE命令教材二、基因诊断技术(二)PCR 技术GCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGA正常2.PCR-等位基因特异性寡核苷酸分子杂交CGGGACACCCCGTTCCACTTGCACCT基因组DNAGCCCTGTGGGGCTAGGTGAACGTGGA检测点突变的有效技突变CGGGACACCCCGATCCACTTGCACCT术是等位基因特异性寡核苷酸(allele specificGTGGGGCAAGGTGAACGTGGGGCTAGGTGA
8、AColigonucleotide,ASO)正常探针分子杂交突变探针12CBA人民卫生出版社PSOPLESMEDICAL FIBUSHINGHOUSE命合教育三、基因诊断的基本技术(二)PCR 技术3.PCR-限制性片段长度多态性是将PCR于限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)结合起来的技术，可以快速、简便地对已知突变进行基因诊断。引物介导的限制性分析PCR(PCR-primer introduced restricition analysis,PCR-PIRA)是PCR-RFLP技术的延伸。巢式PCR-限制性片段多
9、态性(nested PCR-RFLP)是将RFLP与巢式PCR(nested PCR)技术相结合，通过设计高度保守序列的引物对待检测物种DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行RFLP分析。人民卫生出版社PSOFLESMEDICAL FIBUSHING HCUSE命合教育三、基因诊断的基本技术(二)PCR 技术4.PCR-单链构象多态性PCR单链构象多态性(PCR-single strand con formation polymorphism,PCR-SSCP)分析，是基于单链DNA构象的差别来检测基因点突变的方法。5.PCR-变性高效液相色谱PCR-DHPLC技术的基本原理是利用待测样品DN
10、A在PCR扩增过程的单链产物可以随机与互补链相结合而形成双链的特性，依据最终产物中是否出现异源双链来判断待测样品中是否存在点突变。人民卫生出版社PSOFLESMEDIOAL FIBUSHING HOUSE命合教育三、基因诊断的基本技术(三)DNA序列分析分离出患者的有关基因，测定其碱基排列顺序，找出变异所在是最为直接和确切的基因诊断方法。由于PCR技术和DNA序列分析技术的迅速发展和推广，序列分析已经在技术上和经济上成为最佳的诊断方法，代替了传统的限制性内切酶酶谱分析法。(四)基因芯片技术基因芯片技术可以进行微量化、大规模、自动化处理样品，特别是适用于同时检测多个基因、多个位点，精确地研究各种
11、状态下分子结构的变异，了解组织或细胞中基因表达情况，用以检测基因的突变、多态性、表达水平和基因文库作图等。人民卫生出版社PSOFLESMEDICAL FIBUSHING HCUSE命合教材命合教材四、基因四、基因诊诊断的医学断的医学应应用用(一一)遗传遗传性疾病性疾病诊诊断和断和风险预测风险预测基因诊断目前可用于遗传筛查和产前诊断。我国部分代表性常见单基因遗传病基因诊断疾病疾病致病基因致病基因地中海贫血地中海贫血珠蛋白珠蛋白地中海贫血地中海贫血珠蛋白珠蛋白甲型血友病甲型血友病凝血因子凝血因子乙型血友病乙型血友病凝血因子IX凝血因子IX苯丙酮尿症苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶苯丙氨酸羟化酶马凡综合症马
12、凡综合症原纤蛋白原纤蛋白人民人民卫卫生出版社生出版社PSOPLES NEDIOAL PIBUSHING HOUSE命合教育四、基因诊断的医学应用(二)多基因常见病的预测性诊断预测性诊断可为被测者提供某些疾病发生风险的评估意见。(三)传染病病原体检测1.病原微生物的现场快速检测，确定感染源；2.病毒或致病菌的快速分型，明确致病性或药物敏感性；3.需要复杂分离培养条件，或目前尚不能体外培养的病原微生物的鉴定。人民卫生出版社PSOFLESMEDICAL FIBUSHING HCUSE命合教育四、基因诊断的医学应用(四)疗效评价和用药指导PCR等基因诊断技术已成为临床上检测和跟踪微小残留病灶的常规方法
13、。在系统阐明人类药物代谢酶类及其他相关蛋白的编码基因遗传多态性的基础上，通过对不同药物代谢基因靶点的药物遗传学检测，将为真正实现个体化用药提供技术支撑。人民卫生出版社部合教材四、基因诊断的医学应用(五)DNA指纹鉴定是法医学个体识别的核心技术1801902102402302202502001114父亲1412女儿814人与人之间的某些DNA 序列特征具有高度的个体特异性和终生稳定性，正如人的指纹一般，故称为DNA 指纹(DNA fingerprinting)。长子11 12次子812母亲STR等位基因在家庭中遗传示意图人民卫生出版社PSOFLESNEDICAL PIBUSHINGHOUSE第第
14、2 2节节基因治基因治疗疗人民人民卫卫生出版社生出版社 PEOPLES MEDICAL PUBLISHING HOUSE命合教育一、基因治疗的基本策略基因治疗的概念是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗，即通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。它针对的是疾病的根源，即异常的基因本身。人民卫生出版社PEOPLESMEDICAL PIBUSHNGHCUSE命合教育一、基因治疗的基本策略(一)缺陷基因精确的原位修复1.基因矫正 gene correction致病基因的突变碱基进行纠正2.基因置换 gene replacement用正常基因通过重
15、组原位替换致病基因这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整个基因组的结构，又可达到治疗疾病的目的，是最为理想的治疗方法。人民卫生出版社PSOPLESMEDIOAL PIBUSHING HOUSE命合教材一、基因治疗的基本策略(二)基因增补不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位点额外插入正常基因，在体内表达出功能正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的。这种对基因进行异位替代的方法称为基因添加(gene augmentation)或称基因增补，是目前临床上使用的主要基因治疗策略。在血友病患者体内导入凝血因子IX基因，恢复其凝血功能；将编码干扰素和白介素-2等分子的基因导入恶性肿瘤患者体内，可
16、以激活体内免疫细胞的活力，作为抗肿瘤治疗中的辅助治疗，也称为基因免疫治疗。人民卫生出版社PSOFLES MEDICAL FIBUSHINS HOUSE命合教育一、基因治疗的基本策略(三)基因沉默或失活有些疾病是由于某一或某些基因的过度表达引起的，向患者体内导入有抑制基因表达作用的核酸，如反义RNA、核酶、干扰小RNA等，可降解相应的mRNA或抑制其翻译，阻断致病基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的。这一策略称为基因失活(gene inactivation)或基因沉默(gene silencing)。人民卫生出版社PSOPLESMEDIOAL PIBUSHING HOUSE命合教育命合教育一、
17、基因治疗的基本策略(四四)自自杀杀基因的基因的应应用用自杀基因治疗肿瘤的原理是将编码某些特殊酶类的基因导入肿瘤细胞，其编码的酶能够使无毒或低毒的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。人民人民卫卫生出版社生出版社PSOPLES MEDIOAL FIBUSHNGHOUSE命合教育二、基因治疗的基本程序(一)选择治疗基因许多分泌性蛋白质如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体(人工构建的去除膜结合特征的受体)，以及非分泌性蛋白质如受体、酶、转录因子的正常基因都可作为治疗基因。简言之，只要清楚引起某种疾病的突变基因是什么，就可用其对应的正常基因或经改造
18、的基因作为治疗基因。人民卫生出版社PSOPLESMEDIOAL PIBUSHING HOUSE命令教材二、基因治疗的基本程序(二)选择携带治疗基因的载体基因治疗用载体有病毒载体和非病毒载体两大类，多选用病毒载体。野生型病毒必须经过改造，剔除其复制必需的基因和致病基因，消除其感染和致病能力。目前用作基因转移载体的病毒有逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)等。人民卫生出版社PSOFLES MEDICAL PIBUSHINS HOUSE命
19、令教材命令教材二、基因治二、基因治疗疗的基本程序的基本程序(二二)选择选择携携带带治治疗疗基因的基因的载载体体逆转录病毒逆转录酶逆转录病毒1.1.逆逆转录转录病毒病毒载载体体出芽融合蛋白合成宿主染色体DNA51逆转录病毒属于RNA病毒，其基因组中有编码逆转录酶和整合酶(integrase)的基因。42逆转录转录3逆转录病毒载体有基因转移效率高、细胞宿主范围较广泛、DNA整合效率高等优点。缺点一是有感染性病毒的可能；二是增加了肿瘤发生机会。整合前病毒人民人民卫卫生出版社生出版社PSOPLES NEDIOAL PIIBUSHING HCUSE符合教材二、基因治疗的基本程序(二)选择携带治疗基因的载
20、体2.腺病毒载体腺病毒属DNA病毒，可引起人上呼吸道和眼部上皮细胞的感染。基因组较大，构建复杂安全性高缺点不能长期表达转染效率高优点免疫原性较强，易被排斥可用细胞范围广人民卫生出版社PSOFLESMEDICAL PIBUSHINGHOUSE命合教育二、基因治疗的基本程序(三)选择基因治疗的靶细胞靶细胞通常是体细胞(somatic cell)，包括病变组织细胞或正常的免疫功能细胞。1.造血干细胞造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是骨髓中具有高度自我更新能力的细胞，能进一步分化为其他血细胞，并能保持基因组DNA的稳定。2.淋巴细胞淋巴细胞参与机体的免疫反应，有较长
21、的寿命及容易从血液中分离和回输，且对目前常用的基因转移方法都有一定的敏感性，适合作为基因治疗的靶细胞。人民卫生出版社PSOPLES MEDIOAL PIBUSHING HCAISE命合教育命合教育二、基因治二、基因治疗疗的基本程序的基本程序(三三)选择选择基因治基因治疗疗的靶的靶细细胞胞靶细胞通常是体细胞(somatic cell)，包括病变组织细胞或正常的免疫功能细胞。5.5.肿肿瘤瘤细细胞胞肿瘤细胞是肿瘤基因治疗中极为重要的靶细胞。由于肿瘤细胞分裂旺盛，对大多数的基因转移方法都比较敏感，可进行高效的外源性基因转移。人民人民卫卫生出版社生出版社命合教育二、基因治疗的基本程序(四)将治疗基因导
22、入人体1.基因导入人体:基因导入人体也称基因递送gene delivery,包含:间接体内疗法 ex vivo 和直接体内疗法in vivo(1)间接体内疗法将需要接受基因的靶细胞从体内取出，在体外培养，将携带有治疗基因的载体导入细胞内，筛选出接受了治疗基因的细胞，繁殖扩大后再回输体内，使治疗基因在体内表达相应产物。(2)直接体内疗法将外源基因直接注入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。人民卫生出版社PEOPLESMEDIOAL PIBUSHNGHCUSE命合教育二、基因治疗的临床应用现状(四)将治疗基因导入人体2、基因导入细胞：基因导入细胞的方法包含：生物学法和非生物学法(1)
23、生物学法病毒载体所介导的基因导入，是通过病毒感染细胞实现的，其特点是基因转移效率高，但安全问题需要重视。(2)非生物学法用物理或化学法，将治疗基因表达载体导入细胞内或直接导入人体内，操作简单、安全，但是转移效率低。人民卫生出版社PSOPLES MEDIOAL FIBUSHNGHOUSE命合教育命合教育二、基因治二、基因治疗疗的基本程序的基本程序(五五)治治疗疗基因表达的基因表达的检测检测无论以何种方法导入基因，都需要检测这些基因是否能被正确表达。被导入基因的表达状态可以用PCR、RNA印迹、蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导入基因是否整合到基因组以及整合的部位，可以用DNA印迹技术进行分
24、析。人民人民卫卫生出版社生出版社PSOPLES MEDIOAL FIBUSHNGHOUSE命合教育命合教育三、基因治三、基因治疗疗的医学的医学应应用用(一一)单单基因基因遗传遗传病的基因治病的基因治疗疗只受一对等位基因影响而发生的疾病属于单基因遗传病，设计基因治疗方案相对容易，例如镰刀状红细胞性贫血、-地中海贫血、血友病等。基本方案是通过一定的方法把正常的基因导入到病人体内，表达出正常的功能蛋白。人民人民卫卫生出版社生出版社PSOPLES MEDIOAL FIBUSHNGHOUSE命合教育命合教育四、基因治四、基因治疗疗的前景与的前景与问题问题(一一)亟待解决的亟待解决的问题问题1.缺乏高效、
25、靶向性的基因转移系统2.缺乏切实有效的治疗靶基因3.对治疗基因的表达还无法做到精确调控，也无法保证其安全性4.缺乏准确的疗效评价(二二)前景前景国家越来越重视、技术越来越成熟、应用越来越广泛。人民人民卫卫生出版社生出版社PSOFLES MEDICALPIBUSHING HCUSE本章小结1、介绍了基因诊断的基本概念与特点2、介绍了基因诊断的基本技术3、介绍了基因诊断的医学应用4、介绍了基因治疗的基本策略5、介绍了基因治疗的基本程序6、介绍了基因治疗在医学中的应用人民卫生出版社PSOPLES MEDICALPIBUSHINSHCUSE人民人民卫卫生出版社生出版社PEOPLES MEDICAL PUBLISHING HOUSE谢谢观看