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1、三株溶藻细菌溶藻活性代谢产物的初步研究林 敏，潘伟斌*，张太平，李 燕，何鉴尧华南理工大学环境科学与工程学院，广东 广州 摘要：已知株溶藻细菌、和的活性代谢产物具有明显的溶藻效果。为获得较高活性和浓度的目标产物，研究了培养基、碳源、氮源对溶藻效果的影响；为考察溶藻活性代谢产物保存和应用的环境条件，研究了其热、酸稳定性。在牛肉膏蛋白胨、淀粉、查氏和高氏号种培养基里，淀粉培养基最适宜用于获得溶藻活性代谢产物。以淀粉培养基为基础，碳、氮源组合依次为淀粉 ()、淀粉()，葡萄糖 时，株溶藻细菌的溶藻活性代谢产物溶藻活性最高。这一结果为目标产物的分离奠定了物质背景。株溶藻细菌溶藻活性代谢产物均具有良好的
2、热稳定性，经热处理后，对叶绿素的去除率仍高于。的无菌滤液调至值或， 后丧失溶藻活性；和的无菌滤液调至值， 后未丧失溶藻活性，调至值， 后丧失溶藻活性。上述结果为溶藻活性代谢产物的分离奠定了基础。关键词：富营养化；溶藻细菌；活性代谢产物中图分类号： 文献标识码： 文章编号：（）水体富营养化引起的藻类水华问题，带来各种危害，其防治已成为环境领域的热点和难点。溶藻细菌作为水生生态系统的一部分，其溶藻作用引起众多关注。部分溶藻细菌能够分泌胞外活性物质，对宿主藻类起抑制或杀灭作用。利用溶藻细菌分离筛选高效、专一、绿色的溶藻活性代谢产物，最终开发高效、安全的杀藻剂已成为治理藻类水华问题的新思路。目前，国内
3、对溶藻细菌的研究处于起步阶段，对于细菌溶藻活性代谢产物的研究尚属空白。本课题组从广州城区某富营养化池塘中分离筛选出株溶藻细菌，初步研究表明，这些溶藻细菌分泌的活性代谢产物具有明显的溶藻效果，且在碱性条件下溶藻能力较强，利于水华治理。为获得较高活性和浓度的目标产物，也为便于后续的活性物质的分离纯化，研究了培养基、碳源、氮源对溶藻效果的影响；为考察溶藻活性代谢产物的保存和应用的环境条件，研究了其热、酸稳定性，为下一步溶藻活性代谢产物的分离奠定了基础。 材料与方法 材料1.1.1 溶藻细菌实验用的株溶藻细菌是本课题组从广州城区某富营养化池塘筛选获得，编号分别为、和。和菌株属蜡状芽孢杆菌（ ）；菌株为
4、短小芽孢杆菌（ ）。各菌株在的登录号分别为（ ）、（ ）、（ ）。1.1.2 供试藻种选用的藻种为蓝藻中的水华鱼腥藻( )，来源于中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心。1.1.3 培养基牛肉膏蛋白胨液体培养基。牛肉膏蛋白胨固体培养基：每 牛肉膏蛋白胨液体培养基加入琼脂2.0 g。淀粉培养基：可溶性淀粉10 g， 1 g， 1 g， 1 g，() 2 g，蒸馏水1 L， 。查氏培养基。高氏号培养基。蓝藻培养基。 方法1.2.1 无菌滤液的制备接种细菌于牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基，在生化培养箱30培养 后，每个斜面用 灭菌的液体培养基洗脱菌苔，置于30 恒温振荡器中， ，振荡 。然后在 条件下，离
5、心 ，收集上清液经 微孔滤膜抽滤两次，平板涂布进行无菌检验，制成溶藻细菌无菌滤液（以下简称无菌滤液），值为。1.2.2 溶藻试验和溶藻效果的判断（）藻种培养：藻种经活化后，在() ，光照强度 ，光暗周期比 条件下培养。（）溶藻试验：取预培养 且长势良好的水华鱼腥藻以的比例加入无菌滤液中，设两个平行，置于人工气候箱中静置培养 。（）溶藻效果的判断：实验藻液中除水华鱼腥藻外，没有其他含叶绿素的植物，因此选用叶绿素（）含量的变化考察去除效果。1.2.3 溶藻细菌培养条件对溶藻效果的影响（）培养基。以牛肉膏蛋白胨液体培养基、淀粉培养基、查氏培养基和高氏号培养基等种培养基分别培养细菌，制备无菌滤液，进行
6、溶藻试验，判断溶藻效果。（）碳源。以淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖为碳源，培养细菌，进行溶藻试验，判断溶藻效果。（）氮源。以()、尿素、为氮源，培养细菌，进行溶藻试验，判断溶藻效果。1.2.4 溶藻细菌培养条件对溶藻细菌生长的影响以溶藻细菌细胞干物为生物量指标，表征细菌生长情况。取 菌液（菌液的制备见1.2.1，其培养条件见）， 离心 ，移去上清液，用 的去离子水将底下的细胞移至事先已恒质量的器皿中， 烘干 除去细胞中水分，称重。1.2.5 溶藻活性代谢产物的稳定性（）热稳定性。无菌滤液分别在50 、70 和90 中水浴 以与在高压灭菌锅中1.1 kg压力下，121 高温处理 后，进行溶藻试验，判断
7、溶藻效果。（）酸稳定性。用氢氧化钠（ ）和盐酸（）溶液分别调节无菌滤液值至或， 后，调回原值，进行溶藻试验，判断溶藻效果。 结果与讨论 溶藻细菌培养条件对溶藻效果和溶藻细菌生长的影响2.1.1 培养基图 培养基对株溶藻细菌溶藻效果和菌体生长的影响（：未处理；：牛肉膏蛋白胨培养基；：淀粉培养基；：查氏培养基；：高氏号培养基）溶藻细菌在牛肉膏蛋白胨培养基上生长情况好于其他种培养基，其无菌滤液的溶藻效果也相对较好（见图），对叶绿素的去除率都达以上。溶藻细菌在淀粉培养基这种培养基中生长情况不如其他培养基，但其无菌滤液对叶绿素的去除率依次为，和，效果好。在查氏培养基中培养，其无菌滤液溶藻效果极差，对叶绿
8、素的去除率仅有，其他两种菌效果稍好，依次为和。株溶藻细菌在高氏号培养基中培养后，对叶绿素去除率依次为，和。在种不同培养基中，对叶绿素去除率最大相差，为，为。牛肉膏蛋白胨培养基和淀粉培养基的溶藻效果较好，但前者是天然培养基，成分复杂，会给后续的溶藻代谢产物的分离纯化工作带来许多困难和不确定性，后者成分简单明确，利于后续工作的进行。2.1.2 碳源以淀粉培养基为基础，在淀粉、葡萄糖、蔗糖和乳糖种碳源中，如图所示，以蔗糖和乳糖为碳源的无菌滤液对叶绿素的去除率在之间，溶藻效果较差。图 碳源对株溶藻细菌溶藻效果和菌体生长的影响（：未处理；：淀粉；：葡萄糖；：蔗糖；：乳糖）以淀粉为碳源时，的生物量较小，约
9、只有乳糖的一半，但溶藻效果最好，对叶绿素的去除率达到。在淀粉的作用下对叶绿素的去除率达，而其他种碳源则小于。以葡萄糖为碳源时，生物量最大，约是其他种碳源的倍，溶藻效果最好，对叶绿素的去除率达。在种不同碳源中，对叶绿素去除率最大相差，为，为。和归属于蜡状芽孢杆菌，在对碳源的利用方面，相对归属于短小芽孢杆菌的而言，更相近。2.1.3 氮源图 氮源对株溶藻细菌溶藻效果和菌体生长的影响（：未处理；：（）；：；：；：尿素）以淀粉培养基为基础，、以淀粉为碳源，以葡萄糖为碳源。如图所示，在硫酸铵、硝酸钾、硝酸铵和尿素等种氮源中，的生物量以在尿素中为最大，约是在硫酸铵和硝酸钾中的倍，叶绿素的去除率为，溶藻效果
10、较好且很接近，相差只有的幅度。氮源对溶藻效果影响很小。图 株溶藻细菌经酸处理后无菌滤液溶藻效果的比较在种氮源中，叶绿素的去除率为。以硫酸铵为氮源时，生物量最小，但溶藻效果好于其他种氮源，相比以硝酸钾为氮源时，高。在种氮源中，以硝酸钾为氮源时，生物量较小，不与以尿素为氮源时的生物量的一半，但其无菌滤液的叶绿素去除率最高，达，溶藻效果最好，相比以硝酸铵为氮源时高。有机化合物尿素为氮源时，菌体生物量高于其他种无机氮源。最后，、的氮源为硫酸铵，的氮源为硝酸钾。综上所述，溶藻效果和菌体量不成正相关。适合溶藻细菌菌体生长的营养条件不一定适合溶藻活性代谢产物的产生，反之亦然。从对溶藻效果的影响程度看，对而言
11、，培养基碳源氮源；对而言，培养基碳源或氮源；对而言，培养基、碳源和氮源三者相差不大。 溶藻活性代谢产物的稳定性 热稳定性 经过热处理后，株溶藻细菌的无菌滤液对叶绿素去除率仍高于，保持较高的去除率，由此判断，溶藻细菌分泌的代谢产物具有较好的热稳定性。其中，和的规律性较明显，随温度的上升而溶藻活性加强，则相反。以70 水浴 处理的效果为最好（图），去除率达。图 株溶藻细菌在不同温度下无菌滤液溶藻效果的比较由株溶藻细菌产生的溶藻活性代谢产物的热稳定性，与其无菌滤液对考马斯亮蓝法进行显色呈阴性这些现象，推测溶藻活性代谢产物并非蛋白质类物质。.2.2 酸稳定性 从图中可见，值的改变对株溶藻细菌的溶藻效果
12、有一定的影响。的无菌滤液在值调至或， 后再调回原值，代谢产物的溶藻活性丧失，叶绿素的含量增加。将和的无菌滤液的值调至， 后再调回原值，代谢产物的溶藻活性不受影响，其去除率分别达到和。在调至 后再调回原值时，两株细菌的代谢产物的溶藻活性明显受到影响，表现为轻微的抑藻作用，的溶藻活性丧失。等人的研究也指出，将无菌滤液的值调至，进行酸处理后，溶藻活性并未丧失，但他没有研究经更低值酸处理后的情况。 结论 （）在牛肉膏蛋白胨、淀粉、查氏和高氏号种培养基中，淀粉培养基最适宜用于获得溶藻活性代谢产物，其产物溶藻活性高，对叶绿素的去除率可达，可达，可达。（）以淀粉培养基为基础，碳、氮源组合依次为淀粉 ()、淀
13、粉()，葡萄糖 时，株溶藻细菌、的溶藻活性代谢产物溶藻活性最高。（）从对溶藻效果的影响程度看，对而言，培养基碳源氮源；对而言，培养基碳源或氮源；而对，培养基、碳源和氮源三者相差不大。（）株溶藻细菌溶藻活性代谢产物均具有良好的热稳定性，经热处理后，对叶绿素的去除率仍高于；的无菌滤液调至值或， 后丧失溶藻活性；和的无菌滤液调至值， 后未丧失溶藻活性，调至值， 后丧失溶藻活性。参考文献：1 陈水勇，吴振明，俞伟波, 等. 水体富营养化的形成、危害和防治. 环境科学与技术，（）：.2 胡洪营，门玉洁，李锋民. 植物化感作用抑制藻类生长的研究进展. 生态环境，（）：.3 潘双叶. 水体中藻类的危害与控制
14、方法. 黑龙江环境通报，（）：.4 张勇，席宇，吴刚. 溶藻细菌杀藻物质的研究进展. 微生物学通报，（）：.5 , , , . . , , (): .6 杨文博. 微生物学实验. 北京：化学工业出版社，：7 裴海燕, 胡文容，曲音波, 等. 一株溶藻细菌的溶藻特性与其鉴定. 中国环境科学, , （）：.8 史玉顺，刘永定，沈银武, 等. 细菌的溶藻作用与环境因子对该作用的影响. 中国科学: 辑, , （）：.9 安鑫龙，李豫红，赵艳珍, 等. 溶藻微生物的研究方法. 水利渔业，（）：.10 裴海燕, 胡文容, 曲音波, 等. 一株溶藻细菌的分离鉴定与其溶藻特性. 环境科学学报, , （）：.11 萧能，余瑞元，袁明秀, 等. 生物化学实验原理和方法. 版. 北京: 北京大学出版社, ：.: , . , , . , . , , ( g, , , , () ， , ), , . , () , , . . , , , , , -3 , . , . , , . .