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1、出凝血功能的常用检测方法及其在心血管疾病中的临床应用 第一部分:出凝血的机理出凝血的机理 凝血系统 抗凝系统 纤溶系统 第二部分:常用检测方法常用检测方法 PT PTA INR CT APTT ACT BT BPC第三部分 常用抗血小板药物，抗凝药物，溶栓药物的作用机制及其监测方法。 抗血小板药物(阿司匹林、抵克力得、潘生丁) 抗凝血药物 (肝素、低分子肝素、华法令) 抗血栓药物 (尿激酶UK、链激酶SK、t-PA、 rt-PA) 凝血因子命名国际委员会于1959年8月召开专门会议对已发现的十二种凝血因子根据被发现的顺序以罗马数字予以命名 纤维蛋白纤维蛋白 凝血酶原凝血酶原 组织因子组织因子
2、钙离子钙离子 易变因子易变因子 稳定因子稳定因子 抗甲种血友病球蛋白抗甲种血友病球蛋白 抗血友病因子乙抗血友病因子乙 斯多特柏劳因子（斯多特柏劳因子（stuart-prower factor) 抗抗血友病因子丙血友病因子丙 接触因子接触因子 纤维蛋白稳定因子纤维蛋白稳定因子是因子是因子 的活化形式，不是独立的因子的活化形式，不是独立的因子凝血瀑布凝血瀑布内源性内源性通路通路外源性外源性通路通路内源性凝血途径内源性凝血途径外源性凝血途径外源性凝血途径受损组织受损组织释放组织因子释放组织因子TF + VII Ca2+ Xa V, Ca2+ PF3凝血酶原凝血酶原 凝血酶凝血酶a 纤维蛋白原纤维蛋白
3、原 纤维蛋白纤维蛋白a 可溶性纤维蛋白聚合体可溶性纤维蛋白聚合体 不溶性纤维蛋白聚合体不溶性纤维蛋白聚合体共同通路共同通路表面损伤表面损伤XIIXIIXVIII Ca2+ PF3XX凝血系统三个阶段三个阶段(一)凝血活酶形成阶段(二)凝血酶形成阶段(三)纤维蛋白形成阶段VII因子激活因子激活X 因子激活因子激活凝血酶原转化为凝血酶凝血酶原转化为凝血酶凝血酶原凝血酶磷脂纤维蛋白原的转化纤维蛋白原的转化凝血酶纤维蛋白原纤维蛋白肽A和B抗凝系统（一）AT- 丝氨酸蛋白水解酶抑制物，对已激活以丝氨酸为活性中心的凝血因子有抑制物作用a、a、a、a、a、a AT- 64,000的糖蛋白，由单一多肽链组成，
4、它可与丝氨酸蛋白水解酶的活性中心按1：1定量结合。使四种已被激活的凝血因子灭活。 AT-占血浆中总抗凝血酶活性的5067%抗凝系统（二）肝素 肝素作用于AT-的赖氨酸残基而使抗凝血酶作用增强1000倍 AT-肝素 肝素 AT-复合物 凝血酶凝血酶AT-复合物 肝素AT-凝血酶复合物 游离出的肝素可循环使用纤维蛋白溶解系统 纤溶激活物(t-PA，UK，SK)纤溶酶原 纤溶酶(PL) 纤维蛋白(Fg) 纤维蛋白降解产物(FDP) Fg PL 片断X PL 片断Y PL 片断E 小分子多肽A.B.C 片段D 片断D纤维酶原（Plasminogen,PLg) 纤溶酶（Plasmin,PL）凝血时间（c
5、lotting time，CT）原理：血液离体后接触带负电荷的表面（玻璃器材）时被激活，激活内凝系统正常值：412min本试验操作简便可以用手掌保温，在床旁由医师进行，既往最为常用。应用肝素后CT延长至正常2倍左右，2030min 活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT）原理：以白陶土等为激活剂充分激活之后，测定被检血浆的凝固时间正常值：3545s病人结果较正常延长，超过10s有意义意义：(1)参加凝血活酶形成的因子，如、，血友病甲、乙、丙。 (2)凝血酶原，纤维蛋白严重 (3)肝素抗凝治疗时其中肝素抗凝治疗期间要求APTT延
6、长到正常值1.52.5，是监测肝素用量较理想的试验。 常用范围75100s 阜外医院(6080s) 100s 可导致出血活化凝血时间（activated clotting time ，ACT）原理：同试管法全血凝固时间(CT)，但因试管内预先加入少量接触活化用凝血活酶混悬液，能充分激活血中，并为凝血反应提供丰富的催化表面，使凝固时间缩短，比CT更敏感，且节省临床医师床边监测的时间。正常值：59.2117s应用肝素后的预期值180300s凝血酶原时间（prothrombin，PT）原理：在被检血浆中加入过量的组织因子（兔脑或胎盘浸液）和钙离子使迅速生成外源性凝血酶原激活物，后者能使被检血浆迅速凝
7、固，其所需时间称为PT，主试验主要检测外源性凝血系统。检测、含量和活性凝血酶原时间（prothrombin，PT）正常值： PT 1114s PTA(%) 80120% INR 10.15(0.851.15) PR(凝血酶原时间比值)病人PT(s)/正常对照PT(s) PT延长至正常2倍时，PR值约增至2倍 INRPR|s| |s|国际标准化比值(international normalized ratio，INR) PR凝血酶原时间比值 |s|国际敏感指数(international sensitivity index，|s|) INR与PT成正比 华法令抗凝治疗要求 与PTA成反比 PT
8、1114s 2030s PTA 80-120% 3050s INR 0.851.15 23 血小板的功能血小板计数血小板计数 BPC 1030万/mm3称为血小板减少常见于 1.血小板生成血小板生成：见于造血功能受到损害，如再障、急性白血病、急性放射病 2.血小板破坏血小板破坏：见于原发性血小板减少性紫癜(ITP)，脾功能亢进 3.血小板消耗过多血小板消耗过多：如弥漫性血管内凝血(DIC)血小板的功能血小板粘附功能血小板粘附功能(pletlet adhensive test，PadT) 血小板所具有的能粘附于胶原纤维及其他带负电荷物质表面的特性，称为粘附功能。以粘附率表示，当一定量抗凝血液与一
9、定表面积的异物表面(如玻璃珠或玻璃瓶内壁)接触一定时间后，即有一定数量的BPC粘附于异物表面，测定其粘附前、后BPC数值之差，便于计算出粘附率。 正常值：男性 34.9 5.95% 女性 39.4 5.19%血小板黏附血小板黏附内皮内皮胶原蛋白胶原蛋白血小板黏附血小板黏附血小板的功能血小板聚集功能血小板聚集功能(pletlet aggregation test，PagT) 血小板之间相互粘着的特性称为血小板聚集 聚集诱导剂：ADP胶原、凝血酶、肾上腺素 测定：血小板聚集仪 、 用诱导剂ADP 正常值：最大聚集率为：62.7 16.1%有关纤溶亢进的检查3P试验试验：血浆鱼精蛋白副凝试验血浆鱼精
10、蛋白副凝试验(plasma protamine paracoagulation test，3P试验试验)原理原理：检测FDP的存在 抗凝血浆0.5ml1%鱼精蛋白溶液0.05ml，37水溶15min 可见纤维蛋白丝 阳性 FDP与纤维蛋白单体结合(FM) +鱼精蛋白 使FDP与FM分开 FM自行聚合（副凝） 正常：3P试验(一) 临床意义：1.DIC继发纤溶亢进期 3P(+) 阳性率68.178.9% 2.溶拴治疗后 3P 可呈阳性(+) 有关纤溶亢进的检查FDP定量定量 (fibrinogen degradation product，FDP)正常值：正常人血清中FDP含量5000ug/ml抗
11、血小板治疗（抑制血小板的粘附和聚集功能 ）阿斯匹林：阿斯匹林：抑制环化加氧酶 使TXA2，抑制血小板聚集血小板膜磷脂 阿斯匹林 花生四烯酸 () 环化加氧酶 环内过氧化物(PGG2、PGH2) TXA2合成酶 TXA2 血小板释放ADP 使环化加氧酶活化中心的丝氨酸乙酰化 促进血小板聚集 而失活，因而TXA2，抑制血小板聚集COOHOHCOOHO C CH3O水杨酸乙酰水杨酸抗血小板治疗（抑制血小板的粘附和聚集功能 ）潘生丁(persaritin，双嘧啶胺醇) 使cAMP抑制血小板聚集，抑制磷酸二酯酶增加血小板内cAMP，抑制血小板聚集ATP 腺苷酸环化酶 cAMP 磷酸二酯酶 5AMP抗血小
12、板治疗（抑制血小板的粘附和聚集功能 ）抵克力得抵克力得(ticlopidine，噻氯匹定) 抑制ADP、胶原、凝血酶等诱生剂对BPC的聚集 1.抑制胶原、ADP、凝血酶和肾上腺素等诱发的血小板聚集 2.腺苷酸化酶，使血小板内cAMP，抑制血小板聚集 SN CH2ClHClC14H14ClNSHCl 301.6剂型 250mg/1片 10片/和剂量 250mg Qg副作用： WBC BPC 胃肠道刺激抗凝血药物低分子量肝素低分子量肝素(low molecular weight heparin，LMWH) 以普通肝素为原料，通过层析、化学修饰和酶解等方法制成的普通肝素由两类分子组成： 类和 类(A
13、 、B ) 类与AT-亲和力较弱 A与AT-亲和力极强，并具有抗a活性 B与AT-亲和力极强，具有抗a活性 LMWH 含有75类，25 A，而B含量极少因此，LMWH有很强的抗a活性和AT-亲和力，而抗a活性则较低低分子肝素低分子肝素2:1 - 4:120001200024h高高无需无需抗抗 Xa:IIa 活性比值活性比值分子量分子量作用持续时间作用持续时间与内皮细胞结合能力与内皮细胞结合能力生物利用度生物利用度需需 aPTT 监测监测致出血倾向致出血倾向对血小板抑制作用对血小板抑制作用普通肝素普通肝素1:130005000045h低低需要需要Antman 1998生产制造过程肝素的来源盐的性
14、质平均分子量，分子量分布分子链末端的结构硫酸化程度抗Xa:IIa活性比值药代动力学，药效学特性临床循证低分子肝素之间的不同点 克赛克赛 Clexane 速碧林速碧林 Fraxiparine 法安明法安明 Fragmin不同低分子肝素的分子链末端结构不同不同低分子肝素的分子链末端结构不同通用名通用名Dalteparin达肝素达肝素Enoxaparin依诺肝素依诺肝素Nadroparin纳屈肝素纳屈肝素Parnaparin*ReviparinTinzaparin制造制造 工艺工艺硝酸解聚硝酸解聚肝素苯甲基酯肝素苯甲基酯碱性解聚碱性解聚硝酸解聚硝酸解聚过氧化氢和铜氧化解聚过氧化氢和铜氧化解聚硝酸解聚
15、硝酸解聚酶法解聚酶法解聚 (肝素酶肝素酶)商品名商品名Fragmin法安明法安明Clexane克赛克赛Fraxiparine速碧林速碧林Fluxum栓复欣栓复欣Clivarin诺易平诺易平LogiparinInnohep盐盐钠钠钠钠钙钙钠钠钠钠钠钠公司公司法玛西亚普强法玛西亚普强安万特安万特赛诺菲赛诺菲OpocrinKnollNovo-NordiskLeo* 来源为牛来源为牛+猪肝素；其他均为猪肝素猪肝素；其他均为猪肝素不同低分子肝素的制备：不同低分子肝素的制备：降解方法和精确的制造过程决定不同的分子量分布降解方法和精确的制造过程决定不同的分子量分布J. Fareed, J.M. Waleng
16、a, D. Hoppensteadt et al. Biochemical and Pharmacologic Inequivalence of Low Molecular Weight Heparins. Ann N.Y. Acad. Sci. 1989; 556:333-353Nadroparin速碧林速碧林Enoxaparin 克赛克赛Dalteparin法安明法安明Parnaparin栓复欣栓复欣ardeparintinzaparinCY 222certoparinHeparin (PM) 普通肝素普通肝素% 片段 7500 道尔顿% 片段介于2500 & 7500道尔顿之间% 片段
17、2500道尔顿低分子肝素的分子量分布不同R.J. Linhardt, D. Loganathan, A. Al-Hakim et al Oligosaccharide mapping of Low Molecular Weight Heparins: Structure and activity differences. J. Med. Chem; 1990; 33; 1639-1645 产品产品(通用名，商品名通用名，商品名) 平均分子量平均分子量 （道尔顿）（道尔顿）梯度法梯度法Ardeparin 阿地肝素阿地肝素6460Dalteparin 达肝素达肝素 法安明法安明6100Enoxap
18、arin 依诺肝素依诺肝素 克赛克赛4170Nadroparin 那屈肝素那屈肝素 速碧林速碧林4470Parnaparin 帕肝素帕肝素 栓复欣栓复欣6610Tinzaparin 亭扎肝素亭扎肝素6100低分子肝素的平均分子量不同低分子量肝素低分子量肝素 (LMWH) Anti-Xa Anti-IIa 比率比率 (IU/mg 干质干质) (IU/mg 干质) Enoxaparin1 依诺肝素依诺肝素 (克赛克赛) 102.8 24.9 4.1 Nadroparin1 那屈肝素那屈肝素 (速碧林速碧林) 103.6 29.9 3.5 Reviparin2 瑞肝素瑞肝素 127 36 3.5 D
19、alteparin1 达肝素达肝素(法安明法安明) 167.2 64.2 2.4 Certoparin1 舍托肝素舍托肝素 106.4 44.7 2.4 Tinzaparin1 亭扎肝素亭扎肝素 99.6 53.7 1.9 UFH3 肝素肝素 193 193 1.0 1. European Pharmacopeia Commission (March 1994) 2. Knoll Pharma3. Hirsh J, et al. Chest 1998;114:489S-510S4. Bergqvist D, et al. Br J Surg 1995;82:496-501Anti-Xa act
20、ivity was measured using an amidolytic assay (chromogenic substrate S-2222). Anti-IIa activity was measured using activated partial thromboplastin time4LMWH, low-molecular-weight heparinUFH, unfractionated heparin低分子肝素治疗不稳定性心绞痛和非低分子肝素治疗不稳定性心绞痛和非Q波心梗波心梗 研究名称研究名称低分子肝素低分子肝素vs.vs.对照组对照组 结果结果 FRISC法安明 vs
21、.安慰剂+/- FRISC - II法安明 vs.安慰剂 / 介入 vs. 非介入 - FRIC法安明 vs. 普通肝素+/-TIMI - 11A克赛 (1.0mg vs. 1.25mg/kg) 剂量范围研究 FRAXIS速避凝 vs. 普通肝素 - ESSENCE克赛 vs. 普通肝素+ TIMI - 11B 克赛 vs. 普通肝素+FRAXIS 0246810121416182004812169014天速避凝天速避凝6天速避凝天速避凝天天普通肝素普通肝素FRAXIS (速避凝 Nadroparin)结果主要临床终点(心因死亡，心梗，再发心绞痛) 在6天和14天时，三个治疗组之间没有显著差异
22、但是速避凝14天治疗组在第3个月时，明显较差延长至14天的速避凝治疗，非但没有取得附加的临床收益，而且增加病人出血的危险试验设计ESSENCEMI, myocardial infarctionASA, acetylsalicylic acid UFH, unfractionated heparinIV, intravenousCohen M, et al. N Engl J Med 1997;337:447-52Goodman SG, et al. J Am Coll Cardiol 2000 (in press)14天, 30天的事件累计：死亡，心梗或复发心绞痛 ESSENCECohen M
23、, et al. N Engl J Med 1997;337:447-52结 论 ESSENCE 克赛明显减少不稳定性心绞痛和非Q波心肌梗塞患者14-天时三重终点事件 (死亡, 心肌梗塞, 复发性心绞痛) 发生率, 并持续下降到第30天 这种优越性是在没有增加严重出血事件发生率的前提下取得的, 但轻微出血事件发生率增加了，主要是由于注射部位淤斑造成的Cohen M, et al. N Engl J Med 1997;337:447-52普通肝素普通肝素克赛克赛治疗药物治疗药物事件累积发生率事件累积发生率 (%)02468101214月月0510152025303540P=0.022ESSENC
24、E - 1 年随访P=0.0161 年时的心脏事件的累计: 死亡, 心梗, 再发心绞痛克赛 的治疗优势在 1 年时依然存在ESSENCE - 1 年随访TIMI - 11B发生第一次事件的时间 (三重终点): 急性期克赛组48小时事件发生率明显下降普通肝素普通肝素克赛克赛7.3%5.5%相对风险降低：相对风险降低： 23.8%P=0.029Triple endpoint, death/myocardial infarction/urgent revascularization UFH, unfractionated heparinAntman EM, et al. Circulation 19
25、99;100:1593-1601TIMI - 11B死亡，心梗或急诊血运重建TIMI - 11B主要临床终点: 43天死亡，心梗或急诊血运重建02468101214161820048121620242832364043TIMI - 11B结论：急性期急性期 克赛在急性期治疗不稳定性心绞痛和非Q波心梗，减少死亡和严重心脏缺血事件方面，明显优于普通肝素 具有这样的优越性的同时，克赛并不增加严重出血 TIMI 11B研究的结果肯定了克赛治疗不稳定性心绞痛和非Q波心肌梗塞患者的优越性 与克赛初始的临床优势一直维持到第43天，可是并未观察到慢性期治疗有关的心脏事件的进一步降低 慢性期治疗中，克赛组的主要
26、出血（病人自发的和与治疗有关的）较安慰剂组有增加，但总数值仍然很低TIMI - 11B结论：慢性期低分子肝素低分子肝素 - 克赛克赛口服口服GP IIbIIIa直接抗凝血酶药物直接抗凝血酶药物普通肝素普通肝素静脉静脉 GP IIbIIIa阿司匹林阿司匹林克赛克赛 - 治疗急性冠状动脉综合征的新标准治疗急性冠状动脉综合征的新标准噻氯吡啶噻氯吡啶氯吡格雷氯吡格雷理想的联合治疗理想的联合治疗Beta 阻滞剂阻滞剂华法令(Warfarin)1.维生素K依赖性凝血因子 2.抗凝机制羧机化 糖 羧机化合成中的蛋白质 前凝血酶 凝血酶原 （糖蛋白） 依赖VitK羧机化 （） （检体蛋白质） () 无凝血活性
27、 华法令华法令(Warfarin)华法令与VitK结构相似，与VitK竞争羧机化酶而妨碍VitK的利用如华法令用量过大，发生出血，即应停药，并用大量VitK对抗之CH2COCH3OHOO华法令OOCH3NaHSO3维生素K3溶栓药物原理：原理： 促进纤溶，主要使PLgPL，溶解纤维蛋白，从而溶解血栓。溶栓药物（一） 第一代第一代 以以UK，SK为代表为代表1.尿激酶尿激酶（urokinase，UK）从尿中分离提取，或从培养人胚肾细胞提取出来的，无抗原性。2.链激酶链激酶（streptokinase，SK）从链球菌体中分离提取，有抗原性溶栓药物（二）第二代 以t-PA，rt-PA为代表，其溶拴作
28、用优于UK、SK，副作用也较小。 1.组织型纤溶酶原激活物（tissue type plasminogen activator， t-PA） 2.重组组织型纤溶酶原激活物（recombinant tissue type plasminogen activator， rt-PA）溶栓药物（三）第三代 导向性溶拴药1.抗体导向溶拴剂 抗纤维蛋白单抗(59D8)与溶拴剂(t-PA，UK)连接 此单抗将携带溶拴剂特异地结合到血栓中的纤维蛋白上，血栓部位溶拴剂高度集中，促使溶栓速度加快。 如 UK-59D8 比单纯UK增加100倍 t-PA- 59D8 比单纯t-PA高20倍 特异性单抗如导弹弹头，将溶拴剂导向血栓，提高溶栓药物的特异性克服出血的副作用。2.导向溶栓双抗体的应用 t-PA单抗(TCL8) 纤维蛋白单抗(59D8)