微生物综合实验(20页).doc

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1、-微生物综合实验-第 20 页 微生物综合实验 土壤微生物的分离、纯化及鉴定摘要： 利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，通过对菌落形态的观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果，辅以菌株耐药性测定，最终通过查阅伯杰氏系统细菌学手册对照种属特征，判断所分离纯化的细菌所属的属。关键词：土壤微生物，分离纯化，鉴定，耐药性，伯杰氏系统细菌学手册前言： 土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。据统计，每克土壤中含有微生物数量几亿到几十亿不等，包括了从细菌，真菌，藻类以及原生动

2、物几乎所有的类群。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm30cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌数减少。土壤内含有细菌生活所需的氮素养料(NH4+，No3-)，各种盐类及微量元素，一般还含有1一15有机物质(来源予死亡的动植物及动物排泄物)。地表下一定深度的土壤中含有丰富的水分和空气。土壤的PH接近中性，也适宜细菌生活。土壤是由大小不等的团粒组成，团粒之间的孔隙为水和空气所充满，细菌就是生活在这些孔隙中。由于胶体表面的吸附性质，使细菌和土壤中的有机、无机物质互相吸附着而形成无机有机生物复

3、合体。所以土壤是细菌生活的良好环境，在其中含有大量的细菌和其它微生物。一克耕作土壤约含几亿细菌和放线菌，几十万个霉菌、5万个藻类植物和25万个原生动物。 通过土壤微生物的分离纯化，得到纯种，再进行相关的实验，如：菌落观察、革兰氏染色、芽孢染色、生理生化试验等，根据实验结果，查阅伯杰氏系统细菌学手册确定所分离纯化细菌所属的属。在此过程中熟悉相关操作。【实验目的】1. 掌握从土壤中分离纯化细菌的能力2. 掌握培养基的制备与灭菌技术3. 微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。 4. 掌握微生物基本鉴定的方法。5. 学会利用微生物的生理生化特性对微生物进行定属。6. 实验基本操作的练习和提高。7. 提高

4、团队合作的意识。【实验器材】1、 土壤样品： 山东大学微生物楼门口石碑后10cm深的土壤样品10g2、 试剂：a. 微生物基本鉴定：草酸铵结晶紫染液、卢戈氏染液、95%乙醇，番红复染液、5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液等b. 生理生化实验：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水等c. 头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类 四种抗生素d. 其它：香柏油和二甲苯、无菌水等3、 仪器和用具： 酒精灯、接种针、平皿、试管、试管架、烧杯、量筒、锥形瓶、德汉氏小管 、显微镜、 擦镜纸、PH试纸、载玻片、载玻片夹子、玻璃涂棒、镊子、滴管、纱布、牛皮纸、等4、 培养基 LB液体培养基、牛肉

5、膏蛋白胨琼脂培养基 淀粉培养基、油脂培养基（大分子物质水解实验） 葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内附倒置的德汉氏小管）（糖发酵实验） 蛋白胨水培养基（吲哚实验） 葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红实验）【实验原理】一、 土壤微生物的的分离及纯化自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物生活的大本营，可以从中分离到很多有价值的菌株。此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体

6、，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。 微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态， 也可以用肉眼观察其菌落形态。 前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。平板分离法主要有： I平板划线分离法 II稀释涂布平板法.后者除能有效分离纯化微生物外，还可用于测定样品中活菌数量。平板菌落计数法: 是将待测菌液经过适当稀释，涂布在平板上,经过培养后，在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖形成的，有的可能来自2个或多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往比样品中实际

7、细胞数低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 菌落形态描述: 通过培养的方法使肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个聚集在一起的肉眼可见的菌落。平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，将样品接种于培养基上，在37温度下培养，12天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。二、 微生物基本鉴定 1、 革兰氏染色革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。革兰氏染色法不仅能观

8、察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G- 表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）

9、的颜色，因此呈现红色。 2、 芽孢染色 芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。是否产生芽孢，以及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。 与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚而致密，通透性低，不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时，菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍保留。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明

10、显地衬托出芽孢，便于观察。3、细菌运动性检测半固体穿刺法 将细菌穿刺培养于半固体培养基中，经培养后，无鞭毛的细菌沿穿刺线生长，穿刺线清晰说明该种菌不具有运动性；有鞭毛的细菌沿穿刺线向四周扩散，穿刺线模糊不清，说明该种菌具有运动性。 同时可从半固体穿刺实验结果中得到菌体是厌氧性还是好氧性菌。若为厌氧性菌，穿刺线下方的菌较多，且若有运动性，扩散程度要大于靠近空气的一端；反之，则为好氧性菌。三、生理生化实验细菌鉴定和分类依据 在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶。许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以促进细胞

11、外的化学反应。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的最终产物的不同，反映出他们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。具体实验原理如下：1、淀粉水解 由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，所以必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内。如淀粉酶将淀粉水解为小分子的糊精,双糖和单糖，能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉。已知淀粉遇到碘会显现蓝色，因此可通过在淀粉培养基上滴加碘液来判断微生物是否能产生淀粉酶分

12、解淀粉，菌落周围不呈蓝色，出现无色透明圈，则该菌种能够水解淀粉。2、油脂水解 脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸，而产生的脂肪酸可改变培养基的PH,因此在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后可通过观察菌苔的颜色判断菌种是否能够水解油脂，若出现红色斑点，则说明这种菌可产生分解油脂的酶。3、 葡萄糖和乳糖发酵实验 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡

13、萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。A 培养前的情况B 培养后 产酸不产气C 培养后 产酸产气 图1：糖发酵实验4、吲哚实验 用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。5、甲基红实验 某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，

14、后者进而被分解产生甲酸、乙酸和乳酸等多种有机酸，使培养基的PH值降低，加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转变为红色，即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但是这个实验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上还是有价值的。这两种细菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养的后期仍能维持酸性（PH4),而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇，丙酮酸等，使PH升至6左右。因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。四、 菌株耐药性的测定药物敏感试验（K-B纸片琼脂扩散法）基本原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向

15、纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。 抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈俞大，MIC俞小。根据抑菌圈的大小（不同抗生素其抑菌圈大小的标准不一致），判断为敏感（S），耐药（R）或中介度（I）。某些细菌可蔓延生长至某种抗生素的抑菌圈内，如磺胺药抑菌圈内可能有微量的细菌生长，可忽略不计，应以外圈为准。K-B纸片琼脂扩散法的特点：a.优点：药敏试验具有重复性较好、操作简便、试验成本相对较低、结果直观、容易判读、便于基层开展的优点。b.缺点：K-B纸片琼脂扩散法虽然是一

16、种传统、经典的药敏试验方法但随着计算机的发展为细菌检验自动化奠定了良好基础，全自动微生物分析仪的推广和应用K-B纸片扩散法出现药敏试验假耐药、受人为因素影响较大、试验耗时长的缺点也渐渐体现出来，同时快速性、准确性方面存在不足。 【实验内容及步骤】一、土壤微生物的分离及纯化1、获取土壤样品 取微生物楼门口石碑后10cm以下深度的土壤样品10g备用。2、 制备土壤原液（1）配置100mlLB液体培养基，高压灭菌锅灭菌。（2）将10g土壤样品于烧杯中加适量蒸馏水制成悬液后，用纱布过滤后取10ml加入到100mlLB液体培养基，37培养箱中培养5小时。3、制备土壤稀释液（1）准备5个试管，每个试管装9

17、ml蒸馏水，包扎好后高压灭菌制成无菌水。（2）用无菌移液管吸取土壤原液1mL,加入装有9ml无菌水的试管中,即为10-1土壤稀释液，再从10-1土壤稀释液中取1ml，加入另一个装有9ml无菌水的试管中，即为10-2土壤稀释液，重复操作，可依次制成10-3-10-5的土壤稀释液。注意：操作时，每一个稀释度换一支移液管，每次吸取土壤稀释液，要将移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。制好土壤稀释液后，尽量摇匀，使其混合均匀。示意图如下： 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 稀释过程示意图（图中左侧锥形瓶中的为土

18、壤原液，右侧试管中土壤稀释度分别为： 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5）（3）将10-3、10-4、10-5三个稀释度的试管放入37培养箱中培养24h.4、涂布平板 （1） 配置牛肉膏蛋白胨培养基，包扎好平板，高压灭菌锅灭菌。（2） 倒平板。三个稀释梯度，每个稀释度做3个涂布平板。（3） 涂布平板。分别用移液枪吸取0.2ml土壤稀释液于倒好的平板上，用刮刀分别涂布（酒精浸泡过）5、培养 将三个稀释梯度的9个平板贴好标签后放入37培养箱中，培养24h.6、平板计数及菌落观察 （1）观察平板中的菌落形态，作好记录。 （2）将培养好的细菌进行平板计数，计算1g土壤中细菌数。7、 划线

19、分离 将在平板上找到的不同的单个菌落标号为菌-，用接种环进行无菌操作分别进行划线分 离（事先做好平板），培养箱培养1天。8、 纯种保存 将划线分离后得到的纯种菌接种到斜面保存（留做后续鉴定用）二 、微生物基本鉴定1、 革兰氏染色I、流程图：加热、固定洗片、干燥涂片初染水洗媒染水洗脱色水洗复染干燥镜检II、 具体操作： 1)洗片、干燥取一块载玻片，用水浸湿，用手使用去污粉洗净玻片，竖立在一边自然干燥。干燥后在玻片的一面用记号笔做好标记。方便以后水洗染料，避免洗去细菌。2) 涂片 在标记的载玻片一侧分别滴加半滴无菌水。分别取菌-四种处于活跃生长期的菌种，以及标准菌株-大肠杆菌与金黄色葡萄球菌按常规

20、方法涂片（不宜过厚）。3)加热、固定用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对6种菌进行干燥和固定。 4) 初染 滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色1.5min后水洗；5) 媒染 先用碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min后水洗； 6) 脱色 先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗； 7) 复染 先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染2min后水洗； 8) 镜检 将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断其他菌的染

21、色结果。第二次取菌-及标准菌株于另一玻片再次进行染色，操作方法相同。2、 芽孢染色I、流程图：加热、固定洗片、干燥涂片染色水洗脱色色复染水洗干燥镜检 II、具体操作：1)洗片、干燥取一块载玻片，用水浸湿，用手使用去污粉洗净玻片，竖立在一边自然干燥。干燥后在玻片的一面用记号笔做好标记。方便以后水洗染料，避免洗去细菌。2)涂片 取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多）3)加热固定 涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，

22、温度以手背感觉微微发烫为标准；4)染色 向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌位置，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸气并维持5min，加热时注意补充染液，切勿涂片干涸。5) 脱色 冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水为无色。6) 复染 用0.5%的番红水溶液复染2min。7) 水洗 用缓流自来水冲洗至流出水为无色。8) 干燥镜检 将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野 后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。 同样的操作方法进行菌-七种菌的芽孢染色。3、 半固体穿刺1） 培养基配置：培养基中琼脂量减半，其余按照牛肉膏蛋白胨配方按比例添

23、加。配好后，倒 入14个试管中，高压灭菌锅灭菌。2） 接菌：待试管中培养基冷却至室温后，进行无菌操作，将-七种菌分别用接种针进行 半固体穿刺。在进行一组平行对照。3） 培养：将接好菌的14个试管放入37培养箱中培养24h。4） 观察：将试管取出后，观察菌的生长情况，是沿着穿刺线生长或是在穿刺线周围扩散生长， 记录结果，判断每种菌的运动性；同时可观察靠近试管口的一端和远离试管口的一 端菌的生长情况，记录结果，判断其厌氧性。三、 生理生化实验细菌鉴定和分类依据1、淀粉水解实验 （1）倒平板：按照淀粉培养基配方配制固体淀粉培养基，灭菌，待培养基冷却至50左右， 在酒精灯火焰旁倒平板，每种菌做一个平行

24、对照组，共需4个平板。（2）标记：用记号笔在平板底部划成四部分，标好要进行接种的菌的编号，以免混淆。（3）接种：在无菌操作台上，将菌-七种菌分别在标记好的区域内点种，注意仅用接种 针接触极少面积的培养基，避免因接种菌量过多而造成假阳性。（4）培养：将平板倒置，在28恒温箱中培养两天。（5）观察：取出培养基，观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入适量卢戈氏碘液于 平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察培养皿中菌落周围是否 有无色透明圈产生，若有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，该种菌为阳性， 反之则为阴性。记录实验结果。2、油脂水解试验（1）倒平板：按照油脂培养基配方配制固体油

25、脂培养基，灭菌，待培养基冷却至50左右， 充分振荡，使油脂均匀分布，每种菌做一个平行对照组，共需4个平板。（2）标记：用记号笔在在平板底部划成四部分，并标好需要接种的菌的编号。（3）接种：在无菌操作台上将菌-七种菌分别划十字线接种于平板相对应部分的中心。（4）培养：将平板倒置，在28温箱中培养两天。（5）观察：取出平板，观察菌苔颜色，如果出现红斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。记录 实验结果。3. 葡萄糖发酵实验（1） 培养基：按照糖发酵培养基配置葡萄糖发酵培养基，分装至试管中，先将德汉氏小管中 注满培养基，再把德汉氏小管倒置放入试管中，注意不要让德汉氏小管中进入 空气，每种菌做一个平行对照组，

26、并准备一只试管做空白对照组，共需15只试 管，灭菌。（2） 接种：待培养基冷却至常温时，在无菌操作台上，取葡萄糖发酵培养基试管7只分别接 入菌-七种菌，接种后轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡；再 取7只试管做一组平行对照，第15支不接种，作为空白对照组。在各试管外壁 上贴上标签，标签上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌编号。（3） 培养：把接种后的试管在试管架上放好，将其放入培养箱中于28下培养两天。（4）观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，并记录实验结果。4. 乳糖发酵实验（1） 培养基：按照糖发酵培养基配置乳糖发酵培养基，分装至试管中，用胶头滴管往德汉氏 小管中注

27、满培养基，再把德汉氏小管倒置放入试管中，注意不要让德汉氏小管 中进入空气，每种菌做一个平行对照组，共需14只试管， 灭菌。（2） 接种：待培养基冷却至常温时，在无菌操作台上，取乳糖发酵培养基试管7支分别接入 菌-七种菌，接种后轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡；再取7 只试管做一组平行对照，在试管外壁上贴上标签，标签上分别标明发酵培养基的 名称和所接种的细菌编号。（3） 培养：把接种后的试管在试管架上放好，将其放入培养箱中于28下培养两天。（4）观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，并记录实验结果。5.吲哚实验（1） 培养基：按照蛋白胨水培养基配方配制培养基，分装至试管中，每

28、种菌做一个平行对 照组，并准备一只试管做空白对照组，共需15只试管，高压灭菌锅灭菌。 （2） 接种：待培养基冷却后，在无菌操作台上将菌-七种菌分别接入7支蛋白胨水培养 基，再取7只试管做一组平行对照，剩余一只试管不接种，作为空白对照，贴好 标签。（3）培养：把接种后的试管放在试管架上放好，将其放入培养箱中于28下培养两天。（4）观察：往培养后的蛋白胨水培养基内加入3-4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚 上升后，沿试管避徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物 为阳性反应。观察加入试剂后试管内的颜色反应并记录实验结果。6.甲基红实验（1） 培养基：按照葡萄糖蛋白胨水培养基配方

29、配制培养基，分装至试管中，每种菌做一个平 行对照组，并准备一只试管做空白对照组，共需15只试管，高压灭菌锅灭菌。（2） 接种：待培养基冷却后，在无菌操作台上将菌-七种菌分别接入7只装有葡萄糖蛋 白胨水培养基的试管中，再取7只试管做一组平行对照，剩余一只试管不接种， 作为空白对照，贴好标签。（3） 培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于28下培养 两天。（4） 观察：培养两天后后，将每支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入2滴甲基红试剂，培 养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。观察试管内的颜色变化，并记录实 验结果。四、 菌株耐药性测定1） 培养基配置：配置700ml牛

30、肉膏蛋白胨液体培养基，分装置7个锥形瓶中；100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基、圆形滤纸片若干；将上述物品进行高压灭菌锅灭菌。2） 配置抗生素：配置浓度为1ug/ul的头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类 四种抗生素。（本次试验中所用的抗生素为6组配置，与6组共用）3） 菌种培养：将已获取的-七种菌株分别放入灭好菌的100ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养18-24h。4） 倒平板：将灭好菌的牛肉膏蛋白胨培养基倒入7个平板中，冷却后，在平板底部用记号笔画十字线，将平板分为四部分，为下一步实验做好准备。5） 涂布：将-七种菌分别进行涂布，涂布完成后，静置15min。6） 放置滤纸片：将已经灭菌

31、干燥好的圆形滤纸片放置于平板的四个部分的中心。7） 加抗生素：用移液枪于滤纸片上加已配好的抗生素（所加含量30ul)。8） 培养：37培养16-18小时。9） 观察：测量并记录抑菌圈的大小。【实验结果】1. 土壤中细菌菌落数量及菌落特征（1） 菌落特征描述菌种菌落形状菌落大小菌落颜色边缘表面干湿菌近圆小白色整齐凸起湿菌圆小白色整齐凸起湿菌近圆中白色整齐凸起干菌近圆中浅粉不整齐凸起干菌圆小白色整齐凸起湿菌圆中白色整齐凸起湿菌圆小浅粉整齐凸起干（2） 计算1g土壤中细菌总数菌液浓度原浸液10-4平板123平均值菌落数1561581601581g土壤中的细菌总数：1.58107个2. 微生物基本鉴定

32、结果（1） 革兰氏染色（100） 1号菌 2号菌 3号菌 4号菌 5号菌 6号菌 7号菌 局部放大革兰氏染色结果记录如下：菌种菌菌菌菌菌菌菌G+/G-G+G+G+G+G+G+G-（2） 芽孢染色 芽孢染色结果不理想，结合革兰氏染色结果初步判断如下：菌种菌菌菌菌菌菌菌芽孢+-+-位置中生中生不确定不确定无中生无（3） 半固体穿刺 1号菌 2号菌 3号菌 4号菌 5号菌 6号菌 7号菌 表1：半固体穿刺确定运动性实验结果菌种生长情况是否具有运动性菌沿穿刺线向周围大范围扩散生长是，且运动性较强菌沿穿刺线向周围小范围扩散生长是，且运动性较弱菌沿穿刺线向周围大范围扩散生长是，且运动性强菌沿穿刺线向周围小

33、范围扩散生长是，且运动性较弱菌沿穿刺线生长否菌沿穿刺线生长否菌沿穿刺线向周围小范围扩散生长是，运动性一般3. 生理生化实验结果（1）淀粉水解 表1.淀粉水解试验结果(“+”表示阳性，“”表示阴性)菌种阴/阳性结论菌+可以水解淀粉菌+可以水解淀粉菌+可以水解淀粉菌+可以水解淀粉菌+可以水解淀粉菌+可以水解淀粉菌+可以水解淀粉（2） 油脂水解 表2.油脂水解试验结果(“+”表示阳性，“”表示阴性)菌种阴/阳性结论菌+可以水解油脂菌+可以水解油脂菌+可以水解油脂菌+可以水解油脂菌+可以水解油脂菌+可以水解油脂菌+可以水解油脂 表3.葡萄糖发酵试验结果 菌种颜色是否产气结论菌黄色否能分解葡萄糖且产酸不

34、产气菌黄色否能分解葡萄糖且产酸不产气菌黄色否能分解葡萄糖且产酸不产气菌黄色否能分解葡萄糖且产酸不产气菌紫色否不能分解葡萄糖菌黄色否能分解葡萄糖且产酸不产气菌黄色否能分解葡萄糖且产酸不产气空白组紫色否对照组 表4.乳糖发酵试验结果菌种颜色是否产气结论菌紫色否不能分解乳糖菌紫色否不能分解乳糖菌紫色否不能分解乳糖菌紫色否不能分解乳糖菌紫色否不能分解乳糖菌紫色否不能分解乳糖菌紫色否不能分解乳糖空白组紫色否对照组 表5.吲哚试验结果（“+”表示阳性，“”表示阴性）菌种是否产生红色环状物阴/阳性结论菌是+可以分解色氨酸生成吲哚菌是+可以分解色氨酸生成吲哚菌是+可以分解色氨酸生成吲哚菌是+可以分解色氨酸生成

35、吲哚菌否-不生成吲哚菌是+可以分解色氨酸生成吲哚菌是+可以分解色氨酸生成吲哚 表6.甲基红试验结果（“+”表示阳性，“”表示阴性）菌种颜色阴/阳性结论菌红色+1号菌能分解葡萄糖产生有机酸，且在培养期仍维持酸性PH菌红色+2号菌能分解葡萄糖产生有机酸，且在培养期仍维持酸性PH菌黄色-3号菌能将有机酸转化为非酸性末端产物菌红色+4号菌能分解葡萄糖产生有机酸，且在培养期仍维持酸性PH菌无变化无5号菌不能发酵葡萄糖菌黄色-6号菌能将有机酸转化为非酸性末端产物菌黄色-7号菌能将有机酸转化为非酸性末端产物（注：“+”表示在淀粉水解试验、油脂水解试验、甲基红试验、吲哚试验中呈阳性以及在葡萄糖发酵试验、乳糖发

36、酵试验中产酸不产气；“-”表示在淀粉水解试验、油脂水解试验、甲基红试验、吲哚试验中呈阴性以及在葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验中不产酸不产气；“”表示无现象；） 生理生化实验结果总结表：菌种淀粉水解实验油脂水解实验葡萄糖发酵实验乳糖发酵实验甲基红实验吲哚实验菌+-+菌+-+菌+-+菌+-+菌+-菌+-+菌+-+空白组4. 菌株耐药性实验结果 1号菌 2号菌 3号菌 4号菌 5号菌 6号菌1：头孢菌素类(头孢噻吩）2：喹诺酮类（左氧沙星）3：氨基糖苷类（阿卡米星）4：大环内酯类 （阿奇霉素） 7号菌 表7：抗药性观察记录菌种头孢菌素类(头孢噻吩）喹诺酮类（左氧沙星）氨基糖苷类（阿米卡星）大环内酯类（

37、阿奇霉素）菌R(5mm)S(32mm)S(24mm)S(20mm)菌R(10mm)S(27mm)S(30mm)R(6mm)菌R(9mm)S(31mm)S(28mm)R(8mm)菌R(9mm)S(29mm)S(26mm)R(5mm)菌S(18mm)S(27mm)S(20mm)R(13mm)菌R(13mm)S(34mm)S(20mm)S(20mm)菌I(15mm)S(30mm)S(27mm)R(5mm)5. 确定-七种菌株所在属根据上述微生物基本鉴定以及生理生化实验结果，初步确定7种未知菌所在的属如下：菌种形状G+/G-芽孢有无（+代表有芽孢）芽孢位置运动性（+代表有运动性）好氧性（+代表好氧）菌

38、属菌短杆G+中生+芽孢杆菌属菌短杆G+中生+芽孢杆菌属菌杆状G+不确定+芽孢杆菌属菌杆状G+不确定+芽孢杆菌属菌球状G+-无-+微球菌属菌杆状G+中生-+芽孢乳杆菌属菌杆状G-无+假单胞菌属【实验总结】一、实验结果分析平板菌落计数得到的结果，和相关资料中的土壤细菌数相比较相差不大。但在对未知菌种进行基本鉴定实验时，实验结果不是很理想，尤其是芽孢染色的结果不是很可靠，在玻片中仅看到游离芽孢，而很少看到芽孢囊和营养细胞，推测可能原因如下： 所取菌种的培养时间过长，已到达生长的中后期，随着环境中营养物质的消耗，以及细菌代谢产物的积累，使得环境越来越不利于生长，因此产生大量的芽孢。 可能是在用孔雀绿染

39、色后，水洗时没有洗净，细胞还是孔雀绿的颜色。番红水复染时，没有染色成功。一方面可能是染色时间过短，但进行多次染色在延长复染时间的情况下还是不成功，推测另一方面可能是番红水试剂存在问题。因芽孢染色不成功，所以从革兰氏染色结果中初步判断出菌种是否具有芽孢，及芽孢的位置，芽孢不易被染剂染上颜色，且折光率比较高，因此镜检得到的照片中能观察到芽孢的有无及位置。半固体穿刺实验中，从实验结果中可以很容易的判断出菌种是否具有运动性；运动性的有无也是判断菌属的一个重要标准。由于一些实验操作细节处理不当，实验的结果可能存在一定误差，但总体上实验的结果还是具有一定可靠性的。二、 实验内容总结(1)本次实验的内容包括：从土壤样品中分离、纯化出细菌，并进行平板菌落计数。对成功分离出的细菌进行基本鉴定：革兰氏染色、芽孢染色、半固体穿刺等初步判断可能菌属后，设计生理生化实验进行验证。检测分离出的细菌对四种抗生素的耐药性。依据伯杰细菌鉴定手册查出分离出的未知菌种的菌属。(2)心得体会：通过这次综合实验，我们掌握了从土壤中分离、纯化细菌的方法，对微生物的基本鉴定有了进一步的了解，同时锻炼了实验中较基本的操作技能，掌握了配置常用培养基的一般方法和步骤，对无菌操作技术有了一定的了解，并且明白了团队合作的重要性，使组员之间的合作更加高效、密切。