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1、-微生物实验手册-第 23 页微生物实验室规则与安全微生物学实验室规则医学微生物学实验的对象大多为病原微生物，具有传染性，因此要求进入实验室后必须严格遵守以下实验室规则：1进入实验室应穿白大衣，离室时脱下，反折放回原处，不必要的物品不得带入实验室，必须带入的书籍和文具等应放在指定的非操作区，以免受到污染。无菌操作时必须戴口罩，并不得开电风扇。2实验室内禁止饮食、抽烟，不得高声谈笑或随便走动。3各种实验物品应按指定地点存放，用过的器材必须放入消毒缸内，禁止随意放于桌上及冲入水槽。4须送温箱培养的物品，应做好标记后送到指定地点。5实验过程中发生差错或意外事故时，禁止隐瞒或自作主张不按规定处理，应立
2、即报告老师进行正确的处理。如有传染性的材料污染桌面、地面等，应立即用0.2%0.5% “84”消毒液浸泡污染部位，作用510min后方可抹去。如手被活菌污染也应使用上述消毒液浸泡510min后，再以自来水反复冲洗干净。6爱护室内仪器设备，严格按操作规则使用。节约使用实验材料，不慎损坏了器材等，应主动报告老师进行处理。7实验完毕，应物归原处并将桌面整理清洁，实验室打扫干净。最后以0.2%0. 5% “84”消毒液浸泡手5min，洗净后方可离开实验室。实验一 器皿包扎及消毒与灭菌一、实验目的1、了解玻璃器皿的清洗、棉塞制作、移液管和培养皿的包扎方法。2、了解干热灭菌、紫外线灭菌、微孔滤膜过滤除菌和
3、高压蒸汽灭菌的原理和应用范围。3、掌握高压蒸汽灭菌的操作技术。二、实验原理（1）实验室中使用的玻璃器皿简介 微生物学实验所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和（将“和”改为“才能”）用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿的质量一般要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂灼烧而不致破坏；玻璃器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤玻璃器皿的方法不当也会影响实验的结果。目前微生物学实验室中，有些玻璃器皿（如培养皿、吸管等）已被一次性塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的实验室用具。（2）灭菌的常用方法和基本原理
4、实验室常用的灭菌方法有干热灭菌法、紫外线照射法、微孔滤膜过滤除菌法和高压蒸汽灭菌法等。A.干热灭菌是用电热干燥箱（图1）加热，利用高温使微生物细胞内的酶、蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。B.紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。C.微孔过滤除菌（图2、图3）是通过机械作用滤去液体或气体中细菌、真菌孢子等的方法。D.高压蒸汽灭菌也是使蛋白质变性而灭菌，高压蒸汽灭菌锅（图4、图5、图6）灭菌时是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续
5、加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。图1 电热干燥箱的外观和结构图2 图3 图4 高压蒸汽灭菌锅图5 卧式灭菌锅 图6 手提式灭菌锅1.安全阀；2.压力表；3.放气阀；4.软管；5.紧固螺栓；6.灭菌桶；7.筛架；8.水干热灭菌与高压蒸汽灭菌的灭菌效果与所灭物品的蛋白质含水量有很大的关系（表1）。就效果而言，湿热灭菌效果要比干热灭菌效果好（表2）。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要（表3），因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空
6、气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。表1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含水量/%30分钟内凝固所需温度/50562574-801880-906145表2 干热、湿热穿透力及灭菌效果比较温度/时间/h透过布层的温度/灭菌10层20层100层干热130-1404867270.5不完全湿热105.33101101101完全表3 灭菌锅内留有不同分量空气时压力与温度的关系压 力 数全部空气排出时的温度 ()2/3空气排出时的温度()l/2空气排出时的温度 ()1/3空气排出时的温度 ()空气全不排出时的温度 ()MPakg/cm2 1b/in20.030.070.100.140.170.210
7、.350.701.051.401.752.10 51015202530108.8115.6121.3126.2130.0134.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121压力数全部空气排出时的温度2/3空气排出时的温度1/2空气排出时的温度1/3空气完全排除时的温度空气完全排除时的温度MPaKg/cm21b/in20.030.355108.81009490720.070.7010115.6109105100900.101.0515121.31151121091000.141.4020126.2121
8、1181151090.171.7525130.01261241211150.212.1030134.6130128126121延伸阅读1、紫外线灭菌法紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，波长为200300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260 nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2），O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气
9、及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜。此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外线灯以前，可在无菌室内（或接种箱内）喷洒3-5的石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面，凳子可用2-3的来苏尔擦洗，然后再开紫外线灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。2、化学试剂灭菌大多数化学药剂在低浓度下起抑菌作用，高浓度下起杀菌作用。常用5%石炭酸、70%乙醇和乙二醇等。化学灭菌剂必须有挥发性，以便清除灭菌后材料上残余的药物。化学灭菌常用的试剂有表面消毒剂、抗代谢药物（磺胺类等）、抗生素、生物药物素。抗生素是一类有（由）微生物或其他生
10、物生命活动过程中的（删除）合成的次生代谢产物或人工衍生物，他（它）们在很低浓度时就能抑制或感染它种生物（包括病原菌，病毒，癌细胞等）的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂。气体灭菌法，利用环氧乙烷或甲醛性杀微生物的一种方法。本办法主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品、纤维制品等，用于设施、设备或粉末状的医药品等，使用气体灭菌时，其被灭菌的物品以未变质为前提条件；药液灭菌法，是用药液杀灭微生物的方法。本办法主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品、纤维制品等物品的灭菌，还可用于手指、无菌箱或无菌设备等的消毒，药液灭菌用于未变质的物品。通常使用的有酒精（70-75%
11、乙醇）、0.11 % （w/v）盐化苯类溶液、甲酚、苯酚水或福尔马林水等。三、实验材料1、各种玻璃器皿、试管刷、洗涤剂、培养皿、移液管、牛皮纸或报纸等。2、棉花、纱布、线绳、三角瓶和试管等。3、高压蒸汽灭菌锅。四、实验步骤1.棉塞制作2. 移液管和培养皿的包扎3. 高压蒸汽灭菌锅的操作（1）加水：将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水使水面与三角搁架相平为宜。（2）装料：放回内层锅，并装入待灭菌物品。（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。（4）排气：通电加热，待冷空气完全排尽后，关上排气阀。（5）升压至0.1Mpa。（6）保压：当锅内压力
12、升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5，20min灭菌。（7）降压：灭菌所需的时间到后，关闭电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。（8）无菌检查：将取出的灭菌培养基放入37温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。五、注意事项1切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。2压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。六、实验结果1、主要的
13、灭菌技术有哪几种？2、灭菌锅的使用（步骤）3、玻璃器皿包扎（培养皿、移液管）操作：每人尝试使用手提式灭菌锅1次，每组制作试管塞4个、三角瓶塞3个（2小，1大），练习包扎移液管4根，包扎玻璃培养皿1组灭菌。七、思考题1、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较的实验方案。2、高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕之后，为什么待压力降至“0”时才能打开排气阀，开盖取物？3、你知道紫外线灯管是用什么玻璃制作的？为什么不用普通玻璃？实验二 培养基的制备一、实验目的1、学习掌握培养基的配制原理；2、通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法
14、和步骤。二、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖和代谢的营养物质，需要适宜的pH值、一定的缓冲能力及合适的渗透压。在培养皿内培养微生物时需要添加凝固剂，实验室常用凝固剂是琼脂，即从石花菜等海藻中提取的多糖，是应用最广泛的凝固剂，它在96-100融化，46以下凝固，培养基经灭菌后方可使用。（1）培养基据组成成分可分为:合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。（2）据用途可分为：基础培养基：能满足各种微生物的营养需求的培养基。选择培养基：加入某种物质抑制其他微生物生长，使目标微生物得到富集
15、，便于分离。鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性。鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。如常用的麦康凯培养基，它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）（3）从培养基的物理状态可分为： 液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体
16、状培养基。延伸阅读牛肉膏蛋白胨培养基的一种应用最广泛和最普通的细菌基本培养基，有时又称普通培养基，其中牛肉膏为微生物提供碳源 、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。（1）牛肉膏蛋白胨培养基适用于培养一般细菌，其配制方法是： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 20g 水 1000ml pH 7.47.6（2）高氏1号培养基（适用于培养放线菌）可溶性淀粉 2gKNO3 0.1gK2HPO4 0.05gMgSO47H2O 0.05gNaCl 0.05gFeSO47H2O 0.001g （可用母液法）琼脂 2g水 100mLpH 7.47.6（3）
17、孟加拉红培养基（适用于培养分离真菌）蛋白胨 5g 葡萄糖 10g 磷酸二氢钾 1g 硫酸镁(MgSO47H2O) 0.5g 琼脂 20g 1/3000孟加拉红溶液 100mL 蒸馏水 1000mL 氯霉素 0.1g三、实验材料：1、溶液和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L HCl、1mol/L NaOH等。2、仪器和其他用品：天平、试管、量筒、小烧杯、玻璃棒、药匙、pH试纸、棉花塞、报纸、棉绳、标签、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、电炉等。四、实验步骤（1）称量。l 蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。l 牛肉浸膏用小烧杯或培养皿称量，然后热水溶化转移。l 称药品时严防药品混杂，一把药
18、匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。l 瓶盖不要盖错。（2）熔化。l 配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化。l 向烧杯中加入少许所需要的水量，然后隔以石棉网小心加热，用玻棒搅拌，待药品完全溶解后定容，补足水分。l 在琼脂溶化时，应控制火力，以免沸腾而溢出容器。需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。（3）调pH。l pH勿调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。灭菌后pH值会下降0.10.2，在做培养基校正pH值时，应比实际值高0.10.2。l 若偏酸，滴加1mol/L NaOH调整，若偏碱，滴加1mol/L HCl调整（4）过滤。用滤纸或纱布过滤，供一般用的培养基此步骤可
19、省略。（5）分装。分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免引起污染。注意：固体装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，半固体1/3，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。（6）加塞。培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶上塞好棉塞，以阻止外界微生物污染培养基，并保证有良好的通气性能。（7）包扎。加塞后，将全部试管用棉绳捆好，再在棉塞外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，最后用扎好。同时用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别。（8）灭菌。将上述培养基以0.103MPa，121，15min高压蒸汽灭菌。（9）搁置斜面。灭菌的试管培养基冷却至50左右，将试管一端倾斜搁在玻璃棒或其他合适高
20、度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管长的一半为宜。（10）无菌检查。将灭菌培养基于37，培养24-48h，以检查灭菌是否彻底。五、注意事项:1. 蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。2. 在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。配置培养基时，不可用铜或铁锅加热熔化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。3. pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。4. 分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。六、实验结果每组配制高氏1号培养基：100m
21、l，试管斜面2个；牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：200ml，试管斜面4个；孟加拉红培养基：100ml，试管斜面2个。剩余三角瓶内培养基保留瓶内，统一灭菌后，下次实验倒平板操作。七、思考题1、 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是否为无菌的？2、 在配置培养基的操作过程中应主要些什么问题，为什么？3、 马丁氏培养基的pH“自然”，根据你配制前2种培养基的经验和所学知识你认为此培养基灭菌后应是偏酸还是偏碱？为什么？实验三 无菌操作技术一、实验目的1、熟练掌握从固体培养物和液体培养物中转接微生物的无菌操作技术；2、体会无菌操作的重要性；3、掌握倒平板的基本操作方法。二、实验原理在微生
22、物学实验或科研生产中，要经常地把一定种类的微生物菌种接种或移植到新鲜培养基中。由于我们接种的微生物都是纯种的，所以接种工作都必须在无菌环境下（在无菌室或超净工作台）进行，并严格遵守无菌操作技术。利用接种工具（如接种环、接种铲等）进行菌种的移植。因此无菌操作是接种培养微生物的关键。接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。（1）斜面接种法 把各种培养条件下的菌种，接入斜面上（包括从试管斜面、培养基平板、液体纯培养物等中把菌种移接于斜面培养基上）。这是微生物学中最常用、最基本的技术之一。接种前，需在待接种试管上贴好标签，注明菌名及接种日期。接种最好在无菌
23、室或无菌箱内进行，若无此条件，可在较清洁密闭的室内进行。（2）液体接种液体接种是一种用移液管、滴管或接种环等工具将菌液移接到培养基中的方法。吸管不同于其它接种工具，不能灼烧，可预先对其进行烘烤法灭菌。（3）穿刺接种穿刺接种常用于保藏菌种或细菌运动性的检查。一般适用于细菌、酵母菌的接种培养。用接种针沾取少许菌种，移入装有固体或半固体培养基的试管中，自培养基中心垂直刺入到底，然后按原来的穿刺线将针慢慢拔出。三、实验材料：超净工作台、接种环等接种工具、斜面培养基、酒精灯、酒精棉球等。接种工具有：接种环、接种钩、接种针、接种圈、接种锄、玻璃涂棒、其他接种工具。四、实验步骤1、无菌操作要点1）要求建立“
24、有菌概念”。2）接种时要有一个洁净的环境，整个操作过程必须在火焰旁进行。3）接种环，棉塞一定要拿在手上，不能随便乱丢。2、用接种环转接菌种接种细菌应用接种针（环）来沾取细菌标本，进行接种。接种环与接种针为用白金丝或合金丝所制，亦可用电炉丝代替，因它能耐高热且散热快，便于接种前后通过火焰灭菌（整个接种环烧红即达到灭菌目的）。在使用接种环时一般用右手持笔式较为方便，左手可持培养基进行配合，其接种程序可分为：灭菌接种环稍冷沾取细菌样品进行接种（包括：启盖或塞、接种划线、加盖或塞）进行接种环灭菌等五个程序。不同培养基，接种方法也不同。接种方法：A、接种前用酒精棉球擦净桌面；B、将试管贴上标签，注明菌名
25、、接种日期、接种人姓名等，然后用酒精棉球擦手消毒；C、点燃酒精灯以后，在火焰旁将每一支试管内的棉塞稍微转一下，使其松动，以便在接种时易拔出，并将试管放在试管架上，放在接种台的右前方；D、将菌种和斜面培养基的两支试管，用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间的部分，斜向上，并使他们呈水平位置，也可将试管横放在左手掌中央，用四个手指托住试管，大拇指压在试管上，斜面向上；E、右手拿接种环，在火焰上将环的部分烧红灭菌，环以上凡在接种可能进入试管内的部分，均应通过火焰灼烧。（见图）以下操作，需要使管口靠近火旁。F、用右手小指、无名指和手掌拔掉棉塞；G、以火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口，使
26、试管口沾染的少量菌得以烧死；H、将烧过的接种环伸入菌种试管内，先将环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的菌体，然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种环抽出试管（图），注意尽量不要使环的部分碰钉子到管壁，取出后不可使环通过火焰；从一个试管移种到另一试管I、迅速将接种环在火焰旁伸进另一试管，在斜面培养基上从底部划线到顶部，但不要把培养基划破，也不要使菌种沾染管壁；J、取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上，不要用试管去迎棉塞，以免试管在运到时灌入不洁的空气；K、将接种环在火焰上再灼烧灭菌，放回原出后，再腾出手来将棉塞塞紧，将新接种的斜面试管放在试管架上；L、接种后的斜面培养基
27、，放在恒温箱内培养。3、液体培养基中的菌种接入液体培养基中接种工具：移液器，无菌移液管和无菌滴管移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。4、倒平板操作当培养基冷至45左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30培养2448h，然后观察结果。五、实验结果操作：每组倒2皿高氏一号培养基，2皿孟加拉红培养基和6皿牛肉膏蛋白胨培养基（4个
28、玻璃培养皿，2个一次性塑料培养皿）。通过无菌接种技术每组各接一支大肠杆菌试管和一支金黄色葡萄球菌试管。每组各倒3种不同类型的培养基3个平板以备下次实验使用。六、思考题1、为什么接种完毕后，接种环还必须灼烧后再放回原处，吸管也必须放进废物桶中？实验四 实验室环境和人体表面的微生物检查一、实验目的1、证实实验室环境与人体表面存在微生物；2、体会无菌操作的重要性；3、观察不同类群微生物的菌落形态特征。二、实验原理如何知道我们周围“看不见”的微生物变得可以看得见。通过“放大”成子细胞群体（菌落），使我们看得到它们的存在，即通过培养的方法使肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个菌聚
29、集在一起的肉眼可见的菌落,来检查实验室环境和人体表面的微生物，从而使我们牢固树立“无菌概念”。平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内每一菌体既可以通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑、边缘整齐或者不整齐，菌落透明或半透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此可以通过平板培养基来检查环境中细菌的数量和类型。三、实验材料：1、培养基牛肉膏蛋白胨琼脂平板2、酒精灯、记号笔、培养皿、恒温培养箱、打火机等四、实验步骤1
30、、标记培养皿标记时在其边缘写上自己的实验项目、名字和日期，如果同一培养皿有多个小区时，要在各个小区内分别标记待处理的样品名，为了不影响观察，可用符号或者数字表示。注意：不能在皿盖上作标记，因为在微生物学试验中，经常需要同时观察很多平板，很容易错盖皿盖。分别在两套塑料一次性平板底部用记号笔划分出4个小区，在4个小区内分别标上平皿1：A、B、C、D平皿2：E、F、G、H另外2个玻璃培养皿平板分别在标签上标记空气1、空气22、人体表面微生物的检查（1）手指表面：在火焰旁，半开皿盖，用洗前的手指在平板A区轻轻按一下，迅速盖上皿盖。然后用洗手2次，自然干燥后，在平板B区轻轻按一下，迅速盖上皿盖。（2）头
31、发：将你的1-2根头发轻轻放在平板C区，迅速盖上皿盖。（3）鼻腔：取出灭菌的湿棉签在自己鼻腔内滚动数次后，立即在平板D区轻轻摩擦2-3次，盖上皿盖。3、实验室环境的检查（1）将标有“空气1”的平板在实验室打开皿盖，使培养基表面完全暴露在空气中，20分钟后盖上皿盖。（2）将另一标有“空气2”的平板同样操作，置于一个你认为空气中微生物数量较多的环境内，20分钟后盖上皿盖。注意：在记录本上记下“空气X分别代表的含义。（3）按同样方法取灭菌湿棉签，在实验台等4个你认为微生物较多的地方擦拭，再分别在第2个塑料平板的E、F、G、H相应区域滚动接种。（注意做好取样地点记录）4、培养将所有的琼脂平板翻转，使皿
32、底朝上，置37摄氏度培养1天。5、菌落特征描述如下（1）大小：大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准；（2）颜色：黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等；（3）干湿情况; 干燥、湿润、粘稠；（4）形态：圆形、不规则等；（5）高度：扁平、隆起、凹下；（6）透明程度：透明、半透明、不透明；（7）边缘：整齐、不整齐。五、实验结果菌落ABCDEFGH空气1空气2数量*大小颜色干湿情况形态高度透明程度边缘简要说明*菌落数量可用+和-符号表示，从多到少依次为：+，+，+，+，+，-六、思考题1、列举2-3类微生物，说明它们在本实验条件下（肉膏蛋白胨琼脂平板，37
33、）不能生长。2、比较各种来源的样品，哪一种菌落数和菌落类型最多？为什么？实验五 普通光学显微镜的使用及微生物形态观察一、实验目的1、复习普通光学显微镜的结构、各部分功能和使用方法；2、学习掌握油镜的使用方法及油镜使用中的注意事项；3、利用油浸系物镜观察细菌。二、实验原理微生物的个体微小，必须借助显微镜才能观察到。因此，显微镜就成为微生物学研究工作者不可缺少的基本工具。显微镜的结构1、机械装置（1）镜座：是显微镜的底座，支持整个镜体，使显微镜放置稳固。（2）镜柱：镜座上面直立的短柱，支持镜体上部的各部分。（3）镜臂：弯曲如臂，下连镜柱，上连镜筒，这取放镜体时手握的部位。镜臂的下端与镜柱连接处有一
34、活动关节，可使镜体在一定范围内后倾，便于观察。（4）镜筒：为显微镜上部圆形中空的长筒，其上端放置目镜，下端与物镜转换器相连，并使目镜和物镜的配合保持一定的距离，其作用是保护成象的光路与亮度。（5）物镜转换器：接于镜筒下端的圆盘，可自由转动，盘上有3-4个螺旋圆孔，为安装物镜的部位，当旋动转换器时，物镜即可固定在使用的位置上，保证物镜与目镜的光线合轴。（6）载物台：为放置玻片标本的平台，中央有一圆孔，以通过光线。两旁装有压片夹或移动器，可固定玻片标本和移动玻片。（7）调节器：为了得到清晰的物像，必须调节物镜与标本之间的距离，使它与物镜的工作距离相等。这种操作叫调焦。在镜臂两侧有粗、细调焦螺旋各一
35、对，旋转时可使镜筒上升或下降。大的一对是粗调焦螺旋，调动镜筒升降距离大，旋转一周可使镜筒移动2毫米左右。小的一对是细焦螺旋，调动镜筒的升降距离很小，旋转一周可使镜筒移动约0.1毫米。在用低倍物镜观察时，使用粗调焦螺旋；用高倍物镜观察时，用细调焦螺旋。2、光学系统（1）光源（2）聚光器（或镜）：装在载物台下，由聚光镜（几个凸透镜）和虹彩光圈（可变光栏）等组成。它可将平行的光线汇集成束，集中在一点，以增强被检物件。聚光器可以上下调节，如用高倍镜时，视野范围小，则需上升聚光器，用低倍物镜时，视野范围大，可下降聚光器。（3）光圈：装在聚光器内，位于载物台下方，拨动操纵杆，可使光圈扩大或缩小，借以调节通
36、光量。 3、光学部分（1）物镜：这是决定显微镜质量的最主要部件，安装在镜筒下端的物镜转换器上，一般有三个放大倍数不同的物镜，即低倍（10）、高倍（40）、油镜（100）。使用油镜时，必须在盖玻片上和聚光器上滴加一滴香柏油（镜油），然后才能使用。在物镜上，有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：物镜镜口率（N.A.）工作距离（mm）100.257.0400.650.651001.300.15（2）目镜：安装在镜筒上端，它的作用是将物镜所成的像进一步放大，使之便于观察。其上刻有5、10、16等，表示不同放大倍数，可根据当时需要选择使用
37、。目镜内的光栏上可装一段头发，在视野中则为一黑线，叫指针，可以用它指示要观察的部分。显微镜的放大倍数和分辨率：放大倍数=接物镜放大倍数接目镜放大倍数显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：D=/2nsin。式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离，l：可见光的波长（平均0.55mm)，n：物镜和被检标本间介质的折射率，a：镜口角（即入射角）。与其他物镜不同，油镜需在载玻片与镜头之间加滴镜油，原因有二：1）增加照明亮度。油镜的放大倍数可达100，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。为了不使通过的光线有所损失，必须加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿
38、的镜油。通常用香柏油（n=1.52）。2）增加显微镜的分辨率，油镜的分辨率可达到0.2m左右。三、实验材料：1、自制观察玻片；2、香柏油、二甲苯等；3、普通光学显微镜等。四、实验步骤（一）显微镜的使用操作1、显微镜的安置；2、光源调节；3、调节双筒显微镜的目镜；4、聚光器数值孔径的调节；5、观察。（二）显微镜观察的操作顺序1、低倍镜观察观察任何标本，都必须先用低倍镜，因为低倍镜的视野范围大，容易发现目标和确定观察的部位。两眼从侧面注视物镜，并慢慢按顺时针方向转动粗调焦螺旋，使镜筒徐徐下必至物镜玻片约5毫米处，接着用左眼注视镜筒内，同是按反时针方向，向右、向内转动粗调焦螺旋使镜筒缓慢上升，直到看
39、见清晰的物像为止（注意不可在调焦点时边观察边下必镜筒，否则会使物镜和玻片触碰，压碎破片，损坏物镜）。如一次调节看不到物像，应重新检查材料是否在光轴线上，重新移正材料，再重复上述操作过程直至物像出现和清晰为止。为了使物像更加清晰，此时可使用细调焦螺旋，轻微转动到使物像最清楚时为止，但切忌连续转动多圈，以免损伤仪器的精确度。当细调焦螺旋向上或向下转不动时，就是转到了极限，千万不能再硬拧，而应重新调粗调焦螺旋，把物镜与标本的距离稍稍拉开后，再反拧细焦螺旋，约10圈左右（因一般可动范围为20圈）。2、高倍镜观察先用低倍镜找到要观察的物像，然后把物像移至视野中央，最后换用高倍镜，再调节细准焦螺旋对焦，调
40、清物像，同时应调节光圈以增加通光量。在换用高倍镜观察时，视野变小变暗，所以要重新调节视野的亮度，此时或升高聚光器或放大虹彩光圈。3、油镜观察（1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁；（2）调节光亮度；（3）低倍镜观察：粗调、细调；（4）依次再进行中倍、高倍观察；（5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止；（6）换片：另换新片，必须从第三条开始操作；（7）用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。（三）观察玻片的制
41、作1）取一干净载玻片；2）在载玻片中间滴一小滴水；3）用接种环取少量斜面培养基上的细菌于水中；4）自然干燥；5）火焰固定；6）染色：用染液染色一分钟；7）水洗；8）自然干燥。五、注意事项:1.显微镜使用中的注意事项（1）不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏； （2）镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度；（3）观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面：（4）观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图；（5）拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜
42、座，不可单手拿，更不可倾斜拿；（6）显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。2.油镜使用注意（1）在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。（2）转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。六、实验结果取上次实验得到的2-3个菌落制片，绘制你的观察结果。七、思考题1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加香柏油有什么作用？2、根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小选择不同的物镜进行有效的观察。
43、实验六 革兰氏染色法一、实验目的1、了解革兰氏染色原理；2、巩固显微镜操作技术；3、学习并掌握革兰氏染色法。二、实验原理革兰氏染色与细胞壁密切相关，是C. Gram（革兰）于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物。革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 革兰氏阴性杆菌革兰氏阳性杆菌 Procedures of Gram Staining初染1min结晶紫媒染1min碘液脱色30s复染2min复红/番红95%乙醇G+G-革兰氏染色三、实验材料：1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、环境中分离得到的菌种；2、试剂：草酸铵结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、番红染液；3、仪器材料：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、擦镜纸、二甲苯、香柏油、生理盐水等。附：实验相关试剂配制方法1、结晶紫染色液(Huclk