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1、出凝血功能的常用检测方法及其在心血管疾病中的临床应用,第一部分: 出凝血的机理 凝血系统 抗凝系统 纤溶系统,第二部分:,常用检测方法 PT PTA INR CT APTT ACT BT BPC,第三部分,常用抗血小板药物，抗凝药物，溶栓药物的作用机制及其监测方法。 抗血小板药物(阿司匹林、抵克力得、潘生丁) 抗凝血药物 (肝素、低分子肝素、华法令) 抗血栓药物 (尿激酶UK、链激酶SK、t-PA、 rt-PA),凝血因子命名国际委员会于1959年8月召开专门会议对已发现的十二种凝血因子根据被发现的顺序以罗马数字予以命名, 纤维蛋白 凝血酶原 组织因子 钙离子 易变因子 稳定因子 抗甲种血友病
2、球蛋白 抗血友病因子乙 斯多特柏劳因子（stuart-prower factor) 抗血友病因子丙 接触因子 纤维蛋白稳定因子 是因子 的活化形式，不是独立的因子,凝血瀑布,内源性通路,外源性通路,内源性凝血途径,外源性凝血途径,受损组织 释放组织因子 TF + VII Ca2+,Xa V, Ca2+ PF3 凝血酶原 凝血酶a 纤维蛋白原 纤维蛋白a 可溶性纤维蛋白聚合体 不溶性纤维蛋白聚合体,共同通路,表面损伤 XII XI IX VIII Ca2+ PF3 X,X,凝血系统,三个阶段 (一)凝血活酶形成阶段 (二)凝血酶形成阶段 (三)纤维蛋白形成阶段,VII因子激活,X 因子激活,凝血
3、酶原转化为凝血酶,凝血酶原,凝血酶,磷脂,纤维蛋白原的转化,凝血酶,纤维蛋白原,纤维蛋白肽A和B,抗凝系统,（一）AT- 丝氨酸蛋白水解酶抑制物，对已激活以丝氨酸为活性中心的凝血因子有抑制物作用a、a、a、a、a、a AT- 64,000的糖蛋白，由单一多肽链组成，它可与丝氨酸蛋白水解酶的活性中心按1：1定量结合。使四种已被激活的凝血因子灭活。 AT-占血浆中总抗凝血酶活性的5067%,抗凝系统,（二）肝素 肝素作用于AT-的赖氨酸残基而使抗凝血酶作用增强1000倍 AT- 肝素 肝素 AT-复合物 凝血酶 凝血酶AT-复合物 肝素AT-凝血酶复合物 游离出的肝素可循环使用,纤维蛋白溶解系统,
4、纤溶激活物(t-PA，UK，SK) 纤溶酶原 纤溶酶(PL) 纤维蛋白(Fg) 纤维蛋白降解产物(FDP) Fg PL 片断X PL 片断Y PL 片断E 小分子多肽A.B.C 片段D 片断D 纤维酶原（Plasminogen,PLg) 纤溶酶（Plasmin,PL）,凝血时间（clotting time，CT）,原理：血液离体后接触带负电荷的表面（玻璃器材）时被激活，激活内凝系统 正常值：412min 本试验操作简便可以用手掌保温，在床旁由医师进行，既往最为常用。应用肝素后CT延长至正常2倍左右，2030min,活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplas
5、tin time，APTT）,原理：以白陶土等为激活剂充分激活之后，测定被检血浆的凝固时间 正常值：3545s 病人结果较正常延长，超过10s有意义 意义：(1)参加凝血活酶形成的因子，如、，血友病甲、乙、丙。 (2)凝血酶原，纤维蛋白严重 (3)肝素抗凝治疗时 其中肝素抗凝治疗期间要求APTT延长到正常值1.52.5，是监测肝素用量较理想的试验。 常用范围75100s 阜外医院(6080s) 100s 可导致出血,活化凝血时间（activated clotting time ，ACT）,原理：同试管法全血凝固时间(CT)，但因试管内预先加入少量接触活化用凝血活酶混悬液，能充分激活血中，并为凝
6、血反应提供丰富的催化表面，使凝固时间缩短，比CT更敏感，且节省临床医师床边监测的时间。 正常值：59.2117s 应用肝素后的预期值180300s,凝血酶原时间（prothrombin，PT）,原理：在被检血浆中加入过量的组织因子（兔脑或胎盘浸液）和钙离子使迅速生成外源性凝血酶原激活物，后者能使被检血浆迅速凝固，其所需时间称为PT，主试验主要检测外源性凝血系统。检测、含量和活性,凝血酶原时间（prothrombin，PT）,正常值： PT 1114s PTA(%) 80120% INR 10.15(0.851.15) PR(凝血酶原时间比值)病人PT(s)/正常对照PT(s) PT延长至正常2
7、倍时，PR值约增至2倍 INRPR|s| |s|国际标准化比值(international normalized ratio，INR) PR凝血酶原时间比值 |s|国际敏感指数(international sensitivity index，|s|) INR与PT成正比 华法令抗凝治疗要求 与PTA成反比 PT 1114s 2030s PTA 80-120% 3050s INR 0.851.15 23,血小板的功能,血小板计数 BPC 1030万/mm3称为血小板减少 常见于 1.血小板生成：见于造血功能受到损害，如再障、急性白血病、急性放射病 2.血小板破坏：见于原发性血小板减少性紫癜(IT
8、P)，脾功能亢进 3.血小板消耗过多：如弥漫性血管内凝血(DIC),血小板的功能,血小板粘附功能(pletlet adhensive test，PadT) 血小板所具有的能粘附于胶原纤维及其他带负电荷物质表面的特性，称为粘附功能。以粘附率表示，当一定量抗凝血液与一定表面积的异物表面(如玻璃珠或玻璃瓶内壁)接触一定时间后，即有一定数量的BPC粘附于异物表面，测定其粘附前、后BPC数值之差，便于计算出粘附率。 正常值：男性 34.9 5.95% 女性 39.4 5.19%,血小板黏附,内皮,胶原蛋白,血小板黏附,血小板的功能,血小板聚集功能(pletlet aggregation test，Pag
9、T) 血小板之间相互粘着的特性称为血小板聚集 聚集诱导剂：ADP胶原、凝血酶、肾上腺素 测定：血小板聚集仪 、 用诱导剂ADP 正常值：最大聚集率为：62.7 16.1%,有关纤溶亢进的检查,3P试验：血浆鱼精蛋白副凝试验 (plasma protamine paracoagulation test，3P试验) 原理：检测FDP的存在 抗凝血浆0.5ml1%鱼精蛋白溶液0.05ml，37水溶15min 可见纤维蛋白丝 阳性 FDP与纤维蛋白单体结合(FM) +鱼精蛋白 使FDP与FM分开 FM自行聚合（副凝） 正常：3P试验(一) 临床意义：1.DIC继发纤溶亢进期 3P(+) 阳性率68.1
10、78.9% 2.溶拴治疗后 3P 可呈阳性(+),有关纤溶亢进的检查,FDP定量 (fibrinogen degradation product，FDP) 正常值：正常人血清中FDP含量5000ug/ml,抗血小板治疗（抑制血小板的粘附和聚集功能 ）,阿斯匹林：抑制环化加氧酶 使TXA2，抑制血小板聚集 血小板膜磷脂 阿斯匹林 花生四烯酸 () 环化加氧酶 环内过氧化物(PGG2、PGH2) TXA2合成酶 TXA2 血小板释放ADP 使环化加氧酶活化中心的丝氨酸乙酰化 促进血小板聚集 而失活，因而TXA2，抑制血小板聚集,水杨酸,乙酰水杨酸,抗血小板治疗（抑制血小板的粘附和聚集功能 ）,潘生
11、丁(persaritin，双嘧啶胺醇) 使cAMP抑制血小板聚集，抑制磷酸二酯酶增加血小板内cAMP，抑制血小板聚集 ATP 腺苷酸环化酶 cAMP 磷酸二酯酶 5AMP,抗血小板治疗（抑制血小板的粘附和聚集功能 ）,抵克力得(ticlopidine，噻氯匹定) 抑制ADP、胶原、凝血酶等诱生剂对BPC的聚集 1.抑制胶原、ADP、凝血酶和肾上腺素等诱发的血小板聚集 2.腺苷酸化酶，使血小板内cAMP，抑制血小板聚集,C14H14ClNSHCl 301.6,剂型 250mg/1片 10片/和 剂量 250mg Qg 副作用： WBC BPC 胃肠道刺激,抗凝血药物,低分子量肝素(low mol
12、ecular weight heparin，LMWH) 以普通肝素为原料，通过层析、化学修饰和酶解等方法制成的 普通肝素由两类分子组成： 类和 类(A 、B ) 类与AT-亲和力较弱 A与AT-亲和力极强，并具有抗a活性 B与AT-亲和力极强，具有抗a活性 LMWH 含有75类，25 A，而B含量极少 因此，LMWH有很强的抗a活性和AT-亲和力，而抗a活性则较低,普通肝素与低分子肝素的比较,低分子肝素 2:1 - 4:1 200012000 24h 高 无需 ,抗 Xa:IIa 活性比值 分子量 作用持续时间 与内皮细胞结合能力 生物利用度 需 aPTT 监测 致出血倾向 对血小板抑制作用,
13、普通肝素 1:1 300050000 45h 低 需要 ,Antman 1998,生产制造过程 肝素的来源 盐的性质 平均分子量，分子量分布 分子链末端的结构 硫酸化程度 抗Xa:IIa活性比值 药代动力学，药效学特性 临床循证,低分子肝素之间的不同点,克赛 Clexane,速碧林 Fraxiparine,法安明 Fragmin,不同低分子肝素的分子链末端结构不同,* 来源为牛+猪肝素；其他均为猪肝素,不同低分子肝素的制备：降解方法和精确的制造过程决定不同的分子量分布,J. Fareed, J.M. Walenga, D. Hoppensteadt et al. Biochemical and
14、 Pharmacologic Inequivalence of Low Molecular Weight Heparins. Ann N.Y. Acad. Sci. 1989; 556:333-353,Nadroparin速碧林,Enoxaparin克赛,Dalteparin法安明,Parnaparin栓复欣,ardeparin,tinzaparin,CY 222,certoparin,Heparin (PM)普通肝素,低分子肝素的分子量分布不同,R.J. Linhardt, D. Loganathan, A. Al-Hakim et al Oligosaccharide mapping of
15、 Low Molecular Weight Heparins: Structure and activity differences. J. Med. Chem; 1990; 33; 1639-1645,低分子肝素的平均分子量不同,低分子量肝素 (LMWH),Anti-Xa Anti-IIa 比率 (IU/mg 干质) (IU/mg 干质) Enoxaparin1 依诺肝素 (克赛) 102.8 24.9 4.1 Nadroparin1 那屈肝素 (速碧林) 103.6 29.9 3.5 Reviparin2 瑞肝素 127 36 3.5 Dalteparin1 达肝素(法安明) 167.2
16、64.2 2.4 Certoparin1 舍托肝素 106.4 44.7 2.4 Tinzaparin1 亭扎肝素 99.6 53.7 1.9 UFH3 肝素 193 193 1.0,1. European Pharmacopeia Commission (March 1994) 2. Knoll Pharma 3. Hirsh J, et al. Chest 1998;114:489S-510S 4. Bergqvist D, et al. Br J Surg 1995;82:496-501,Anti-Xa activity was measured using an amidolytic
17、assay (chromogenic substrate S-2222). Anti-IIa activity was measured using activated partial thromboplastin time4,LMWH, low-molecular-weight heparin UFH, unfractionated heparin,低分子肝素治疗不稳定性心绞痛和非Q波心梗,研究名称低分子肝素vs.对照组 结果 FRISC法安明 vs.安慰剂+/- FRISC - II法安明 vs.安慰剂 / 介入 vs. 非介入 - FRIC法安明 vs. 普通肝素+/- TIMI - 1
18、1A克赛 (1.0mg vs. 1.25mg/kg) 剂量范围研究 FRAXIS速避凝 vs. 普通肝素 - ESSENCE克赛 vs. 普通肝素+ TIMI - 11B 克赛 vs. 普通肝素+,速避凝 0.1 ml/10 kg q 12 H 皮下,1 - 6天,速避凝 0.1 ml/10 kg q 12H 皮下,速避凝 0.1 ml/10 kg q 12 H 皮下,7 - 14天,不稳定性心绞痛和非Q波心梗,低分子肝素安慰剂,普通肝素 静脉,FRAXIS,低分子肝素安慰剂,N=3,468 17国家 179中心,设计：随机，三盲，安慰剂对照， 平行组，多中心 主要临床终点: 14天时的心因死
19、亡 ，心梗和再梗/再发心绞痛,FRAXIS,有效性：死亡，心梗或再发心绞痛,18.1 %,0,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,0,4,8,12,16,90,14天速避凝,6天速避凝,20.0%,%,天,17.8%,普通肝素,26.2%,22.2 %,22.3%,MCE,FRAXIS (速避凝 Nadroparin)结果,主要临床终点(心因死亡，心梗，再发心绞痛) 在6天和14天时，三个治疗组之间没有显著差异 但是速避凝14天治疗组在第3个月时，明显较差 延长至14天的速避凝治疗，非但没有取得附加的临床收益，而且增加病人出血的危险,试验设计,克赛 1mg/kg q 12 H
20、皮下 + 阿司匹林,普通肝素 静脉，调整剂量 + 阿司匹林,14天,14天,30天,30天,不稳定性心绞痛 和非Q波心梗,治疗期 至少48小时, 最长8天,随访期,N=3,171,ESSENCE,1年,1年,MI, myocardial infarction ASA, acetylsalicylic acid UFH, unfractionated heparin IV, intravenous,Cohen M, et al. N Engl J Med 1997;337:447-52 Goodman SG, et al. J Am Coll Cardiol 2000 (in press),25
21、,20,15,10,5,0,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,30,普 通 肝 素,克 赛,入 组 后 天 数,发生心脏事件的病人 %,14天, 30天的事件累计：死亡，心梗或复发心绞痛,p=0.019,p=0.016,ESSENCE,Cohen M, et al. N Engl J Med 1997;337:447-52,结 论,ESSENCE,克赛明显减少不稳定性心绞痛和非Q波心肌梗塞患者14-天时三重终点事件 (死亡, 心肌梗塞, 复发性心绞痛) 发生率, 并持续下降到第30天 这种优越性是在没有增加严重出血事件发生率的前提下取得的, 但轻
22、微出血事件发生率增加了，主要是由于注射部位淤斑造成的,Cohen M, et al. N Engl J Med 1997;337:447-52,事件累积发生率 (%),P=0.022,ESSENCE - 1 年随访,P=0.016,1 年时的心脏事件的累计: 死亡, 心梗, 再发心绞痛克赛 的治疗优势在 1 年时依然存在,结论,在1年时, 同普通肝素治疗组相比，克赛组患者死亡、心肌梗塞或复发性心绞痛事件发生风险明显下降 (P=0.022) ESSENCE研究中克赛相对于普通肝素在第14天和30天的显现的早期治疗优势可保持到1年 在1年时，同普通肝素组相比，克赛组患者医疗花费明显减少 克赛组患者
23、持续减少了住院时间、心脏手术率和30天住院治疗和占用医生时间花费 美国对患者统计结果显示，克赛治疗组患者每人可节约超过 US$1000,ESSENCE - 1 年随访,克赛 固定剂量 65 kg 40 mg60 mg q 12 h,试验设计,克赛 30 mg 静注 + 1.0 mg/kg q 12 h 皮下,普通肝素 70 U/kg 静注 + 15U/Kg/h 静脉,不稳定性心绞痛 非Q波心梗,急性期 最短 72h, 最长 8 天,慢性期,固定剂量安慰剂 皮下 q 12 h,43 天,N=3,910,TIMI - 11B,延长35 天,发生第一次事件的时间 (三重终点): 急性期克赛组48小时
24、事件发生率明显下降,10 ,8 ,6 ,4 ,2 ,0,8,16,32,40,48,56,72,普通肝素,克赛,随机后小时,发生事件病人%,7.3%,5.5%,相对风险降低： 23.8% P=0.029,Triple endpoint, death/myocardial infarction/urgent revascularization UFH, unfractionated heparin,Antman EM, et al. Circulation 1999;100:1593-1601,TIMI - 11B,死亡，心梗或急诊血运重建,TIMI - 11B,主要临床终点: 43天死亡，心梗
25、或急诊血运重建,TIMI - 11B,结论：急性期,克赛在急性期治疗不稳定性心绞痛和非Q波心梗，减少死亡和严重心脏缺血事件方面，明显优于普通肝素 具有这样的优越性的同时，克赛并不增加严重出血 TIMI 11B研究的结果肯定了克赛治疗不稳定性心绞痛和非Q波心肌梗塞患者的优越性 与克赛初始的临床优势一直维持到第43天，可是并未观察到慢性期治疗有关的心脏事件的进一步降低 慢性期治疗中，克赛组的主要出血（病人自发的和与治疗有关的）较安慰剂组有增加，但总数值仍然很低,TIMI - 11B,结论：慢性期,抗凝血酶,抗血小板,低分子肝素 - 克赛,口服GP IIbIIIa,直接抗凝血酶药物,普通肝素,静脉
26、GP IIbIIIa,阿司匹林,克赛 - 治疗急性冠状动脉综合征的新标准,噻氯吡啶,氯吡格雷,理想的联合治疗,Beta 阻滞剂,华法令(Warfarin),1.维生素K依赖性凝血因子 2.抗凝机制羧机化 糖 羧机化 合成中的蛋白质 前凝血酶 凝血酶原 （糖蛋白） 依赖VitK羧机化 （） （检体蛋白质） () 无凝血活性 华法令,华法令(Warfarin),华法令与VitK结构相似，与VitK竞争羧机化酶而妨碍VitK的利用 如华法令用量过大，发生出血，即应停药，并用大量VitK对抗之,华法令,维生素K3,溶栓药物,原理： 促进纤溶，主要使PLgPL，溶解纤维蛋白，从而溶解血栓。,溶栓药物（一
27、）,第一代 以UK，SK为代表 1.尿激酶（urokinase，UK）从尿中分离提取，或从培养人胚肾细胞提取出来的，无抗原性。 2.链激酶（streptokinase，SK）从链球菌体中分离提取，有抗原性,溶栓药物（二）,第二代 以t-PA，rt-PA为代表，其溶拴作用优于UK、SK，副作用也较小。 1.组织型纤溶酶原激活物（tissue type plasminogen activator， t-PA） 2.重组组织型纤溶酶原激活物（recombinant tissue type plasminogen activator， rt-PA）,溶栓药物（三）,第三代 导向性溶拴药 1.抗体导向溶拴剂 抗纤维蛋白单抗(59D8)与溶拴剂(t-PA，UK)连接 此单抗将携带溶拴剂特异地结合到血栓中的纤维蛋白上，血栓部位溶拴剂高度集中，促使溶栓速度加快。 如 UK-59D8 比单纯UK增加100倍 t-PA- 59D8 比单纯t-PA高20倍 特异性单抗如导弹弹头，将溶拴剂导向血栓，提高溶栓药物的特异性克服出血的副作用。 2.导向溶栓双抗体的应用 t-PA单抗(TCL8) 纤维蛋白单抗(59D8),谢谢大家！,