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1、关于沙门氏菌检验关于沙门氏菌检验详细流程详细流程第一页，本课件共有27页沙门菌沙门菌概况概况n n沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon氏对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门菌属。n n沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌有2500多个血清型和变种。我国发现的有250多个血清型。第二页，本课件共有27页沙门菌的分类沙门菌的分类根据生化反应不同，分为2个种：肠道沙门菌（Samonella enterica）：肠道亚种（肠道亚种（subsp.enterica subs
2、p.enterica）萨拉姆亚种萨拉姆亚种 （subsp.salamae）亚利桑那亚种（subsp.arizonae subsp.arizonae）豪顿亚种（豪顿亚种（subsp.houtenae subsp.houtenae）因迪卡亚种（subsp.indica）邦戈尔沙门菌（Samonella bongori）第三页，本课件共有27页沙门菌种和亚种的鉴别沙门菌种和亚种的鉴别项目项目肠道沙门菌肠道沙门菌邦戈尔沙门菌邦戈尔沙门菌卫矛醇山梨醇水杨苷ONPG丙二酸盐KCN注：+为阳性-为阴性第四页，本课件共有27页沙门氏菌的血清分型沙门氏菌的血清分型n n迄今为止沙门氏菌有n n57个个OO抗原n
3、 n116116个H H抗原n nViVi抗原抗原 被分成2500多个血清型。Vi抗原O抗原H抗原第五页，本课件共有27页沙门氏菌命名与书写方式沙门氏菌命名与书写方式目前的命名方法规定：n n肠道沙门菌肠道亚种（亚种肠道沙门菌肠道亚种（亚种）给予专用名，并采用标）给予专用名，并采用标本分离地址的地名。菌名的第一个字母需大写，且亚种本分离地址的地名。菌名的第一个字母需大写，且亚种的所用菌名不能用斜体。例如：肠道沙门菌鼠伤寒血清型应的所用菌名不能用斜体。例如：肠道沙门菌鼠伤寒血清型应书写为书写为Salmonella enterica subsp.enterica serotype Typhimur
4、iumSalmonella enterica subsp.enterica serotype Typhimurium，但在实际工作中，可简写为，但在实际工作中，可简写为S.TyphimuriumS.Typhimurium。n n其他沙门氏菌均不给专用名，只在亚种数字名后直接书写抗其他沙门氏菌均不给专用名，只在亚种数字名后直接书写抗原式，比如原式，比如S.S.66:z35:-66:z35:-n n新的血清型名称的批准必须有巴斯德研究所、德国汉堡卫生研新的血清型名称的批准必须有巴斯德研究所、德国汉堡卫生研究所及美国究所及美国CDC 3CDC 3个实验室的一致同意。个实验室的一致同意。第六页，本课件
5、共有27页沙门氏菌检验程序第七页，本课件共有27页n n目的：修复损伤的细菌细胞；n n方法：25 g（mLmL）样品）样品225 mL BPW225 mL BPW的无菌均质杯的无菌均质杯中，以中，以8 000 r/min10 000 r/min10 000 r/min均质1 min2 2 minmin，或置于盛有，或置于盛有225 mL BPW225 mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min1 min2 min2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如使用均质袋，可直接进行培养。于36 1 培养培养8 h8 h18h18h。前增菌第八页，本课件共有27页无菌均质袋无菌
6、均质袋第九页，本课件共有27页n n轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL1 mL,转种于10 mL TTB 10 mL TTB 内,于于42 1 培养18 24 h24 h。同时,另取另取1 mL,转种于10 mL SC内,于于36 1 36 1 培培养养18 24 h。n n分别用接种环取增菌液分别用接种环取增菌液1 1环环,划线接种于一个划线接种于一个BSBS琼脂平板和一个XLDXLD琼脂平板（或HE琼脂平板或显色培养基平板）。于36 1 36 1 分别培养18 18 24 h(XLD琼脂平板、HEHE琼脂平板、显色培养基平板)或40 h48 h(BS琼脂平板琼脂平板)，观察各个平板上
7、生长的，观察各个平板上生长的菌落。菌落。为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种以上选择性分离培养基。以上选择性分离培养基。选择性增菌与分离第十页，本课件共有27页分离培养基回收率测定（%）进口进口-SS65.3 进口进口-SS81.0 国产国产-SS52.0 进口进口-HE83.2 国产国产-HE80.0 进口进口-XLD83.0 国产国产-XLD86.2 进口进口-BS106.6 国产国产-BS77.7 CHRO显色显色68.4 国产国产-DHL98.4 国产国产-WS71.6 TSA（对照）（对照）100.0 第十一页，本课件共有27页
8、典型菌落-BS 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。周围培养基不变。国产BS进口BS第十二页，本课件共有27页典型菌落-HE国产HE进口HE蓝绿色或蓝色蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。中心黑色或几乎全黑色。第十三页，本课件共有27页典型菌落-XLD进口XLD国产XLD菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，菌落呈粉红
9、色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心第十四页，本课件共有27页初筛微生物菌落颜色特异性灵敏度沙门氏菌紫色(直径约1mm)89100%柠檬酸杆菌属蓝色(直径约1mm)-变形杆菌无色或被抑制-(铜绿假单胞菌也呈紫红色，可铜绿假单胞菌也呈紫红色，可以通过前增菌排除。所以推荐以通过前增菌排除。所以推荐在检测中的前增菌用在检测中的前增菌用TTBTTB。粉红色、深红色、干燥菌落、边缘粉红色、深红色、干燥菌落、边缘锯齿状等锯齿状等 均非沙门氏菌菌落。）均非沙门氏菌菌落。）
10、第十五页，本课件共有27页生化试验生化试验 n n自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁（TSI）琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板；取菌落一部分于斜面划线后穿刺底层。n n接种针在接种TSI后不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36 培养18 24 h，必要时可延长至48 h。第十六页，本课件共有27页穿刺穿刺TSI方法方法第十七页，本课件共有27页n n接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种
11、。于36 1 培养18 h24 h,必要时可延长至48 h。n n将已挑菌落的平板储存于2 5 或室温至少保留24 h，以备必要时复查。第十八页，本课件共有27页沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果 三糖铁琼脂三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验培养基赖氨酸脱羧酶试验培养基 初步判断初步判断 斜面斜面 底层底层 产气产气 硫化氢硫化氢-+（）（）（）（）可疑沙门氏菌属可疑沙门氏菌属-+（）（）（）（）可疑沙门氏菌属可疑沙门氏菌属+（）（）（）（）可疑沙门氏菌属可疑沙门氏菌属+/非沙门氏菌非沙门氏菌 注：阳性，阴性；（）多数阳性注：阳性，阴性；（）多数阳性,少
12、数阴性；少数阴性；/阳性或阴性。阳性或阴性。该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排除。其他反该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。第十九页，本课件共有27页TSI的反应的反应 赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验第二十页，本课件共有27页沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应反应序号序号 硫化氢硫化氢（H H2 2S S）靛基靛基质质pH7.2pH7.2尿尿素素氰化钾氰化钾（KCNKCN）赖氨酸脱赖氨酸脱羧酶羧酶A1A1 A2A2
13、 A3A3 /注：阳性；阴性；注：阳性；阴性；/阳性或阴性。阳性或阴性。反应序号反应序号A1A1：为典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、：为典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCNKCN和赖氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶3 3项中有项中有1 1项异常项异常,按下表可判定为沙门氏菌。按下表可判定为沙门氏菌。如有如有2 2项异常为非沙门氏项异常为非沙门氏菌。菌。第二十一页，本课件共有27页沙门氏菌属生化反应初步鉴别表沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH7.2pH7.2尿素尿素 氰化钾氰化钾(KCN)(KCN)赖氨酸脱羧赖氨酸脱羧酶酶判判 定定 结结 果果 甲型副伤寒沙门氏菌甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清要求血
14、清学鉴定结果学鉴定结果)沙门氏菌沙门氏菌或或(要求符合本要求符合本群生化特性群生化特性)沙门氏菌沙门氏菌个别变体个别变体(要求血清学要求血清学鉴定结果鉴定结果)注：表示阳性；表示阴性。注：表示阳性；表示阴性。反应序号反应序号2 2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结果均为阳性；：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结果均为阳性；反应序号反应序号3 3：补做：补做ONPGONPG，ONPGONPG阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌；但阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌；但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。第二十二页，本课件共有27
15、页沙门氏菌属各生化群的鉴别沙门氏菌属各生化群的鉴别必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定 项项 目目 卫矛醇卫矛醇 山梨醇山梨醇水杨苷水杨苷ONPGONPG丙二酸丙二酸盐盐KCNKCN注：表示阳性注：表示阳性;表示阴性。表示阴性。第二十三页，本课件共有27页沙门菌的其他鉴定沙门菌的其他鉴定n nAPI 20En nVITEK32GNI卡片第二十四页，本课件共有27页沙门菌的血清学鉴定沙门菌的血清学鉴定n n培养基：一般使用新鲜营养琼脂斜面作培养基：一般使用新鲜营养琼脂斜面作纯纯培养，取斜面上部培养物作O抗原玻片凝集试验，下部凝结水里的培养抗原玻片凝集试验，下部凝结水里
16、的培养物作物作H H抗原。n nH H抗原的位相诱导试验n n制备半固体琼脂，融化完全分装制备半固体琼脂，融化完全分装10ml/10ml/管，121 121 灭菌1515分钟，冷至分钟，冷至50 50 备用。备用。n n取诱导用血清取诱导用血清1 1滴加到小平皿中，倾入冷至滴加到小平皿中，倾入冷至50 的的10ml半固体琼脂，轻轻摇匀，凝固。半固体琼脂，轻轻摇匀，凝固。n n将培养物接种到平板的中央，放入湿盒中培养过夜。取边缘的菌进行H H抗原的检测。抗原的检测。第二十五页，本课件共有27页血清学鉴定时的注意要点：n n做血清凝集时，同时应用生理盐水做对照。n nO O血清不凝集时，可将菌株转接于琼脂量较高血清不凝集时，可将菌株转接于琼脂量较高(如2.5%-3%)的斜面上，再做凝集。n n如果由于ViVi抗原的存在而阻止了抗原的存在而阻止了O抗原的凝集反应时，应挑取菌苔于1mL生理盐水中做成菌悬液。煮沸后再检查。(常见于伤寒沙门菌常见于伤寒沙门菌)。n n有极少数的二相沙门菌会同时出现2相H H抗原，也有抗原，也有一些沙门氏菌在培养过程中一些沙门氏菌在培养过程中H H抗原会出现第抗原会出现第1项和第项和第2项之间的转变，所以血清诱导实验要用新鲜的培养物进行诱导。第二十六页，本课件共有27页感感谢谢大大家家观观看看第二十七页，本课件共有27页