微生物资料(共14页).doc

《微生物资料(共14页).doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物资料(共14页).doc（14页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、精选优质文档-倾情为你奉上二、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其包括两个方面：1.选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；2.微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等计数来完成的。纯培养的确定：1.确定其菌落观察特征；2.结合显微镜检测个体形态特征的确定。三、器材1.

2、菌种 迷曲霉；2.培养基 高氏号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基；3.溶液或试剂 10%酚 盛9ml无菌水的试管 盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂；4.仪器或者其他用具 无菌玻璃涂棒 无菌吸管 接种环 无菌培养皿 链霉素和土样 显微镜 血细胞计数板等。四、操作步骤1. 稀释涂布平板法(1) 倒平板 将肉膏蛋白胨琼脂培养基， 高氏号琼脂培养基；马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至5560， 高氏号琼脂培养基加入10%酚数滴，马丁氏琼脂培养基加入链霉素溶液。混匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿；(2) 制备土壤稀释溶液 称取土样10g，放入盛有90ml无菌水

3、并带入玻璃珠的三角烧瓶，振动约20min，使土样与水分混合，将细胞分散.用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释的土壤溶液；(3) 涂布 将上述每种培养基的三个平板地面分别用记号笔写上10-4，10-5，10-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4，10-5，10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml对号放入已写好室温下静置510min，使菌液吸附进培养基；(4) 培养 将高氏号琼脂培养基平板;马丁

4、氏琼脂培养基平板倒置于28温室中培养35day，肉膏蛋白胨平板倒置于37温室中培养23day；(5) 挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28和37温室培养，大菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。2.平板划线分离法(1)倒平板 按稀释涂布平板倒平板，并用记号标明培养基名称，土样编号和实验日期；(2) 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线.划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进

5、行稀释，使之形成单个菌落；(3) 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。2、高压蒸汽灭菌二、基本原理平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的23或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。现在常使用菌落形成单位。该计数法的缺点是操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且

6、测定结果易受多种因素的影响，但是这种计数方法最大的优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等含菌指数或污染度的检测。6 结果 dilutionAverage count perml of sampleLaxtobacillus count perml of sample革兰氏染色原理：G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。在接近火焰处揭开培养皿

7、，至恰好金属环伸入培养皿，蘸取一接种耳菌悬液，在皿盖的汽水中涂抹稀释，然后用接种耳在琼脂上自由划线。开始时可近乎是涂抹，然后一举划线，中间不要停顿，划成约6毫米间距的线条，迅速盖好皿益倒转培养皿。通常不用再蘸新菌液，迅速划二号三号培养皿，无疑可以得到越来越稀的单个菌落。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。2）草酸铵结晶紫染1分钟。3）自来水冲洗。4）加碘液覆盖涂面染1分钟。5）水洗，用吸水纸吸去水分。6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。7）蕃红染色液（稀）（或沙黄）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。染色的结果，革

8、兰氏正反应菌体都呈紫色，负 热门关键字： 窗体顶端窗体底端当前位置： 正文微生物的分离、纯化和接种点击： 作者： 来源： 时间： 2007-09-21 微生物的分离、纯化和接种 （一）微生物的分离、纯化 1 目的 1.1 了解微生物分离和纯化的原理 1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法 2 原理 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物

9、在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本材料 3.1 培养基 淀粉琼脂培

10、养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。 3.2 溶液或试剂 10%酚液，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。 3.3 仪器或其它用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板、涂布器等。 4 流程 倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。 5 步骤 5.1 稀释涂布平板法 5.1.1 倒平板 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至5560时，高氏I号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液(终浓度为30g/m

11、l)，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。 倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 5.1.2 制备土壤稀释液 称取土样l0g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml(无菌操作见图-2)加入另一

12、盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管（图4-1 A）。 5.1.3 涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6 三管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置(图4-1 B)。 图 4-1 从土壤中分离微生物的操作过程 用无菌玻璃涂棒按图4-2所示，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使

13、之分布均匀。室温下静置5l0min，使菌液浸入培养基。 5.1.4 培养 将高氏I号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28温室中培养35d，肉膏蛋白胨平板倒置于37温室中培养23d。 5.1.5 挑菌落 图4-2 平板涂布操作图 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上(图4-1 C)，分别置28和37温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。 5.2 平板划线分离法 5.2.1 倒平板 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l的土壤悬液一环在平板上划线(图4-3)。

14、划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种： 图 4-3 平板划线操作图 图 4-4 划线分离图 用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图4-4)。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 5.2.3 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。 5.2.5 结果判定 所做涂布平板法和

15、划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因并重做。 在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。 (二)微生物的接种技术。 1 目的 1.1学习掌握微生物的几种接种技术 1.2 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节 2 器械和用品 酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。 3.2 菌种和培养基 菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 培养基：普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。 4 操作步骤 5.1 斜面接种法

16、 斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。 通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。 将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈450度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面（图4-5）。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。 右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧

17、红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。 将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。 图 4-

18、5 斜面试管接种 52 液体接种法 多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下： 由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。 由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可（图 4-5）。 接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工

19、作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。 5.3 固体接种法 普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为： 用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。 用固体种子接种固体料。包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种

20、子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。 5.4 穿刺接种法 此法多用于半固体、醋酸铅、三糖铁琼脂与明胶培养基的接种，操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同。但必须使用笔直的接种针，而不能使用接种环。 接种柱状高层或半高层斜面培养管时，应向培养基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接种针。注意勿使接种针在培养基内左右移动，以使穿刺线整齐，便于观察生长结果。 6 结果 分别记录并描绘平板划线、斜面和半固体接种的微生物生长情况和培养特征。 7 思考 7.1 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出为什么高氏I号

21、培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？ 7.3 试述如何在接种中，贯彻无菌操作的原则? 7.4 以斜面上的菌种接种到新的斜面培养基为例说明操作方法和注意事项。 7.5试设计一个 微生物的分离、纯化和接种 （一）微生物的分离、纯化 1 目的 1.1 了解微生物分离和纯化的原理 1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法 2 原理 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,

22、或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所

23、，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本材料 3.1 培养基 淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。 3.2 溶液或试剂 10%酚液，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。 3.3 仪器或其它用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板、涂布器等。 4 流程 倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。 5 步骤 5.1 稀释涂布平板法 5.1.1 倒平板 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶

24、化待冷至5560时，高氏I号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液(终浓度为30g/ml)，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。 倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 5.1.2 制备土壤稀释液 称取土样l0g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬

25、液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml(无菌操作见图-2)加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管（图4-1 A）。 5.1.3 涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6 三管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置(图4-1 B)。 图 4-1 从土壤中分离微生物的操作过程 用无

26、菌玻璃涂棒按图4-2所示，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5l0min，使菌液浸入培养基。 5.1.4 培养 将高氏I号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28温室中培养35d，肉膏蛋白胨平板倒置于37温室中培养23d。 5.1.5 挑菌落 图4-2 平板涂布操作图 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上(图4-1 C)，分别置28和37温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。 5.2 平板划线分离法 5.2.1 倒平板 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号

27、和 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l的土壤悬液一环在平板上划线(图4-3)。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种： 图 4-3 平板划线操作图 图 4-4 划线分离图 用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图4-4)。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 5.2

28、.3 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。 5.2.5 结果判定 所做涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因并重做。 在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。 (二)微生物的接种技术。 1 目的 1.1学习掌握微生物的几种接种技术 1.2 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节 2 器械和用品 酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。 3.2 菌种和培养基 菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureu

29、s）。 培养基：普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。 4 操作步骤 5.1 斜面接种法 斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。 通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。 将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈450度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面（图4-5）。以右手在火焰旁转动两管棉塞

30、，使其松动，以便接种时易于取出。 右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。 将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种

31、环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。 图 4-5 斜面试管接种 52 液体接种法 多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下： 由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。 由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸

32、管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可（图 4-5）。 接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。 5.3 固体接种法 普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为： 用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量

33、加大，影响培养效果。 用固体种子接种固体料。包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。 5.4 穿刺接种法 此法多用于半固体、醋酸铅、三糖铁琼脂与明胶培养基的接种，操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同。但必须使用笔直的接种针，而不能使用接种环。 接种柱状高层或半高层斜面培养管时，应向培养基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接种针。注意勿使接种针在培养基内左右移动，以使穿刺线整齐，便于观察生长结果。 6 结果 分别记录并描绘平板划线、斜面和半固体接种的

34、微生物生长情况和培养特征。 7 思考 7.1 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出为什么高氏I号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？ 7.3 试述如何在接种中，贯彻无菌操作的原则? 7.4 以斜面上的菌种接种到新的斜面培养基为例说明操作方法和注意事项。 7.5试设计一个 微生物的分离、纯化和接种 （一）微生物的分离、纯化 1 目的 1.1 了解微生物分离和纯化的原理 1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法 2 原理 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用

35、于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

36、土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本材料 3.1 培养基 淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。 3.2 溶液或试剂 10%酚液，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。 3.3 仪器或其它用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板、涂布器等。 4 流程 倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。 5 步骤 5.1

37、稀释涂布平板法 5.1.1 倒平板 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至5560时，高氏I号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液(终浓度为30g/ml)，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。 倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 5.1.2 制备土壤稀释液 称取土样l0g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠

38、的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml(无菌操作见图-2)加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管（图4-1 A）。 5.1.3 涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6 三管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2ml

39、，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置(图4-1 B)。 图 4-1 从土壤中分离微生物的操作过程 用无菌玻璃涂棒按图4-2所示，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5l0min，使菌液浸入培养基。 5.1.4 培养 将高氏I号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28温室中培养35d，肉膏蛋白胨平板倒置于37温室中培养23d。 5.1.5 挑菌落 图4-2 平板涂布操作图 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上(图4-1 C)，分别置28和37温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

40、 5.2 平板划线分离法 5.2.1 倒平板 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和 划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l的土壤悬液一环在平板上划线(图4-3)。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种： 图 4-3 平板划线操作图 图 4-4 划线分离图 用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线

41、和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图4-4)。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 5.2.3 挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。 5.2.5 结果判定 所做涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因并重做。 在三种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。 (二)微生物的接种技术。 1 目的 1.1学习掌握微生物的几种接种技术 1.2 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节 2 器械和用品 酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。 3.2 菌种和培养基 菌种

42、：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 培养基：普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。 4 操作步骤 5.1 斜面接种法 斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。 通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。 将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈450度角，并能清楚地看

43、到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面（图4-5）。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。 右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。 将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接

44、种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。 图 4-5 斜面试管接种 52 液体接种法 多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下： 由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进

45、行。 由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可（图 4-5）。 接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。 5.3 固体接种法 普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为： 用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作

46、将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。 用固体种子接种固体料。包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。 5.4 穿刺接种法 此法多用于半固体、醋酸铅、三糖铁琼脂与明胶培养基的接种，操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同。但必须使用笔直的接种针，而不能使用接种环。 接种柱状高层或半高层斜面培养管时，应向培养基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接种针。注意勿使接种针在培

47、养基内左右移动，以使穿刺线整齐，便于观察生长结果。 6 结果 分别记录并描绘平板划线、斜面和半固体接种的微生物生长情况和培养特征。 7 思考 7.1 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出为什么高氏I号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？ 7.3 试述如何在接种中，贯彻无菌操作的原则? 7.4 以斜面上的菌种接种到新的斜面培养基为例说明操作方法和注意事项。 7.5试设计一个实验，从土壤中分离酵母菌并进行计数。 上一篇： 下一篇： 推荐文章相关文章推荐专题 联系我们Copyright 试验方案Powered by DedeCms email:htmyth Optimized to 1024x768 to Firefox,Opera and MS-IE6反应菌体都呈红色。专心-专注-专业