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1、相差显微镜一、实验目的掌握相差显微镜的原理，构造及其使用方法。二、器材与试剂普通复式显微镜，相差显微镜附件：相差物镜、转盘聚光器、调中合轴望远镜与绿色滤色镜、载片、盖片、滤纸、活体生物样品等。三、实验原理在显微镜下镜检时，视场中的样品只有在反射光的波长（颜色）与振幅（亮度）与周围介质有变化时，方能窥见被检样品。活的样品多为无色透明，照明光线通过这种物体时，透过或反射光的波长与振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。必须借助于固定与染色等理化方法，使样品与背景的反射或透射光在波长与振幅上发生变化，即在颜色与亮度上有所差异，以供识别。相差方法应用于生物学上的主要价值，在于它能对透
2、明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定与染色的方法。染色合活体以有害的影响，甚至失真。由此，才使相差法显得异常重要。1相差相差是指同一光线经过折身率不同的介质其相位发生变化产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差的差别太小，我们的眼睛是很难分辨出这种差别的。只有在变相差为振幅差（明暗之差）之后，才能被分辨。当光波通过两种折射率不同的物质时，如空气水，或由空气玻璃，其波长、振幅与相位皆有不同的变化。例如：光波分别通过1cm厚的水与1cm厚的玻璃时，由于两者折射率不同，通过它们的光波在相位上产生一定的差异。通过玻璃的光波相位落
3、后，因为玻璃的密度与折射率比水大。所以，光波的波长与频率都小于水。相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差），介质越厚或折射率越大，光波减速也越大。相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。2衍射与干涉用肉眼看不到的相差，只要利用衍射与干涉现象，把相差变为明暗的振幅差，就可能看到。（1）衍射波在同一均匀媒质里传播是沿直线方向进行的，如果在它传播的方向上，遇到迎面挡住的孔或障碍物不比它的波长大得多，这时波就会明显的绕到障碍物后面或孔的外面去（传播路线发生了弯曲），这种现象叫波的衍射。光也有衍射。光通过大小同光的波长的相差不大的细小物体时，也要发生衍
4、射。（2）干涉在同一种媒质里传播的两列波，如果它们的频率与波长相同，在两列波相交的区域里，由于叠加的结果，每一点的合振幅都是一定的，并且出现振动加强与振动减弱，这就是波的干涉。光也发生干涉。光波通过小颗粒的物体后产生直射光（S）与衍射光（D），衍射光的光波振幅小，相位滞后。在光学系统中，这种直射光与衍射光相遇或光的叠加，振幅发生变化，光线或明或暗，就是光的干涉现象。如果物体粒子是折射率稍大于周围媒质的极小的透明体时，由于光程（折射率与厚度的乘积）比较大，所以通过粒子的光比周围的光在相位上有所推迟。这是因为被检粒子的衍射光相位比直射光相位大约迟1/4波长的缘故。若是在直射光的通过点与大部分的衍射
5、光的通过面放置吸收光的物质或推迟相位的物质时，就能分别改变直射光与衍射光的相位与振幅。如果把直射光相位推迟1/4波长，使之与衍射光保持同一相位，合成波（P）等于直射光与衍射光振幅之与，即P=S+D，振幅加大，亮度提高。相反地，把衍射光相位推迟1/4波长，两者的相差变成1/2波长，合成波的振幅等于两波的振幅差，即P=S-D，这时亮度要减弱、变暗。光线的相位肉眼是看不到的，但是利用衍射与干涉的现象把相位差变成振幅差（明暗反差）就能用肉眼识别。图1-2表示直射光（S细线）与衍射光（D虚线）干涉的现象。D的相位比S被推迟1/4波长。合成波（P粗线）由S与D两者干涉而生成，形成被检物体的像，振幅与S相同
6、，相位稍推迟。图1-2 直射光与衍射光的干涉S：细线，直射光； D：虚线，衍射光；P：粗线，合成波。3相板的作用为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板（phase plate）。在圆形相的平面上，有一圈与周围（里外）相板厚度不同的或凸凹的圆环。其结构如图1-3。相板分两部分：（1）共轭面（conjugate area）：通常为环状，是通过直射光的部分。其环是凸起的，也可能是凹陷的。（2）补偿面（complemetary area）：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。在相板的共轭面或补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质。当光线通过时，使光波的相位或振幅改变，
7、从而达到不同的目的与观察效果。利用相板把光波相位推迟，振幅改变。相板的作用，除推迟直射光与衍射光的相位之外，还有吸收光，从而使亮度改变的作用。物镜的后焦点位于透镜中间而相板位于物镜的后焦面上，所以，相板也安装在透镜中间。图1-3 相板的种类及构造左上：吸收直射光的明反差相板平面与剖面图； 左下：吸收直射光的喑反差相板剖面图； 右上：吸收衍射光的明反差相板平面与剖面图； 右下：吸收衍射光的暗反差相板剖面图； 黑色：吸收光线层； 浅色：推迟相位层； 白色：玻璃。相板的种类比较多，对光的吸收率高低不同，所以产生不同的反差效果，从反差上大致可分下列两类（图1-4）：图1-4 明反差与暗反差左：明反差，
8、直射光（S）与衍射光（D）相位相同，两波干涉结果合成波P=S+D，振幅加大； 右：暗反差，直射光与衍射光相位相差1/2波长，两波干涉结果合成波P=S-D，振幅变小。（1）明反差（bright contrast）或负反差（negative contrast）：是指在相差显微镜的视场中，物像亮度大于背景亮度的现象。在被检物体的折射率大于媒质时，射光被相板的共轭面（因为在共轭面上涂有改变相位与吸收光线的物质）推迟1/4波长，同时吸收80%90%，振幅变小，致使仅由直射光照射的背景变暗。通过补偿面的衍射没有变化，由于直射光推迟1/4波长，两者（直射光与衍射光）有完全相同的相位，合成波P等于直射光S与衍
9、射光D之合，即P=S+D，故振幅加大。物像是这两种波的合成波造成，即物像等于P。所以比只有直射光照射的背景亮得多。（2）暗反差（dark contrast）或正反差（positive contrast）：是指在相差显微镜的视场中，背景亮度大于物像亮度的现象。与明反差相反，把通过补偿面（因为在相板的补偿面上涂有改变光波相位的物质）的衍射光推迟1/4波长，使衍射光与直射光的相位相差1/2波长，同时，直射光在共轭面（上涂吸光物质）被部分吸收。由于两者在像点相互干涉的结果，使合成波（P=S-D）振幅变小，被检物像的影像比背景显著变暗。根据上述原理所制成的显微镜便是相差显微镜，聚光镜下面装有环状光阑，物
10、镜后焦面装有相板。4相差显微镜的光路与成像相并显微镜的照明光束，由转盘聚集器环状光阑的环状孔射入聚光镜，透射载物台上的被检样品，经样品后，入射光除透射的直线光外，同时产生衍射光。衍射光的振幅较小，相位滞后。直射光与衍射光进入物镜，前者由环状的共轭面、后者由较大的补偿面透过相板，前相互干涉造像。样品的影像由直射光（S）与衍射光（D）经干涉后的合成波（P）造成，即P=SD；背景仅由直射光形成。由于直射光与衍射光两种光波的相位差异不同造成不同的反差效果，或明反差或暗反差不等视所用物镜的相板类别而定。成像光束由物镜射入目镜，在目镜的视场光阑处再次放大，并由出射光瞳射出目镜。5、装置相差显微镜不同于普通
11、光学显微镜，在装置上有四种必不可缺的部件：相差物镜、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜与绿色的滤色镜。（1）相差物镜（phase contrast objective）相差物镜是显微镜特有的重要装置。在相差特镜内的后焦面上装有种类不同的相板。相板由于前述的作用，造成视场中被检样品影像与背景不同的明暗反差，各具不同的效果。因物镜内相板种类或构成的不同，物镜在明暗反差上可区分为两大类，即明反差（B）或负反差（N）物镜与暗反差（D）或正反差（P）物镜。物镜的反差类别，用英文字母B或N或D或P标志在物镜外壳上，并兼有高H（High）、中M(Medium)与低L（Low）等三种不同的反差。有的相差
12、物镜用ph字样的标示。同一反差类别的物镜，依放大率的不同，又可分为10、20、40、与100数种，因此，相关物镜种类颇多，一套可多达20余种。相差物镜多为消色差物镜或平场消色差物镜（PL）。（2）转盘聚光器（turret condenser）位于镜台之下，普通聚光器的所在位置上，由聚光镜与环状光阑（annular diapheragm）构成。环状光阑位于聚光镜之下，是一种特殊的光阑装置，由大小不同的环状通光孔构成，不同规格的通光孔环状光阑装配在一个可旋转的转盘上，按需要调转使用（图1-5）。环状光阑的环宽与直径各不相同，与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配，不可滥用。转盘前端朝向使用者一面有标
13、示窗（孔），转盘上的不同部位标有0、1、2、3与4或0、10、20、40与100字样，通过标示窗显现。“0”表示非相差的明视场的普通光阑。1或10、2图1-5 转盘聚光器的构造或20、3或40与4或100，表示与相应放大率的相差物镜相匹配的不同规格的环状光阑的标志。通过手动转入的标示窗内之数字，表示该数字所代表的环状光阑已进入光路。（3）合轴调中望远镜（centering telescope）合轴调中望远镜简称CT，又名合轴调中目镜。它是眼透镜，可行升降调节，具有较长的焦距的一种望远目镜。镜筒较长，其直径与观察目镜相同。它的功用仅作为环状光阑的环孔（亮环）与相差物镜相板的共轭面环孔（暗环）的调
14、中合轴与调焦之用。相差显微镜使用时，转盘聚光器的环状光阑与相差目镜必须匹配，且环状光阑的孔环与相差物镜相板共轭面的环孔在光路中要准确合轴，并完全吻合或重叠。以保证直射光与衍射光各行其路，使成像光线的相位差转变为可见的振幅差。但是，镜体的光路中前述两环的影像较小，一般目镜难以辨清，不能进行调焦与合轴的操作，非借助合轴调中望远镜不可。（4）绿色滤色镜（green filter）相差物镜的种类，从色差消除情况来分，多属消色差物镜（achromatic objective）或PL物镜。消色差物镜的最佳清清晰范围的光谱区为510630nm。欲提高相差显微镜的性能最好以波长范围小的单色光照明，即接物镜最佳
15、清晰范围的波长的光线进行照明。所以，使用相差物镜时，在光路上加用透射光线波长为500600nm左右的绿色滤色镜，使照明光线中的红光与蓝光被吸收，只透过绿光，可提高物镜的分辨能力。该滤色镜兼有吸热的作用，以利活体观察。四、实验步骤相差显微镜的使用，较之普通显微镜术要复杂些，但亦易于掌握，按下列过程进行操作。如前所述，相差显微镜区别于普通光学显微镜的装置主要有相差物镜、转盘聚光器、合轴调中望远镜与绿色滤色镜四种部件。使用时将这些部件调换安装在同型号的普通光学显微镜上，即成为相差显微镜。1相差物镜的调换安装从物镜转换器上拆下普通物镜，旋入相差物镜，与普通目镜配套使用。2转盘聚光器的调换安装旋转聚光器
16、升降螺旋，把普通明视场聚光器至最低位，旋松固紧螺丝，卸下聚光器。把转盘聚光器安放到相应位置上，旋紧固紧螺丝，转动聚光器升降螺旋，使聚光器升至最高位置。转盘聚光器的标示孔，朝向操作者。此时，转盘聚光器上面的聚光镜部分，进入光路；下面的环状光阑转盘，可视需要转动使用，把与物镜匹配的环孔旋入光路，使之处于转盘聚光镜下。3把绿色滤色镜放入镜座的滤色镜架上。转盘聚光器调换安装后，要进行合轴调中，使聚光器的光轴与显微镜的主光轴合一。其步聚如下：（1）把转盘聚光器的环状光阑调至“0”位，明视场照明的普通可变光阑进入光路。（2）旋转聚光器升降螺旋，聚光器升至最高位。（3）接通照明光源，使视场明亮。（4）把被检
17、样品放到载物台上，用低倍（4）物镜聚焦。（5）缩小镜座上的视场光阑开孔，至最小。（6）从目镜观察，在暗视场中可见一缩小的、明亮的、多角形的视场光阑图像。（7）转动转盘聚光器的两个调中杆，推动聚光器，把视场中的明亮的多角形的视场光阑图像，调至视场中央。（8）开放视场光阑至视场同大，视两者周边是否完全重合；否则，复用调中螺杆，使聚光器精神调中。4相板圆环与环状光阑圆环的合轴调中相差物镜的后焦面装有相板。按物镜放大率与反差效果的不同，相板圆环（共轭面）的大小与结构亦不同。转盘聚光器的环状光阑为一系列的透光的，不同大小的明亮环孔，与不同放大率的物镜相应。使用时严格匹配，当物镜更换时，环状光阑亦作相应的
18、更换或调整。在视场中观察所见，环状光阑为一明亮的圆环，而相板的圆环为一暗环。互相匹配的明环与暗环大小一致。在使用时两者要合轴，互相重叠。两环的重叠，须通过合轴调节方能取得。其方法如下：（1）相差物镜与环状光阑的匹配：正确地匹配取决于所用物镜放大率。例如，当使用40相差物镜时，环状光阑转向ph3或40位，使相应地环状光阑进入光路。（2）把CT放入目镜筒：从目镜筒取出一个目镜，换入调中合轴望远镜（CT）。CT为一眼透镜，也是可行升降调节的望远目镜，专为观察视场中明环与暗环图像之用。因为用一般目镜看不见两环的清晰图像。CT在使用前眼透镜应处于最低位，即CT为最短小的状态。（3）明环与暗环的聚焦：一手
19、固定位于目镜筒中的CT镜筒，使其透镜位置不能上移，另一手逆时针转到CT上部可调的眼透镜部分。转动的同时，通过CT向现场中观察，即国旋转边观察初始，两环可能为模糊的图像，继续转动CT目镜可调部分至清晰地窥见明环与暗环止。（4）明环与暗环的调中重叠：相板的暗环是固定不动的，处于光路之中，暗环的中心，即显微镜光轴的中心。环状光阑的亮环可调节移动。转盘聚光器环状光阑的位置，因聚光器的可调其中心位置，往往偏离光轴轴心，需调整，使其归中。环状光阑的调中装置或部件，因厂家或型号的不同而有别。如OLYMPUS BH2-PC型相差显微镜，环状光阑调中装置为位于转盘聚光器两侧的两个伸丝自如的调中螺杆，用以操纵改换
20、环状光阑的方位，达到调中；而Nikon FIVORPHOT型显微镜的相差装置，其环状光阑的调中部件为位于转盘聚光器表面，可向任一方向滑动的环状钮。调中时，手指调中装置，移动明环，使之与暗环合一。在两环调中过程，始终在通过CT的观察下进行。在调节过程中，如亮环比暗环小，并位于暗环内侧时，应降低聚光器位置，使亮环放大。若亮环大于暗环时，应提升聚光器，使亮环缩小。如聚光器已升至最顶点还不能完全重合，可能是载玻片过厚之故。（5）回装观察目镜：待相差物镜的暗环与环状光阑的亮环调中、重叠后，从目镜筒中取出CT，放回观察用的接目镜，以便镜检观察。5相差物镜的选择相差物镜有不同倍率、不同反差类别与反差程度之分
21、。相差物镜的反差类别与反差程度以及放大倍数，皆用英文字母与数字标示在物镜壳中。例如：20PH=20倍，正反差，反差程度高。20PM=40倍，正反差，反差程度中等。100PL=100倍，正反差，反差程度低。40NH=40倍，负反差，反差程度高。40NM=40倍，负反差，反差程度中等。100NL=100倍，负反差，反差程度低。100DH=100倍，暗反差，反差程度高。40DM=40倍，暗反差，反差程度中等。20DL=20倍，暗反差，反差程度低。10BH=10倍，明反差，反差程度高。20BM=20倍，明反差，反差程度中等。40BL=40倍，明反差，反差程度低。相差镜检时，依被检样品的种类、结构与反差
22、程度的不同，而确定应选用相差物镜的种类。这不存在死硬的规定，可依观察者的习惯与爱好而变。一般来说，相差物镜的应用范围如表1-1。就某一具体被检物体来说，适于明反差或适于暗反差，难以定论。通常是哪一种相差物镜都能得到清晰的像，只是有的物镜更好些而已，因此可任意选择。有的样品只适于某一种相差物镜。暗反差物镜对习惯于明视场境检者很适宜。当与染色标本进行比较或进行测定以及加强半透明物体的反差时，多用暗反差；而计算数量或观察物体运动以及研究极小的样品时，多使用明反差。表1-1 相差物镜应用范围字母反差应用P正观察细胞或细胞核的内部结构N负观察微小的物体如孢子、鞭毛与活的样品等H高当样品反差较低时L低当样品反差较高时M中当样品反差为中等时总之，在相差镜检时，于诸多的相差物镜中选一物镜，绝非易事。除参考上表所列应用范围外，最佳方法是通过各种类型的相差物镜进行实际镜检测定，找出最宜相差物镜。第 13 页