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1、-温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响-第 4 页温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响（间接碘量法）（effects of temperature pH activitor and inhibitor to activity of enzyme）一、目的1.了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响二、原理酶活性大小可以用反应速度来表示，即在单位时间内，酶所催化底物的消耗量或产物的生成量来衡量。酶活性大，反应速度就快。反之则慢。酶促反应速度受多种因素的影响。如温度、pH、激活剂、抑制剂等。本实验是观察在不同温度，pH，以及缺乏激活剂或有抑制剂的条件下唾液淀粉酶的活性大小。借以验证各种
2、因素对酶活性的影响。唾液中含有唾液淀粉酶，此酶可以使淀粉逐步水解，最后生成麦芽糖。麦芽糖具有还原性。根据淀粉被唾液淀粉酶水解后产物的生成量（即还原性麦芽糖的多少）判定酶活性的大小。用碘的反滴定法测定还原物的量，还原物多，酶活性大。具体反应如下：1、试剂成分（S、H、S试剂）：CuSO4、Na2CO3、NaHCO3、KI、KIO3、酒石酸钾钠、草酸钾。2、判定酶活性大小的化学反应过程：Na2CO3 2H2O 2NaOH H2CO3CuSO4 2NaOH Cu(OH)2 Na2SO45KI KIO3 3H2SO4 3I23K2SO4 3H2O 酶淀粉 麦芽糖 麦芽糖Cu+ 麦芽糖氧化产物Cu+Cu
3、+ I2 Cu+ 2I- COO- 草酸钾 COO-Cu+| | Cu COO- 防止逆反应 COO-剩余I2 Na2S2O3 2I- Na2S4O6（与淀粉呈兰色 ) （与淀粉无色 ) 3、判定酶活性大小的标志酶活性大 麦芽糖多 Cu+ 生成量多 I2 消耗量多 剩余I2少 Na2S2O3 消耗量少酶活性越大，Na2S2O3 消耗量越少。空白实验无酶活性，因此Na2S2O3 消耗量最多。与空白实验进行对比，差值越大，说明此条件下酶活性越大。 三、实验用品：（一）器材16支。2.试管架1个。3.恒温水浴箱1台。4.温度计1支。5.50ml量筒1个。6.吸管：0.5ml 1支，1ml 2支，2m
4、l 1支 ，5ml 1支，10ml 1支。7. 25ml、100ml烧杯各1个。8.电炉子一个。（二）试剂% 淀粉溶液2.1N NaCl溶液：称取，溶于1000ml水中。3.磷酸盐缓冲液甲液：称取Na2HPO412H2O 23.9g溶于1000ml水中，既为M/15 Na2HPO4溶液，此溶液pH为8.5。乙液：称取KH2PO4，既为M/15 KH2PO4溶液，此溶液pH为4.5。，乙液62.5ml，两液混匀后既为pH 6.6磷酸盐缓冲液。4% HgCl2。5.1N H2SO4溶液 ：取水约250ml，加入浓H2SO4 28ml，稀释至1000ml。（S、H、S试剂）溶液A：结晶硫酸铜（CuS
5、O4.5H2O）g溶于100ml水中。溶液B：酒石酸钾钠12g，无水碳酸钠20g，碳酸氢钠25g溶于500ml水中。溶液C：碘化钾10g，碘酸钾0.8g，草酸钾18g溶于300ml水中。将溶液B倒入溶液A中混匀，再倒入溶液C混匀后定容至1000ml。7.标准0.005N Na2S2O3溶液：取硫代硫酸钠（Na2S2O3.5H2O）25g溶于1000ml水中。此溶液浓度约为0.1N ，其准确浓度须用碘酸钾标准方法标定。（方法略）取已调整至0.1N 标准Na2S2O3溶液50ml稀释至1000ml即为0.005N。四、实验步骤：1、制备稀释唾液：收集唾液于小烧杯内，吸取下层唾液0.5ml（要求无气
6、泡）加入量筒内，用蒸馏水稀释至25ml，混匀备用。2、取中试管8支，标号07，0号为空白对照，1-3号为测定温度对酶活性的影响，4-5号为pH对酶活性的影响，6-7号为激活剂和抑制剂对酶活性的影响 按下表操作。加入试剂及唾液后各管充分混匀。影响因素 管号 淀粉 NaCl 缓冲溶液 H2O 温度 稀释 温度 （ml） （ml） pH ml ml 时间 唾液 时间空白 0 4.0 6.6 37 10 - 3720温度的 1 4.0 6.6 2.5 37 10 0.5 3720 影响 2 6.6 2.5 10 10 0.5 10 20 3 6.6 2.5 80 10 0.5 8020pH值的 4 4
7、.0 2.0 4.5 2.0 2.5 37 10 0.5 3720影响 5 4.0 2.0 8.5 2.0 2.5 37 10 3720激活剂 6 4.0 6 .6 4.5 37 10 3720抑制剂 7 4.0 HgCL2 6 .6 2.5 37 10 3720的影响 （2ml）3、充分混匀后开始保温，保温后立即由各管吸取2ml分别加入已预先加入2ml S、H、S试剂相应号码的试管中，并充分混匀。4、各管放入沸水中加热8分钟。5、向各管加入1N H2SO4 2ml，轻轻摇动至不产生气泡为止。6、以0.005N Na2S2O3滴定各管，至蓝色消退为止。并记录结果。7、由零号试管消耗Na2S2O3 ml数分别减去其余各管所消耗ml数，以此结果判定各种因素对酶活性的影响。五、实验结果与分析（略）管号01234567消耗ml数差值-思考题：1.本实验判定酶活性大小的化学反应过程是什么？为什么酶的活性越大，消耗Na2S2O3越少？2SO4 的作用是什么？3.根据实验结果分析温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响。 生物技术实验教学中心