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1、细胞培养（细胞培养（cell culture)cell culture)是指用机械或化学的方法将是指用机械或化学的方法将组织分散成单个细胞而进行的培组织分散成单个细胞而进行的培养。养。组织培养（组织培养（tissue culture)tissue culture)是指把活体的组织取出分成小是指把活体的组织取出分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。其特点是：组织不失散，细培养。其特点是：组织不失散，细胞保持原有的组织关系。胞保持原有的组织关系。器官培养（器官培养（organ cultureorgan c
2、ulture）是将活体中器官或器官一部分是将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的保持器官原有的结构和功能特征的培养。其特点是：培养的器官在合培养。其特点是：培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数适的条件下能生长和分化，存活数周或周或1年。年。第1页/共40页细胞培养常用术语细胞培养常用术语 原代培养（原代培养（原代培养（原代培养（primary cultureprimary cultureprimary cultureprimary culture）：）：）：）：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的从直接取自生
3、物体细胞、组织或器官开始的从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。培养。培养。培养。传代培养（传代培养（传代培养（传代培养（passage culturepassage culturepassage culturepassage culture）：）：）：）：将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代培养。瓶即称为传代培养。瓶即称为传代培养。瓶即称为传代培养。注：注：注：注：传代（传代（传代（传代（passagepassag
4、epassagepassage，subculturesubculturesubculturesubculture）第2页/共40页细胞系（细胞系（细胞系（细胞系（cell linecell linecell linecell line）：）：）：）：原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。物中的细胞世系所组成。物中的细胞世系所组成。物中的细胞世系所组成。细胞株（细胞株（细胞株（细胞株（cel
5、l straincell straincell straincell strain）：）：）：）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊性质或标志，并能稳定保持这些特性的培养物。性质或标志，并能稳定保持这些特性的培养物。性质或标志，并能稳定保持这些特性的培养物。性质或标志，并能稳定保持这些特性的培养物。克隆（克隆（克隆（克隆（cloneclonecloneclone）：）：）：）：指单个细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状
6、相同的细胞群体。指单个细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。指单个细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。指单个细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。第3页/共40页生物安全柜超净工作台 细胞培养的设施细胞培养的设施-培养室培养室第4页/共40页漳州校区细胞实验课使用的细胞培养间.第5页/共40页水浴锅高压灭菌锅第6页/共40页培养瓶培养皿培养板第7页/共40页CO2 培养箱第8页/共40页倒置显微镜普通显微镜第9页/共40页l 培养基培养基血清 胰酶双抗(Penicillin-Streptomycin)第10页/共40页细胞培养基主要成分细胞培养基主要成分 水水
7、糖糖 氨基酸氨基酸 维生素维生素 无机离子和微量元素无机离子和微量元素 促生长因子促生长因子常见的商品化细胞培养基有:DMEM、MEM、PRMI-1640、M199、Hams/F12等第11页/共40页第12页/共40页第13页/共40页1、血清的种类、血清的种类 胎牛血清：剖腹产的胎牛胎牛血清：剖腹产的胎牛 牛血清牛血清 新生牛血清：出生新生牛血清：出生24h之内的新之内的新生牛生牛 小牛血清：出生小牛血清：出生1030d的小的小牛牛（人血清、马血清、羊血清、鸡血清）（人血清、马血清、羊血清、鸡血清）2、血清的主要成分及主要作用、血清的主要成分及主要作用 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清
8、是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长活性是达到生理这些物质对促进细胞生长活性是达到生理平衡的。平衡的。血 清第14页/共40页第15页/共40页血清的主要作用血清的主要作用 提供基本营养物质提供基本营养物质 提供贴壁和扩展因子（提供贴壁和扩展因子（FNFN、LNLN）提供激素及各种生长因子提供激素及各种生长因子 （FGFFGF、EGFEGF、PDGF)PDGF)提供结合蛋白提供结合蛋白 对培养中的细胞提供某些保护作对培养中的细胞提供某
9、些保护作用用第16页/共40页血清的使用与储存血清的使用与储存 使用前的处理使用前的处理 56 56灭活灭活30min 30min 去除补体去除补体(可促进细胞溶可促进细胞溶 解解)成分成分,储存条件储存条件 灭活后分装成小包装（灭活后分装成小包装（10mL10mL、20mL20mL、50mL50mL），），20 20 储存；使用前储存；使用前4 4 融化。融化。使用浓度使用浓度 一般为一般为2 22020，最常用的是，最常用的是1010。第17页/共40页影响细胞生长的因素影响细胞生长的因素-温度温度 一般哺乳类及禽类细胞体外培养一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度的适宜温度3737383
10、8，温度过高，温度过高或过低都会影响到细胞的生长。或过低都会影响到细胞的生长。温度对细胞生长的影响温度对细胞生长的影响第18页/共40页二氧化碳（二氧化碳（COCO2 2）大多数细胞适于在大多数细胞适于在pH 7.2pH 7.27.47.4条件下生长，低于条件下生长，低于pH pH 6.86.8或高于或高于pH 7.6pH 7.6对细胞有害，甚至造成细胞退化或死对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。亡。动物细胞培养要求有动物细胞培养要求有5%5%的的CO2CO2，这是为了维持培养基，这是为了维持培养基的的pHpH稳定。因为培养基中使用的是稳定。因为培养基中使用的是HCOHCO3 3-CO-CO3
11、 32-2-缓冲缓冲对，环境中稳定的对，环境中稳定的COCO2 2可以保持培养基处在可以保持培养基处在pH7pH7左右。左右。羟乙基哌嗪乙硫磺酸（羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HepesHepes）：对细胞无毒性，也不）：对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止起缓冲作用，主要作用是防止pHpH迅速变动，在开瓶通迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pHpH值。值。第19页/共40页培养细胞的生长方式和类型培养细胞的生长方式和类型粘粘附附型型细细胞胞：附附着着在在某某一一固固相相支支持持物物表表面面才才 能生长的细胞。能生长的细胞。如如：成成纤纤维维细
12、细胞胞、心心肌肌与与平平滑滑肌肌细细胞胞、表表皮皮细细胞胞、骨骨与与软骨细胞、肿瘤细胞软骨细胞、肿瘤细胞悬悬浮浮型型细细胞胞：不不必必附附着着于于固固相相支支持持物物表表面面，而而 在悬浮状态下即可生长的细胞。在悬浮状态下即可生长的细胞。如：血、脾及骨髓培养的细胞及某些癌细胞如：血、脾及骨髓培养的细胞及某些癌细胞 第20页/共40页培养细胞的生长特点培养细胞的生长特点 粘附并伸展粘附并伸展 是大多数体外培养细胞的基本生长特点。细是大多数体外培养细胞的基本生长特点。细胞在接种后很快便可见到细胞伸出伪足附着，胞在接种后很快便可见到细胞伸出伪足附着，与支持物形成一些接触点，接着细胞逐渐呈扁与支持物形
13、成一些接触点，接着细胞逐渐呈扁平或放射状伸展，逐渐形成上皮型或成纤维型平或放射状伸展，逐渐形成上皮型或成纤维型或其他类型生长。或其他类型生长。密度依赖性密度依赖性 细胞接种密度过高或过低都会影响细胞的生细胞接种密度过高或过低都会影响细胞的生长、增殖。当细胞粘附生长、融合成单层时，长、增殖。当细胞粘附生长、融合成单层时，细胞变得较为拥挤，而扁平形状的程度减少，细胞变得较为拥挤，而扁平形状的程度减少，与培养基的接触面减少，同时，培养基中的营与培养基的接触面减少，同时，培养基中的营养物逐渐消耗，细胞分裂减弱，增殖减慢。养物逐渐消耗，细胞分裂减弱，增殖减慢。第21页/共40页培养细胞的污染培养细胞的污
14、染Amphotericin B（两性霉素）pen/strep（双抗）第22页/共40页培养细胞的污染培养细胞的污染PlasmocinAmphotericin B（两性霉素）第23页/共40页实验七、细胞培养基配制与过滤除菌实验目的：熟练掌握培养基(DMEM)的配制及过滤除菌的方法实验原理：组织培养使用的培养基其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。L谷氨酰胺在细胞培养时是必须的，脱掉氨基后，L谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在高压灭菌后被大幅降解而产生大量毒性氨,对细胞有毒性。因而含有L谷氨酰胺的培养基不能用高压灭菌的方式除菌。
15、一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH 的缓冲系统，由于NaHCO3容易分解为二氧化碳，很不稳定，因而含有NaCO3的培养基也不能用高压灭菌的方式除菌。市售培养基可分为两种：一是可进行高压灭菌的培养基，这类培养基不含L谷氨酰胺和NaCO3，须灭菌后再添加L谷氨酰胺和NaCO3。另一种是含有L谷氨酰胺，配制的同时在添加NaCO3，这类培养基不能用高压灭菌德的方式除菌，只能采用过虑除菌的方式。第24页/共40页实验材料材料：1 000 ml、250ml烧杯、100ml、250 ml蓝盖瓶，15ml,50ml 塑料离心管、022 m的微孔滤膜、50ml一次性注射器，超纯水，小牛血清
16、，干粉合成培养基(DMEM)，双抗（青霉素-链霉素），NaHC03。第25页/共40页实验步骤DMEM培养基的配制 1 称量一定量的DMEM干粉，倒入1000ml烧杯中，加入950ml 去离子水，用磁力搅拌至充分溶解，然后加入适量NaHCO3，溶解后先加入10ml 双抗（100unit青霉素,100ug/ml链霉素，最后加 水1000ml，分装到4个250ml烧杯中。第26页/共40页第27页/共40页2.超净工作台预先紫外照射至少20min,关掉紫外灯，通风2-3min,戴上乳胶手套，喷酒精消毒。第28页/共40页用酒精喷软纸将超净工作台平台及工具擦拭干净。第29页/共40页3.将上面分装的
17、250ml烧杯放入超净工作台，在超净工作台中用镊子取出过0.22m过滤 器，放在 250ml蓝盖瓶瓶口。取20ml一次性注射器吸取一定量的 培养基，通过0.22m过滤器注入250ml蓝盖瓶中。过滤全部结束后，将蓝盖瓶盖紧。贴上标签。4冰箱保存。第30页/共40页取20ml一次性注射器吸取一定量的 培养基，通过0.22m过滤器注入250ml蓝盖瓶中。过滤全部结束后，将蓝盖瓶盖紧。贴上标签。4冰箱保存。第31页/共40页4.标签标记方法：DMEM 31110316 xxxxx星期二实验组第一排作业：配制细胞培养基时为什么要添加NaHCO3?第32页/共40页一一.实验目的实验目的 1.1.了解相差
18、显微镜的基本原理和结构特点。2.比较活细胞与固定后细胞的形态差异。实验八 活细胞观察及相差显微镜的使用l 人的眼睛只在光的波长(颜色)和振幅(亮度)变化时才能观察到被检的物体，而活细胞或末经染色标本多为无色透明，当光波被通过时，其波长和振幅并没发生什么变化，所以无法辨认。为了观察活细胞的显微结构，就需要使用相差显微镜。l相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。第33页/共40页二.实验原理细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光
19、的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置-环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。第34页/共40页第35页/共40页第36页/共40页三、实验程序三、实验程序 (一)相差显微镜的使用 1.相差显微镜的装置 取下普通显微镜的聚光器，换上带有环状光相的转盘聚光器，并将标示孔指0(即明视野);取下普通物镜，装上相差物镜。2.调焦和调光 用普通低倍物镜在明视野中观察，当发现目标后，把观察的
20、目的物移到视野的中央。观察透明物体时要缩小光栏，当用相差物镜在明视野对好焦点后，换上相应的相差物镜，例如20X,40 x相差物镜分别用ph1、ph2标示孔的光栏，并充分开大孔径光栏。第37页/共40页3.中心调节（合轴调节）拨出目镜，插入中心望远镜，用左手固定其外筒，一边眼看望远镜，一边用右手转动望远镜内筒使其升降，对准焦点后就能看到环状光栏的亮环和相板的黑环。此时可将望远镜固定，微微转动聚光器两侧的调节钮，使两者完全重合。如果亮环和黑环大小一不致，可升降聚光器便之一致，如果升降聚光器仍不能矫正亮环和黑环一致的话，那就是载、盖玻片过厚的缘故。换用不同物镜要同时更换相对应的环状光栏，并重新合轴。
21、第38页/共40页 (二二)动物活细胞的相差显微镜观察动物活细胞的相差显微镜观察 观察蛙肝细胞装片观察蛙肝细胞装片 1.用镊子和解剖针，把蛙的肝组织小块放在载玻片上，滴上生用镊子和解剖针，把蛙的肝组织小块放在载玻片上，滴上生理盐水，分离出游离肝细胞。在相差显微镜下，可见折射率较高的理盐水，分离出游离肝细胞。在相差显微镜下，可见折射率较高的大的球形细胞核，内含折射率更高的小颗粒大的球形细胞核，内含折射率更高的小颗粒 核仁。在细胞核周围核仁。在细胞核周围还可见到许多暗白的小颗粒即为线粒体。细胞质中还有许多大小不还可见到许多暗白的小颗粒即为线粒体。细胞质中还有许多大小不等明亮的细胞质颗粒。等明亮的细
22、胞质颗粒。2.取一小块肝组织，放入取一小块肝组织，放入1.5ml离心管中，离心管中，生理盐水洗生理盐水洗1次，去次，去除上清液，用眼科剪剪碎肝组织至糊状除上清液，用眼科剪剪碎肝组织至糊状，生理盐水洗生理盐水洗1遍，遍，3000rpm离心离心2min去上清，去上清，加入加入500微升胰蛋白酶，微升胰蛋白酶，37温育温育10-20min10-20min，其间，其间用用1ml1ml枪头吹打枪头吹打2-32-3次。次。3.3.加入加入500500微升生理盐水后微升生理盐水后3000rpm3000rpm离心离心2min2min，去上清，用，去上清，用200200微微升生理盐水悬浮沉淀，取升生理盐水悬浮沉淀，取5050微升滴加在载玻片上，滴加一滴生理盐微升滴加在载玻片上，滴加一滴生理盐水，盖上盖玻片后观察。水，盖上盖玻片后观察。四四.思考题思考题 1.简述相差显微镜与普通光学显微镜的差别。简述相差显微镜与普通光学显微镜的差别。2.描述蛙肝细胞的形态特点。描述蛙肝细胞的形态特点。第39页/共40页感谢您的观看！第40页/共40页