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1、微生物资料总结第一部分有益微生物的应用形式可利用微生物的范围的扩大 挖掘已知微生物的潜力，对现有微生物的认知能力的提高：肉毒梭状芽胞杆菌肉毒素冰核菌含有能产生冰核活性很强的特异性冰蛋白的一类微生物。特异性冰蛋白可作为水分子冷冻的模板，在较高的亚零下温度下诱发和加速水的冷冻过程。 发现微生物新资源嗜极端环境微生物 创造微生物新品种工程菌将其它生物来源的目的基因导入到微生物中表达：将目的基因从不安全的微生物中导入到食用级安全微生物中表达利用原料不同，同种微生物；菌种不同，原料相同 应用形式的举例：（）发酵菌体的应用l 食用菌的生产，食用菌主要包括菌盖，菌柄，菌根三个部分，日常食用部位为子实体。l
2、单细胞蛋白的生产应用单细胞蛋白（ , ）又称微生物蛋白或菌体蛋白。是指利用工业废气物（废水、废气、废渣）或农副产品发酵生产的用于食品和饲料添加剂的微生物菌体（ ）,无论是分离出的细胞蛋白，还是全部细胞物质均称为。l 微生态制剂的应用微生态制剂（或称微生态调节剂 ）是在微生态学理论的指导下，调整生态失调（）保持微生态平衡（），提高宿主（人、动植物）健康水平或增进健康佳态（）的生理性活菌制品（微生物）与其代谢产物以与促进这些生理菌群生长繁殖的物质制品。 （）发酵产品酱油：以花生饼、豆饼、麸皮（含多缩戊醛）或麸皮加部分小麦粉为原料，在米曲霉，酵母菌等微生物作用下，发酵生产的一类产品。食醋：以谷物、糖
3、蜜、麸皮等为原料，在米曲霉、酵母、醋酸杆菌作用下发酵形成的产品豆腐乳：以豆类为原料，在毛霉、根霉、米曲霉等微生物作用下发酵形成的产品。啤酒，葡萄酒，黄酒，发酵酸奶等（）代谢产物的应用氨基酸：有机酸，核苷酸，维生素，色素（） 微生物酶的应用l 利用胞外酶将原料中大分子蛋白质、淀粉等分解为可被细菌和酵母菌利用的小分子物质，如氨 基酸、葡萄糖等；l 利用胞内酶，通过代谢调节和人工控制发酵条件，利用糖类等某些营养物质在发酵过程中积累 大量的代谢产物，如酒精、氨基酸、柠檬酸、乳酸、乙酸等发酵产品；此外，还可利用某些微生物在人工培养过程中产生大量的酶的特性，从发酵液（物）中提取酶来生产酶制剂（淀粉酶、蛋白
4、酶、纤维素分解酶等） ，广泛用于食品发酵、制药、制糖、制革和饲料工业中。（）工厂废弃物处理中的应用污水处理方法：物理处理法；化学处理法；生物处理法。生物处理法：活性污泥法作用原理：将废水置于强烈通气（或称曝气）池中，与以无机物（主要是泥土，也可以是絮凝沉淀物）为骨架和具有大量微生物的污泥相接触的过程。 有害微生物的监控包括两个方面：微生物卫生标准的制定检测方法的进步和更新 检测手段方法的更新（快速、准确、灵敏）与多样化（传统法、免疫血清学方法、分子生物学方法）设备的更新（方便、快捷） 提高监控微生物的手段有害微生物的预防与控制预警快速预防措施高效：疫苗消毒灭菌措施方法多样第二部分 微生物分类进
5、展 微生物分类依据（）形态学特征： 微生物可利用的形态特征少;形态特征在不同类群中进化速度差异大，不准确。（）生理生化特征（）生态特征（）血清学反应（）细胞化学成分鉴定： ：细胞壁的化学组成 ：全细胞水解液的糖型： ：磷酸类脂的成分分析: ：枝菌酸的分析： ：醌类的分析：（）核酸的碱基组成和分子杂交 ：碱基比例的测定主要是（）值：同一个种内的不同菌株含量差别应在以下;同属不同种的差别应低于 ：核酸分子杂交和杂交 ：寡核苷酸编目分析（）氨基酸序列和蛋白质分析 微生物的命名（包括常见微生物的中英文名字） 俗名（ ）：结核杆菌：结核分枝杆菌 红色面包霉：粗糙脉胞霉 学名（ ）林奈的“双名法” 2.2
6、.1双名法的规则学名属名种名加词（首次定名人）现名定名人首次命名年份2.2.2 三名法亚种或变种的命名 表示枯草芽孢杆菌的蛋白酶生产菌株 表示两歧双歧杆菌一个模式菌株微生物分类依据原核微生物的分类系统纲要伯杰氏手册3.1.1伯杰氏细菌鉴定手册伯杰氏细菌鉴定手册是细菌分类系统的综合和标准，由美国细菌学家协会（现称美国微生物学会）发起编写的，最初指定 作为编委会主席，在年出版了手册的第一版，相继在、年出版了第二至第九版，成为国际上细菌学家普遍接受和采用。第九版伯杰氏细菌鉴定手册设立个群，将古细菌部改编为个群，全书描写了约个属。划分为四大类：第一类 具细胞壁的革兰氏阴性真细菌 第二类 具细胞壁的革兰
7、氏阳性真细菌 第三类 无细胞壁的真细菌 第四类 古细菌 3.1.2 伯杰氏系统细菌学手册年陆续出版的四卷册伯杰氏系统细菌学手册第一版，在着重于表观特征描述的基础上，结合化学分类、数值分类特别是相关性分析，与 寡核苷酸编目在生物种群间的亲缘关系研究中的应用作了详细的阐述，体现了细菌分类的研究从表观向系统发育体系的发展。除此，还附有每个菌群的生态、分离、保藏与鉴定的方法。第二版 由 主编分为卷，将从年起陆续出版。这一版纳入了研究核糖体测序所产生的许发育)分类系统。 分古细菌和真细菌个界，下设门、纲、目、科，包括余属和多个种。 真菌分类 分类系统（，年）真菌界 粘菌门 多种 真菌门 近万种 鞭毛菌亚
8、门（壶菌纲、丝壶菌纲、卵菌纲） 接合菌亚门（接合菌纲、毛菌纲） 子囊菌亚门（多种） 担子菌亚门（层菌纲、腹菌纲、锈菌纲、 黑粉菌纲 多种） 半知菌亚门（腔孢纲、丝孢菌纲 多种）3.2.1 真菌字典第版年，根据 序列的研究、生物化学和细胞壁组分以与 序列分析的结果，国际真菌学研究的权威机构英国国际真菌研究所（ ）出版的第 版真菌字典中，将原来的真菌界划分为原生动物界、藻界和真菌界。真菌界仅包括了 个门，即壶菌门、接合菌门、子囊菌门和担子菌门。 常见保藏菌种的机构 中国农业微生物菌种保藏管理中心中国微生物菌种保藏管理委员会（）； 中国农业科学院土壤肥料研究所“”为 （美国典型菌种保藏中心）的缩写。
9、 ( )日本技术评价研究所生物资源中心 ( ) 荷兰微生物菌种保藏中心英国国家典型菌种保藏中心() ( , ) 英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心 ( ) 德国微生物菌种保藏中心 六界系统 三大领域 五界系统（年）六界系统： 三大领域：1. 序列分析比较，提出将生物分成为三界()(后来改称三个域)：古细菌、真细菌（)和真核生物()。2. 年，他为了避免把古细菌也看作是细菌的一类，他又把三界(域)改称:(细菌)、(古生菌)和(真核生物)。 古细菌的相关知识（定义、来源、分出来的依据、特点：细胞结构，化学组成，环境特点）古菌是一群具有独特基因结构或系统发育生物大分子序列的单细胞生物，大多生活在地球
10、上如超高温、高酸碱度、高盐浓度、严格无氧状态等极端环境或生命出现初期的自然环境。古菌的特点o 形态o 细胞结构：o 细胞壁o 细胞膜o 代谢方式：多样化o 呼吸类型：多为严格厌氧o 繁殖方式：裂殖，慢o 分布：多为极端环境o 遗传物质特性：序列特征既不同于真细菌，也不同于真核生物o 对抗生素的敏感性：与真核生物相同，而与真细菌不同 古菌的分类（）产甲烷古细菌：l 是一类在形态和生理方面有着极大差异能产甲烷的严格厌氧微生物。l 其共同点在于利用氢气、二碳化合物（甲酸或乙酸等）在厌氧条件下还原产生甲烷和合成细胞物质。l 细胞中常含有辅酶（巯基乙基磺酸）和能在低电位条件下传递电子的因子。有些类群能同
11、化营自养生活，但同化不经卡尔文循环，而是将它直接固定为乙酸盐加以利用。l 主要分布在有机质厌氧分解的环境中，如沼泽、湖泥、污水和垃圾处理场、动物的胃与消化道和沼气发酵池中，包括和，自养和异养。产甲烷古菌分类产甲烷菌属 反应细胞壁主要成分甲烷杆菌属（ ） 假胞壁质甲烷短杆菌（ ） 假胞壁质甲烷球菌属（ ） 蛋白质单位，少量葡萄糖胺甲烷微菌属（ ） 蛋白质亚单位产甲烷菌属（ ） 蛋白质亚单位甲烷螺菌属（ ） 蛋白质亚单位，蛋白质鞘甲烷八叠球菌属（ ） 异多糖（）极端嗜盐古细菌（ ） 能在含盐甚至饱和盐水中生活 生长需要的盐浓度为,大多数在时生长最好 严格好气，化能有机营养，常以蛋白质、氨基酸等为碳
12、源和能源，细胞内累积高浓度来进行 渗透压调节 分布在盐湖和晒盐池中，常引起腌制食品等的腐败和脱色 主要有嗜盐杆菌属（）和嗜盐球菌属()（）极端嗜热嗜酸古细菌l 是一类依赖于硫，能耐高温（）和高酸度（）的特殊类群。l 极端嗜热嗜酸细菌在形态和生理上也有较大的变异。l 主要生活在含硫的温泉、火山口与燃烧后的煤矿等自然环境中。l 包括有化能自养、化能异养与兼性种营养类型。l 瓣硫菌属（）和高温枝原体属（）等是它们的代表。（）还原硫酸盐古细菌最适生长温度（）无细胞壁古菌群专性嗜热，十分嗜酸，兼性厌氧第三部分 微生物育种 微生物育种方式菌种选育的目的：科研，生产 工业生产自然选育微生物菌种 从自然界分离
13、所需要的菌株（）向菌种保藏机构索取有关菌株，从中筛选所需菌株。（）由自然界采集样品。（）从一些发酵制品中分离。 把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。 具体操作步骤：（一）采样（）、从土壤中采样细菌（）放线菌（）霉菌（）酵母菌（）藻类（）原生动物（）根据土壤有机质含量，通气状况，酸碱度，植被状况，地理条件（南方较好），季节条件（秋季最佳）（）、根据微生物生理特点采样微生物营养需求、代谢类型、生理特性。（）特殊环境下采样局部环境条件； 极端环境条件（二）、富集培养目的：是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下
14、迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中地优势种，以利分离到所需要地菌株。注意：如果按通常分离方法在培养基平板上能出现足够多数量的目的微生物，则不必进行富集培养。方法：主要根据微生物的碳、氮源、值、温度、需氧等生理因素加以控制。（）控制培养基的营养成分（）控制培养条件 如：细菌、放线菌生长繁殖 霉菌、酵母菌生长繁殖 () 抑制不需要的菌类通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加。：分离芽孢杆菌：土样加热至80或在乙醇溶液中浸泡小时，杀死不产芽孢的菌种后再行分离。适量胆盐十二烷基磺酸钠抑制少量硫乙醇酸钠分离厌氧菌（三）分离分离方法：（
15、）稀释平板法（ ）将含微生物的样品用无菌生理盐水进行梯度稀释，取少量与冷却至的固体培养基混合，摇匀，倒混菌平板或涂平板，倒置培养小时，出现菌落。适用于：数量占优的微生物。好氧，在平板上形成菌落的微生物。() 涂布平板法（ ）稀释平板法因为细菌与的培养基混合导致某些热敏感菌死亡与好氧菌埋在培养基中缺乏氧气影响生长，所以更常用涂布平板法（）平皿划线分离法（ ）：接种环沾取少许微生物，在无菌平板扇形、平行等划线，随划线次数增加而分散开，得到单菌落。（）利用平皿的生化反应进行分离透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基浑浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌
16、株利用底物的能力。分解水解酶产生菌时多采用，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌。分离淀粉酶产生菌：以淀粉为唯一碳源，样品涂布培养形成单菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。分离核酸水解酶产生菌：普通平板，样品涂布培养长出菌落后覆盖一层营养琼脂，内含酵母，琼脂与 , ,于左右培养小时，挑四周产生透明圈的菌落分离某种产生有机酸的菌株：选择培养基变色圈法: 在底物平板中指示剂或显色剂筛选果胶酶产生菌果胶为唯一碳源培养基平板涂布培养长出菌落后，加入刚果红溶液染色小时，具有分解果胶能力的菌落周围会出现绛红色水解圈。分离谷氨酸产生菌培养基溴百里酚蓝（变色范围在 ，黄色；
17、，蓝色。）生长圈法常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。（缺少某种营养物的）培养基营养缺陷型菌株被检菌抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选。培养基抗生素的敏感菌（作为检验菌）被检菌采用冷敏感菌筛选抗生素突变株， 等从人的病源菌中诱变分离低温敏感菌突变株（冷敏菌），在以下不生长。将冷敏菌放线菌孢子混合于平板上培养天，放线菌生长产抗生素，再移至培养小时，冷敏菌迅速生长，观察抑菌圈。（）组织分离法 由一些有病组织或特殊组织中分离菌株的方法。 含菌组织一小块洗去表面污物后用漂白粉或升汞浸泡分钟，进行表面消毒，无菌水冲洗。移至平皿培养基上，适温（25-26）培养，再分离纯化。（）单细胞或单孢子分
18、离法滤纸片法：取与皿内径大小一致的滤纸层，浸在培养液中，取出放在空皿内，在滤纸上滴几滴甘油以防干燥，盖好皿盖，灭菌。将稀释为的孢子悬液用滴管滴在滤纸上，每皿约点滴左右，经恒温培养，每滴约出现个菌落，将单菌落移接于斜面上。（）通过控制营养和培养条件进行分离控制培养基的营养成分如特殊菌类环保降解菌（降解烃类、有机染料、表面活性剂、农药等）的分离：以该物质为唯一碳源或氮源进行长时间（几个月的连续培养）富集培养。控制培养基的排除不需要的菌类控制培养温度（）厌氧微生物的分离加还原剂于培养基中如半胱氨酸等。去氧 ：焦性没食子酸 (四)筛选和目的产物的鉴别.平板筛选.摇瓶发酵筛选摇瓶振荡培养得发酵液 待测平
19、板打孔(厚3mm 内径5mm钢圈打孔)过滤后的发酵液或灭菌圆滤纸片上滴入发酵液代替打孔孔或滤纸片的周围出现活性圈（溶菌圈或水解圈），根据其大小判定活力大小（五）毒性试验 诱变育种（现有微生物改造）定义以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。 步骤与方法（一）出发菌株的选择.自然选育的具有一定生产能力的野生或至少能少量产生目的产物的菌株。.具有有利性状的菌株，如生长速度快，营养要求低以与产孢子早而多的菌株。.选择已发生其它变异的菌株。.采用“增变菌株”（对诱变剂的敏感性比原始菌株大为提高）的变异菌株。*诱变育种工作中，一般采用个出发菌株，在逐代处理后，将产量高、特性
20、好的菌株留作继续诱变的出发菌株。（二）单细胞或单孢子悬液的制备采用对数期细胞或成熟而新鲜的孢子：用发芽孢子（芽长为孢子 倍）或直接用斜面孢子。不产生孢子的真菌采用年幼的菌丝体。均匀的悬液。（三）诱变剂与诱变剂量的选择.诱变剂的种类（）物理诱变剂q 非电离辐射（只使物质分子或原子中的电子级能提高）紫外线紫外线最有效的波长是埃。采用紫外线灯管，距离。q 电离辐射：杀菌率q 其它物理诱变剂：微波、红外线、激光、高能电子流等。().化学诱变剂.诱变剂的选择 碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。 亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙
21、酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。 吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。 紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变。但它可能影响邻近基因的性能。.诱变剂量的选择（）处理剂量大，杀菌率高（），在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少。（）用小剂量进行诱变处理时，杀菌率约，在单位存活细胞中正变株多，然而大幅度提高产量的菌株可能较少。（）化学诱变剂主要是调节浓度、处理时间、处理条件（温度、值等）。物理诱变剂主要是控制照射距离、时间和照射过程中的条件（、水等）。.诱变剂处理方式（）单因子处理 处理次 连续重复使用（）复合因子
22、处理 两个以上因子同时处理 不同诱变剂交替处理（四）中间培养原因：由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。（五）突变株的分离与筛选 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大
23、量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.筛选程序.初筛方法（1） 随机筛选（摇瓶筛选）缺点：如果菌落挑取少了，很难筛选到理想的突变株（因为突变概率小）（）平板菌落筛选（摇瓶初筛前的一种预筛）可根据菌落形态或利用菌落产生的代谢产物与培养基中检定菌、底物或指示剂作用后，在其周围形成抑菌圈、呈色圈或其他特异性反应圈，测定反应圈直径。根据菌落形态由突变引起形态剧烈变化的菌落（负突变多）突变的高产菌株其菌落形态往往在常态的正常范围内，因为它们的遗传物质仅受到微小损伤，还保留了正常代谢的基本功能。一个菌株的高产性能是经过多代微小突
24、变累积的，一代诱变后的菌落形态与直接亲本之间形态变化一般不明显，但经长期多代诱变后，高产菌株与其最原始的亲代在形态特征上还是有明显差异。根据平板菌落生化反应筛选() 浓度梯度法（）琼脂块法 日本人八木建立，此法广泛用于抗生素和酶类等突变株的筛选。 优点：准确性比直接平板上特异性反应圈更可靠；方法较为简便；筛选量很大，一次可筛选琼脂块上的菌落达个或更高。（比常规筛选量提高倍）（）其它复印技术复筛方法摇瓶液体培养其培养条件接近于发酵罐，可作为发酵工艺模拟试验，选出的菌种易推广到大生产中去。初筛：瓶株，逐个进行活性测定，凡生产能力比出发菌株高以上的进行保种和复筛。复筛：瓶株，观测重复性。*注意：培养
25、条件要尽量与大生产发酵条件相近。培养条件的相似性：摇瓶型号、装量、瓶塞厚度、摇瓶转速、温度、摇瓶位置、室内相对湿度等。（六）产物活性测定一般突变规律：一个出发菌株通过一次诱变，生产能力提高的突变株约为，而生产能力提高以上的突变株约为。通常诱变一代至少要挑选株以上，经平皿预筛后，约保留株进行摇瓶初筛。 经典法：蛋白酶测定采用分光光度法；脂肪酶测定采用滴定法；。缺点是操作繁琐、样品不能同时测定，带来误差。 快速检验法：琼脂平板活性圈法：平板打孔加入发酵液或滤纸片浸透发酵液覆盖于琼脂平板上（加有检验菌或底物）。 其他法（七）培养基和培养条件的调整表型迟延( ) 指细胞遗传型虽已突变，但表型却需要在复
26、制、分离和细胞分裂后，才表现出来。表型迟延的结果是造成不纯的菌落。 包括分离性迟延和生理性迟延。 两者之间的区别：特例：突变株的分离和筛选营养缺陷型的分离筛选步骤 相关定义：野生型菌株（ ）：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株。营养缺陷型（）：由于基因突变引起代谢过程中某种酶合成能力丧失的突变型，它们必须在原有培养基中添加相应的营养成分才能正常生长。基本培养基（ , ）：仅能满足微生物野生型菌株生长所需的培养基。用表示。不同微生物的基本培养基是不同的。完全培养基（ , ）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需求的天然或半合成培养基。用符号表示。一般可在中加入富含氨基酸、维生素和碱基之类
27、的天然物质配制成。补充培养基（ , ）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基。由该菌株不能合成的营养因子而组成。 分离筛选步骤（一）营养缺陷型的诱发：亚硝基胍、紫外线、亚硝酸等作诱变剂。（二）淘汰野生型菌株.抗生素法：细菌：青霉素法（抑制肽聚糖交链）真菌：制霉素法（作用于细胞膜上的甾醇，引起细胞膜损伤）将诱变处理后的菌体用振荡培养代后，离心、洗涤菌体，转移至中饥饿培养小时，转至中（蔗糖）培养小时，加一定浓度的青霉素。.菌丝过滤法（丝状菌）振荡培养约小时，用灭菌的脱脂棉或滤纸等除去菌丝。继续培养，每隔小时过滤一次，重复次。.高温杀菌法（芽孢菌）诱变，振荡培养，加热至。（三）营养缺陷型的
28、检出.点植对照法（点种法） .影印法 .夹层法（延迟补给法）最上层倾注后培养小时，非营养缺陷型菌株生长成菌落，再倾注最后一层，在上不长，后在上长出的小的菌落为营养缺陷型菌落。.限量补充培养法限量某种营养物质（如蛋白胨），野生型长出大菌落，缺陷型长出小菌落。（四）营养缺陷型的鉴定.测定缺陷型菌株所需生长因子的类别（哪类的判定）（）氨基酸混合物（种）；（）维生素混合物（种）；（）核酸碱基混合液或酵母核酸（）；（）酵母浸出液。待鉴定菌从斜面上用生理盐水刮洗，离心洗涤，制成个的菌悬液，取加入中，混匀到平皿，凝固后用滤纸片分别沾各类物质覆于平板上，培养后观察生长圈。.具体测出缺陷型所需生长因子分组测定突
29、变株的分离和筛选温度敏感突变株（ ）的分离筛选步骤年.最先研究。在许可的温度下能正常生长，在非许可的温度条件下不能生长或微弱生长，表型与野生型不同，这种条件致死突变株即突变株。 突变株累积中间发酵产物的机理：突变导致某种酶的结构发生改变，即突变体的酶蛋白一级结构氨基酸序列发生了变化，而酶的活性中心并未发生改变。在许可温度下培养时，酶活力、菌体生长和代谢均正常。当菌体生长到一定阶段，转移到非许可温度时，突变株生长停止，酶活力逐渐丧失，从而使发酵目的产物得以不断合成累积和往外分泌分离筛选：主要根据菌株在高于或低于最适生长温度的生长状况。一般细菌 为许可温度，为非许可温度；放线菌 为许可温度，为非许
30、可温度；酵母菌 为许可温度，为非许可温度。突变株的分离和筛选其他（）诱变筛选生物素缺陷型在培养基中加入亚适量生物素，有利于的产量提高。（）诱变筛选油酸或甘油缺陷型限量供给油酸或甘油以控制细胞膜磷脂的含量和组成，促使外渗。（）诱变筛选细胞膜结构或功能缺损的突变株通过温度调节来控制细胞膜透性，使菌体能在含高浓度生物素的培养基中能分泌大量。 基因重组育种 自然存在原核微生物中基因重组方式：4.1.1 转化（）受体菌直接吸收来自供体菌的片段通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得供体菌的部分遗传性状的现象。：转化现象在肺炎链球菌、葡萄球菌和流感嗜血杆菌等中被证实。转化因子（ ）：在转化过程中，转化
31、的片段称为转化因子 ，分子量小于，最多不超过个基因。感受态（）：受体菌只有处于感受态时，才能摄取转化因子。细菌处于感受态是因为其表面有一种吸附的受体.4.1.2 接合（）接合是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒）从供体菌转移给受体菌。 接合性质粒：能通过接合方式转移的质粒称为接合性质粒，质粒、质粒、质粒和毒力质粒。4.1.3 转导（）转导是以转导噬菌体为载体，将供体菌的一段转移到受体菌内，使受体菌获得新的性状。 （）分类：普遍性转导（ ）局限性转导（ ）（）两者之间的区别：真核微生物基因重组方式、有性杂交有性细胞的接合和随之发生的染色体重组。能产生有性孢子的酵母和霉菌、准性生殖
32、（）是真菌中不产生有性孢子的一种导致基因重组的过程。类似于有性生殖而又比它更原始的一种繁殖方式。原生质体育种 原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。 原生质体融合是将两种不同的微生物细胞经酶等方法处理，去掉细胞壁成为原生质体后进行融合的过程。 原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。原生质体融合育种的特点(一)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。(二)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种
33、属间微生物的杂交。(三)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。(四)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。（五）有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 (六)提高菌株产量的潜力较大。 (七)有助于建立工业微生物转化体系。原生质体融合育种步骤 标记菌株的筛选和稳定性验证。 原生质体制备。 等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 涂布于再生培养基，再生出菌落。 选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 生产性能筛选。原生质体融合育种的要点（一）标记菌种的选择获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或和抗药性菌
34、株。最重要的是标记必须稳定。采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。（二）原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。影响原生质体制备的因素菌体的前处理为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。菌体的培养时间为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。酶浓度 对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，
35、就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。酶处理温度 破壁时的值渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和和等无机物。基因工程育种是运用体外各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达。 具体步骤6.1.1 目的基因的分离或合成（）从已有的生物基因组中分离（限制酶法；随机剪切构建基因文库）（）用酶学或化学方法合成（逆转录酶，以为模板合成）6.1.2 载体的选择载体应具备的条件
36、q 能在适当的宿主细胞中复制；q 具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源插入；q 具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；q 载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体与宿主便于分离；q 对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。6.1.3 体外重组（目的基因与载体在体外连接）6.1.4 转化或转导（重组分子导入受体细胞）6.1.5 筛选、鉴定阳性重组子. 插入失活法. 菌落原位杂交法. 免疫分析和免疫化学方法6.1.6 重组子的扩增与或表达。 受体细胞必须符合的条件 容易导入重组分子（能有效地吸收外来分子）； 不存在特异的内切酶体系降解外源；
37、对载体的复制和扩增没有严格的限制； 在重组增殖过程中，不会对它进行修饰； 重组缺陷型，不会产生体内重组； 符合重组操作的安全标准（最好不适合在人体内生存或对人畜无致病作用。最好不适合在非培养条件下生存，即只能在加入某些特殊物质的培养基上才能生长。）常用受体菌大肠杆菌优点：.是最早选用的受体菌，人们对它研究较深入；.繁殖快（分钟一代）；.有潜伏的噬菌体；.具质粒；.较为安全。缺点：.细胞壁含一种脂多糖内毒素，很难用分离纯化的方法除去，使人们难以得到精制的生物制品；.大肠杆菌胞外分泌蛋白质少；.安全性方面：潜在危险。枯草芽孢杆菌（ ）优点：.非致病菌；.革兰氏阳性菌细胞壁为肽聚糖，无内毒素污染；.
38、分泌蛋白质种类多；.比较容易吸收外源分子，产生很高转化率；.也含有质粒和噬菌体（但目前已鉴定的许多质粒大部分是隐蔽性的，且没有任何选择标记。）链霉菌放线菌，对人畜不致病，但繁殖较慢（时代时间比大肠杆菌长倍）；有很高的工业价值；分泌胞外酶多。单细胞真菌酿酒酵母高等动植物细胞补充：试验具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌( )组氨酸营养缺陷型菌株()的回复突变率回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变第四部分 微生物鉴定食品卫生标准的内容 感官指标. 理化指标. 微生物指标：菌落总数，大肠菌群，致病菌等 食品微生物检验的意义 是衡量食品卫生质量的重要指标,也
39、是判定被检食品能否食用的科学依据. 可以判断食品加工环境与食品卫生的情况,为卫生管理工作提供科学依据. 可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生. 保证产品的质量,避免不必要的损失. 食品微生物检验的范围 生产环境的检验 原辅料的检验 食品加工、储藏、销售环节的检验 食品的检验 食品卫生标准中的微生物指标 菌落总数 粪便污染指示菌：大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌 致病菌主要包括 ：沙门氏菌、志贺氏菌、黄金色葡萄球菌、致病性链球菌等四种。 致病菌检验参考菌群的选择：蛋与蛋制品：沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等水产品海产品：链球菌、副溶血性弧菌乳制品：沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、蜡样
40、芽胞杆菌畜禽肉类：肠道致病菌和致病性球菌米面类：蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母霉菌等罐头：耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌样品的保留（）阴性样品：在发出报告可与时处理；（）阳性样品：在发出报告以后天才能处理样品；（）进口食品的阳性样品：要保留个月才能处理。（）微生物检验不进行复检 菌落总数定义：指食品检样经处理，在一定条件下培养后，所得食品或食品中或食品表面积上所含有的细菌菌落总数。 食品卫生意义 ：. 它可以作为食品被污染程度的标志，一般食品中细菌总数越多，则表明该食品污染程度越深。它可以用来预测食品存放的期限或程度。 常规检验方法5.3.1 稀释平板菌落计数法( )（一
41、）操作步骤样品的稀释 倾注平皿 培养（）小时 计数报告（二）培养条件 培养温度一般为（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用） 培养时间一般为，有些方法只要求的培养即可计数 培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养后，培养基失重不应超过 在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（），培养后菌落呈红色，易于分别 （三）计数原则 到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于，但不得超过。 中国国家标准计数时应选取菌落数在的平板（检验检疫行业标准要求为）。 若有二个稀释度均在之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于取平均
42、数，比值大于则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。 若所有稀释度均不在计数区间。如均大于，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 如均小于，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。 如菌落数有的大于，有的又小于，但均不在之间，则应以最接近或的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。（四）计算方法o 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每（）样品中菌落总数结果。o 若有两个连续稀释度的平板菌落
43、数在适宜计数范围内时，按公式（）计算： ()（）式中：样品中菌落数；平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；稀释因子（第一稀释度）。（五）菌落数的报告按国家标准方法规定 菌落数在时，按实有数字报告。 如大于时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。 固体检样以克（)为单位报告，液体检样以毫升（）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（）报告。 5.3.2 细菌总数的其它检验方法 涂布平板法、点滴平板法、螺旋平板法：螺旋平板法是由一台机器完成的。 （、氯化三苯四氮唑）显色法在计数琼脂中加入适量的( 加到琼脂中)，细菌菌落长成红颜色，对去除食品本底颗粒物干扰非常有意义.粪便污染指示菌 大肠菌群 包括肠杆菌科的埃氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属，这些细 菌均来自人和温血动物的肠道，需氧与兼性厌氧，在能分解乳糖产酸产气，以革兰氏阴 性杆菌为多。 大肠菌数的高低，表明粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。 大肠菌群包括：粪（便）大肠菌群和非粪（便）大肠菌群。 典型大肠杆菌代表粪便的近期污染，非典型的可能为粪便的陈旧污染。 6.1.1大肠菌群数量的表示方法有两种：）大肠菌群（ ） 指每100g或食品检样中大肠菌群最可能数（ ）。大肠菌群是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近