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1、一、一、 基本工具基本工具二、二、 操作程序操作程序三、三、 应用应用四、四、 蛋白质工程蛋白质工程专题一专题一 基因工程基因工程专题一专题一 基因工程基因工程基因工程基因工程基因基因拼接拼接技术技术DNA重组重组技术技术=基因工程含义基因工程含义:(1)按照人们意愿按照人们意愿, _改造生物遗传特性的技术改造生物遗传特性的技术(2)在在_水平进行操作水平进行操作(3)是在是在_进行的人为进行的人为基因重组基因重组(4)一旦成功一旦成功,便可便可_(5)主要技术为主要技术为体外体外_和和_定向定向DNA分子分子体外体外遗传遗传转基因技术转基因技术DNADNA重组技术重组技术一、工具：一、工具：
2、“分子手术刀分子手术刀 / 剪刀剪刀”：_“分子缝合针分子缝合针 / 针线针线”：_ “分子运输车分子运输车 / 运载体运载体”： _ _ 限制性核酸内切酶DNA连接酶 质质 粒粒噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物动植物病毒动植物病毒二、分子手术刀二、分子手术刀 限制限制性内切性内切酶酶1 1。特点：。特点：2 2。结果：。结果：识别识别_, _特定序列特定序列 特定切点特定切点断开断开_键键磷酸二酯磷酸二酯G GA AA AT TT TC CG GA AA AT TT TC CG GA A限制酶限制酶G GA AA AT TT TC CG GA AA AT TT TC CG GA AA AT TT
3、 TC CG GA AA AT TT TC CG GA AA AT TT TC CG GA AA AT TT TC C黏性末端黏性末端平末端平末端3.3.限制酶作用后产生的末端限制酶作用后产生的末端:_:_和和_黏性末端黏性末端C CC CC CG GG GG GC CC CC CG GG GG GC CC CC CG GG GG GG GG GG GC CC CC C平末端平末端 4 4。来源：。来源：_生物原核原核限制酶存在于原核生物中的作用是什么限制酶存在于原核生物中的作用是什么? ?思考思考原核生物容易受到原核生物容易受到外源外源DNA的入侵的入侵限制酶的作用限制酶的作用:切割切割外源
4、外源DNA,使之失效使之失效 保证自身的安全保证自身的安全限制酶为什么不会剪切原核生物本身的限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA?DNA?思考思考防御机制防御机制1.同一原核细胞内有限制酶同一原核细胞内有限制酶,但但没切割序列没切割序列2.有有酶酶且有且有切割序列切割序列, 但但甲基化酶甲基化酶 的作用下的作用下 把甲基转移到碱基上把甲基转移到碱基上, 让限制酶让限制酶不能切割不能切割三三 分子缝合针分子缝合针DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶 种类种类来源来源作用作用E.coliDNAE.coliDNA连接酶连接酶T T4 4连接酶连接酶大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体只能连接
5、只能连接黏性末端黏性末端连接连接黏性末端、平末端黏性末端、平末端DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶区别？聚合酶区别？相同点相同点作用位点作用位点都在磷酸二酯键都在磷酸二酯键思考思考不同点：聚合酶：单个与片段之间 （单个核苷酸与核苷酸片段）连接酶：片段与片段之间 （核苷酸片段与核苷酸片段）聚合酶聚合酶连接酶连接酶连接酶连接酶聚合酶：用于DNA的复制连接酶：用于拼接DNA双链连接酶连接酶三三 分子缝合针分子缝合针 DNA连接酶连接酶将_DNA片段的两个缺口上同时连接双链双链_酶、_酶、_酶的作用位点都在_键注意注意限制限制DNADNA连接连接DNADNA聚合聚合磷酸二酯磷酸二酯四四 分
6、子运输车分子运输车基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体1. 1.常用载体常用载体: _: _质粒质粒, , 噬菌体衍生物噬菌体衍生物 , , 动植物病素动植物病素基因工程使用的质粒一定要经过人工改造基因工程使用的质粒一定要经过人工改造! !(1)(1)能在细胞内进行能在细胞内进行_(2)(2)有有_切割位点切割位点, , 便于便于目的基因目的基因插入插入(3)(3)具有具有_基因基因, , 供重组供重组DNADNA和筛选和筛选(4)(4)必须是安全的必须是安全的(5)(5)载体大小适合载体大小适合自我复制自我复制限制酶限制酶标记标记拓展拓展2.2.载体的必备条件载体的必备条件: :思考
7、思考基因工程基因工程 之之 第第2节节 基基 本本 操操 作作 程程 序序基因工程的基因工程的步骤：步骤：获取获取目的基因目的基因获取获取运载体运载体构建构建 运载体运载体导入导入(受体细胞受体细胞)基因基因复制复制基因基因表达表达用限制酶用限制酶核心核心步骤二步骤二步骤三步骤三步骤四步骤四步骤一步骤一步骤一步骤一 获取获取目的基因目的基因一一. . 获取获取目的基因目的基因的的工具工具: : 获取获取目的基因目的基因提取提取运载体运载体二二. .获取获取目的基因目的基因 的的 方法方法: :(1)(1)从从基因文库基因文库中获取中获取(2)(2)用用PCR PCR 技术技术扩增目的基因扩增目
8、的基因(3)(3)人工人工合成法合成法用限制酶用限制酶步骤二步骤二步骤三步骤三步骤四步骤四步骤二步骤二 构建构建表达载体表达载体 运载体运载体必须经必须经人工改造人工改造1. 1.表达载体表达载体=_+_+_+_=_+_+_+_基因工程的核心基因工程的核心启动子启动子 终止子终止子 标记基因标记基因2.2.目的目的: :目的基因目的基因在受体细胞内在受体细胞内, ,能能遗传遗传稳定存在稳定存在表达表达及及发挥作用发挥作用把目的基因导入受体细胞，而不构建表达载体。行吗？把目的基因导入受体细胞，而不构建表达载体。行吗？目的基因目的基因启动子启动子: :位于基因的位于基因的_, _, _酶的酶的 结
9、合部位结合部位, ,驱动基因转录驱动基因转录 mRNAmRNA终止子终止子: :位于基因的位于基因的_,_,终止终止_标记基因标记基因: :_是否有目的基因是否有目的基因首端首端RNARNA聚合聚合尾端尾端转录转录监定监定步骤步骤三三步骤步骤四四步骤步骤一一目的基因目的基因同一种限制酶同一种限制酶T4 DNA连接酶连接酶15C步骤三步骤三 导入导入受体细胞受体细胞(1)农杆菌转化法农杆菌转化法(2) 基因枪法基因枪法(3) 花粉管通道法花粉管通道法 显微注射技术显微注射技术 感受态细胞法感受态细胞法受体细胞不同受体细胞不同导入方法导入方法不同不同植物植物动物动物微生物微生物步骤二步骤二步骤四步
10、骤四步骤一步骤一检检测测步步骤骤步骤四步骤四 目的基因的目的基因的检测检测与与鉴定鉴定步骤二步骤二步骤三步骤三步骤一步骤一DNADNA杂交杂交一一 是否插入了目的基因是否插入了目的基因二二 是否转录了是否转录了mRNAmRNA三三 是否翻译成蛋白质是否翻译成蛋白质mRNA-DNAmRNA-DNA杂交杂交抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交一一 分子分子水平检测水平检测二二 个体个体水平检测水平检测动植物基因工程的成果动植物基因工程的成果外源基因类型及举例外源基因类型及举例 成果举例成果举例植植物物基基因因工工程程成成果果抗虫抗虫转基因植物转基因植物抗虫基因抗虫基因: :BtBt蛋白基蛋白基因因, ,
11、 蛋白酶抑制基因蛋白酶抑制基因, , 淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因抗虫棉抗虫棉, ,抗抗虫水稻虫水稻, ,抗抗虫玉米虫玉米抗病抗病转基因植物转基因植物抗逆抗逆转基因植物转基因植物改良品质的转基因植物改良品质的转基因植物动动物物基基因因工工程程成成果果提高生物速度提高生物速度的转基因动物的转基因动物改善畜产品品质改善畜产品品质的转基因动物的转基因动物生产药物生产药物的转基因动物的转基因动物作器官移植供体作器官移植供体的转基因动物的转基因动物第第3 3节节 第第3 3节节 蛋白质蛋白质基因治疗的方法基因治疗的方法基因置换基因置换基因修复基因修复基因增补基因增补基因失活基因失活体外基因治疗体外基
12、因治疗获取某种细胞获取某种细胞 体外体外培养培养体外体外基因转移基因转移 筛选细胞筛选细胞 (体外体外)扩增扩增 导入患者体内导入患者体内半乳糖血症半乳糖血症第节第节 蛋白质工程的掘起蛋白质工程的掘起蛋白质工程蛋白质工程 目的目的 与与 实质：实质：定向定向改造改造制造新型制造新型生产自然界没有的蛋白质生产自然界没有的蛋白质对比对比基因工程基因工程的实质的实质2、蛋白质工程的原理、蛋白质工程的原理从预期的蛋白质功能出发从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白设计预期的蛋白质结构质结构推测应有的氨基酸序列推测应有的氨基酸序列找到相对找到相对应的脱氧核苷酸序列。应的脱氧核苷酸序列。基因基因DNADNA
13、氨基酸序列氨基酸序列多肽链多肽链蛋白质蛋白质三维结构三维结构预期功能预期功能生物功能生物功能mRNAmRNA转录转录翻译翻译折叠折叠DNADNA合成合成分子设计分子设计3、蛋白质工程流程图、蛋白质工程流程图因此，要对蛋白质的因此，要对蛋白质的结构结构进行设计改造，使之进行设计改造，使之符合人们符合人们对蛋白质的特定需求对蛋白质的特定需求，最终还必须通过基因来完成。，最终还必须通过基因来完成。（蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。）（蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。）依据原理依据原理预期蛋白质功能预期蛋白质功能设计设计_ _ 结构结构推测应有的推测应有的_序列序列表达基因，合成新型蛋白质
14、表达基因，合成新型蛋白质找到相应的找到相应的_序列（基因）序列（基因）标记基因标记基因常以 抗生素抗性基因 作为标记基因例：抗四环素基因，例：抗四环素基因， 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因在对四环素无抗性的大肠杆菌导入在对四环素无抗性的大肠杆菌导入抗四环素抗四环素基因基因，再置于含四环素的培养基中培养。，再置于含四环素的培养基中培养。对四环素无抗性对四环素无抗性置于四环素中置于四环素中含抗四环素基因含抗四环素基因置于四环素中置于四环素中不死不死说明：说明： 抗四环素基因能成功表达，抗四环素基因能成功表达，细菌具有抗四环素的能力细菌具有抗四环素的能力返回课返回课堂堂1 农杆菌转化法农杆菌转
15、化法导入导入植植物细胞物细胞载体载体(Ti质粒质粒)构建构建 ( ）_感染感染植物植物_ ( (目的基因目的基因转移转移到染色体的到染色体的DNA中中)组织培养组织培养、形成、形成新植株新植株转入转入（ ） 体体细胞细胞农杆菌农杆菌 的的 特特 点点易感染易感染_植物和植物和_植物植物 (不能感染不能感染_植物植物)Ti质粒质粒的的T-DNA 可转移可转移植物细胞内植物细胞内, 并整合到受体细胞的染色体并整合到受体细胞的染色体DNA双子叶双子叶祼祼子叶子叶单子叶单子叶过程过程目的基因目的基因目的基因目的基因+TiTi质粒质粒农杆菌农杆菌农杆菌农杆菌返回目录返回目录只能导入只能导入动动物的物的_
16、或或_,_,不能导入不能导入_内内2 显微注射技术显微注射技术导入导入动动物细胞物细胞返回目录返回目录解释解释高度分化的体细胞的高度分化的体细胞的_受到受到限制限制从而从而,不能表现出不能表现出细胞全能性细胞全能性细胞全能性细胞全能性卵卵细胞细胞受精卵受精卵体体细胞细胞原核生物的特点原核生物的特点: 3 3 感受态细胞法感受态细胞法导入导入微生物微生物细胞细胞返回目录返回目录感受态细胞感受态细胞用用CaCa2+2+处理原核细胞处理原核细胞已构建好的已构建好的表达载体表达载体缓冲液缓冲液 适宜温度适宜温度感受态细胞感受态细胞吸收吸收DNADNA分子分子过程过程:繁殖快繁殖快, , 多为单细胞多为
17、单细胞, ,遗传物质少遗传物质少半乳糖血症半乳糖血症半乳糖半乳糖半乳糖转移酶半乳糖转移酶半乳糖转移半乳糖转移,利用利用血液中的半乳糖下降血液中的半乳糖下降正常正常半乳糖半乳糖半乳糖转移酶半乳糖转移酶半乳糖转移半乳糖转移,利用利用血液中的半乳糖下降血液中的半乳糖下降血液中的半乳糖过高血液中的半乳糖过高肝、脑受损肝、脑受损半乳糖血症半乳糖血症返回目录返回目录乳腺生物反应器乳腺生物反应器过程过程获取目的基因获取目的基因构建构建_导入导入_早期胚胎发育早期胚胎发育胚胎移植到母体动物子宫内胚胎移植到母体动物子宫内雌性个体雌性个体 ,分泌乳汁分泌乳汁获取蛋白质获取蛋白质哺乳动物哺乳动物,受精卵受精卵不能不
18、能把一种生物的把一种生物的所有所有DNADNA直接导入受体细胞直接导入受体细胞? ?若若DNADNA没没经过经过载体的构建载体的构建, ,直接把直接把所有所有DNADNA导入受体细胞导入受体细胞( (植物植物, ,动物动物), ), 则不知道什么基因能真正进入受体内则不知道什么基因能真正进入受体内此方法此方法针对性针对性差差, ,效果差效果差! !所以一定要构建基因载体所以一定要构建基因载体! !思考思考返回课堂返回课堂高度分化的体细胞的高度分化的体细胞的_受到受到限制限制从而从而,不能表现出不能表现出细胞全能性细胞全能性 在培育转基因动物时在培育转基因动物时, , 为什么只能选用受精卵而不能用体细胞为什么只能选用受精卵而不能用体细胞? ?思考思考细胞全能性细胞全能性拾遗补漏拾遗补漏返回课堂返回课堂拾遗补漏拾遗补漏DNA复制复制PCR技术技术场所场所酶酶载体载体原则原则结果结果细胞核细胞核生物体外生物体外解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶聚合酶Taq酶酶不需要不需要不需要不需要碱基互补配对碱基互补配对碱基互补配对碱基互补配对DNA分子分子DNA分子片段分子片段Taq酶酶=热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶拾遗补漏拾遗补漏