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1、原核表达详细步骤Part 选择表达的目的基因一、 基因序列1. 得到靶基因 DNA （cDNA ）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序: 利用生物信息学在 NCBI上 blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF 中找到正确的读码。实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA 上找到正确的读码。利用 mRNA 的特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA ）。2. 注意事项：区别 ORF 和 CDS ORF一般在 DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS 可以是 DNA 上的定义，也可以是 mRNA 上的定义，分为 compl
2、ete CDS和 partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS 读码是“M 、”，partial CDS的读码是相应的 AA 在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。二、 抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由 612 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。 只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的
3、，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。2、选择原则 ：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。（2）、处于结构表面 ：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的 N 端及 C 端是很好的抗原决定簇区域。3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测 ：如软件预测 DNAstar（Protean ）预测， Dnaman 。在线网站预测（http:/www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/i
4、ndex.shtmland http:/www.imtech.res.in/raghava/propred/algorithm.html）（2）选定：接近 N、C端；选取在此区间内， （Antigenic Index ）Jameson-wolf抗原决定簇选正分高处；（Hydrophilicity plot ）Kyte-Doolittle预测亲水性强的区域。同时符合以上3 点的区域较好（命名为多肽片断A）。注：如果设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白的跨膜区，即头端信号肽所在的区域（3）NCBI （BlastP ）比对：将多肽片断 A放入 blastp 进行同源性比对。如果制备某一动物种属的
5、抗体，该区必须与该动物的氨基酸序列没有较高的同源性。注：这一步往往容易漏掉，所以学会应用生物信息学，可以减少走弯路！（4）抗原合成：原核表达：名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 9 页 - - - - - - - - - 化学合成： 需要做化学偶联增强多肽稳定性。多肽的纯度越纯越好， 一般 80%就完全可以了。合成5-10 mg 就可以了。Part 选择表达系统一、 选择表达载体1、选择表达载体的原则（1）蛋白质大小：决定在胞质中表达还是以包涵体的形式表达，是
6、否加标签或以融合蛋白的形式表达。（2）蛋白需求量：根据实验方案确定蛋白需求量，选择合适的载体。（3）蛋白质是否需要保留活性：有活性的可溶性蛋白表达（胞质蛋白），无活性的不溶的蛋白（包涵体蛋白）2、原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1） 选择标志的编码序列： 用于筛选重组子，有抗生素抗性基因、 报告基因（GFP等）（2）可控转录的启动子：启动子是 DNA 链上一段能与 RNA聚合酶结合并起始 RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。启动子的强弱是对表达量有决定影响的因素之一。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌 RNA 聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此
7、原核表达载体所用的启动子必须是原核启动。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA 的合成极为重要。在转录起始点上游510 bp 处，有一段由 68 个碱基组成，富含A和 T 的区域，称为 Pribnow 盒，又名 TATA 盒或 10 区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp 组成的区域，称为 -35 区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35 区与 RNA 聚合酶 s 亚基结合， -10 区与 RNA 聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近 DNA被解旋形成单链， RNA 聚合酶使
8、第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在 RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子 ) 、Trp( 色氨酸启动子) 、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子 ) 、T7噬菌体启动子等。（3）转录终止子：在一个基因的 3¢ 末端或是一个操纵子的3¢ 末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括： RNA 聚合酶停在 DNA 模板上不再前进， RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA 从 RNA
9、 聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域， G/C富含区域又具有回文对称结构。这段终止子转录后形成的 RNA具有茎环结构，并且有与A/T 富含区对应的一串U 。转录终止的机制较为复杂， 并且结论尚不统一。 但在构建表达载体时， 为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性， 一般都在多 克隆位点的下游插入一段很强的 rrB 核糖体 RNA的转录终止子。（4）核糖体结合位点（ SD序列）：1974年 Shine 和 Dalgarno 首先发现，在 mRNA 上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子 A
10、UG 和一段位于 AUG 上游 310 bp 处的由 39 bp 组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3¢ 末端的富含嘧啶的序列互补，名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 9 页 - - - - - - - - - 是核糖体 RNA 的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称 SD序列。它与起始密码子 AUG 之间的距离是影响mRNA 转录、翻译成蛋白的重要因素之一， 某些蛋白质与 SD序列结合也
11、会影响mRNA 与核糖体的结合， 从而影响蛋白质的翻译。 另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后，才能产生一个完整的蛋白质。（5）多克隆位点（ MCS ）：选择的酶切位点在靶基因上没有相应的酶切序列，否则在构建重组子进行酶切时会把靶基因给切开。在惠赠或交换的质粒中确定MCS的正确性，否则会造成错读密码子。（6）复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低， pCoE1 ，pMBI(pUC)类的复制子（复制起始部位）的拷贝数高达 500 以上，是表达载体常用的。 通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好， 超过细胞的承受
12、范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要 2 个质粒共转化，就要考虑复制元（？）是否相容的问题。（7）融合 Tag：基因融合是将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接起来，并且正确读码。在表达靶蛋白是加上融合标签的好处，（a 保护靶蛋白免受原核宿主蛋白酶的降解； b 提供亲和纯化的配基结合位点；c 改善靶蛋白的溶解性，使其正确折叠； d 与已知酶或抗原结构域连接，可以进行标记和分离；e 与信号肽连接，可将融合蛋白分泌到特定细胞区域。）注：选择融合蛋白表达载体时， 融合标签与靶蛋白的连接处如果有酶切位点，且想除去标签，则载体的酶切序列在靶蛋白中不能出现。二、 选择表达宿主首先要看靶基因中有没有细菌不常
13、用的密码子如果有，需要考虑换表达菌株。每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。 不同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7 RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。 采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。以Novagen为例，如果使用BL21(DE3)表达不成功的话可以换Rosetta 系列菌株，它能够由一种氯霉素抗性的、与 pET 相容的质粒提供 AUA ，AGG ，AGA ，CUA ，CCC 和 GGA 的 tRNA 。所以这类菌株
14、能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。有时不明原因的表达蛋白截短（比预期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密码子造成的。另外一种可能是不严谨的本底表达产物抑制。 1. 原核表达系统（大肠杆菌）优点：遗传图谱明确容易培养且费用低对许多外源蛋白耐受能力强能高水平表达这些蛋白缺点：蛋白质不能进行翻译后修饰（在真核高尔基复合体中的糖基化修饰，特点位点的切割等产生具有活性的蛋白）具有密码子的偏好（？）2. 真核表达系统优点：可以产生修饰的蛋白缺点：真核表达系统复杂费用高注：不同的表达宿主有相应的表达载体，二者应是最佳表达组合。Part 构建重组子一、 重组子的构建1. 设计引物： a 保证
15、引物序列扩出的靶基因插入到表达载体MCS 上，能够正确名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 9 页 - - - - - - - - - 读码； b 引物两端加入酶切位点；c 遵循引物设计原则（一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件）。2. 扩增靶基因：（1）通过 PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所
16、需基因片段。（2）通过 RT-PCR 方法：用 TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以 mRNA 为模板，逆转录形成 cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。注：但在 PCR 过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。尤其注意不要引入终止密码子。3. 限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因：（1）载体双酶切后回收：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。（减少假阳性的重组质粒连接，去除切下的小片段多克隆位点）（2）PCR产物双酶切后回
17、收：限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。一般先用 PCR 扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。注：双酶切后，进行回收纯化，可以提高阳性克隆的几率。4. 连接目的基因和载体二、 重组子的验证1. 将连接产物转化到相应的宿主菌（感受肽的制备，转化）2. 鉴定带有重组质粒克隆：常用方法的有- 互补、小规模制备质粒DNA 进行酶切分析、PCR以及杂交筛选。 如果亚克隆成功， 阳性菌落数远大于阴性菌落 （甚至全部为重组子）。3. 筛选出含重组子的转化菌落，DNA 序列测定。（正确测序）测序结果出来后， 首先，看看载体的多克隆位点和片断插入的序列，
18、是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号，读码是否正确， 这是最有说服力的鉴定结果。有时载体几经多个实验人员的周转，反复插入片断， 或者是粘端相同的不同酶切片断之间的连接，会意外在启动子后面带入终止位点，特别是用到XbaI 之类的酶要小心。然后要对测序结果进行确定， 确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。注：长期保存的重组子在高浓度甘油（19）中会导致质粒不稳定，即脱质粒。可以将载体和宿主分别保存。Part 诱导表达一、 诱导表达1. 诱导表达类型组成型表达： 表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本
19、低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。诱导调控型表达： 表达载体采用诱导型启动子， 只有在诱导剂存在的条件下才能名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 9 页 - - - - - - - - - 表达目的产物。 这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。 另外也有启动子是组成型的， 但是启动子所依赖的转录酶是诱导
20、表达的，也属于诱导表达系统。融合表达 ：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分 N端或者 C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如 GST ）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小 Tag 以减少对目的蛋白的影响。His-Tag 是最广泛采用的Tag。分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体， 而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。可溶性表达： 大肠杆菌表达效率很高， 特
21、别是强启动子， 目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包涵体容易纯化但是复性效率不高（非常股复杂）。分泌表达可以得到可溶的产物， 也有部分融合 Tag有助于提高产物的可溶性， 比如Thio ，pMAL 系统。2. 诱导表达（1）挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB （含 Amp50 g/ml ）中 37过夜培养。（2）按 150 比例稀释过夜菌， 一般将 1ml 菌加入到含 50mlLB培养基的培养瓶中, 37 震荡培养至 OD600 0.4 -1.0 （最好 0.6 ，大约需 3h。（3）取部分液体作为未诱导的对照组, 余下的加入 100mMIPTG 至终浓度为 0.4mM（T7启动子
22、）或 1 mM （T7lac 启动子），作为实验组 , 两组继续37震荡培养 3h。（4）分别取菌体 1ml, 离心 12000g30s 收获沉淀，用 PBS重悬、洗涤、离心。（5）对细菌沉淀进行处理，做SDS-PAGE 等分析。3. 注意事项：（1）关于表达不出来的原因有很多a 如果测序都是正确的话，设计一个postive expression control ，验证整个表达系统没问题。b 检测是否有毒性。涂一个IPTG的板子看菌落生长情况如何。c 看看稀有密码子情况，是不是存在成簇的N端的稀有密码子。d 看看稳定性，上swiss prot看看在大肠杆菌中的稳定时间是多少。e 如果表达的是真
23、核蛋白，可能问题更复杂，可能涉及到伴侣蛋白等问题？f 有人会检测 mRNA 的稳定性。g 可以用亲和层析等办法富集你的目的蛋白，然后再跑胶。因为有时你的目的蛋白表达丰度过低， SDS-PAGE 检测不到。（1）提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。（2）IPTG ：IPTG浓度 0.2-0.5mM IPTG 足够了，不会降低表达量，反而会增加蛋白的可溶性。 IPTG浓度过高，易使蛋白表达速度增大，来不及正确折叠而产生不溶性蛋白（包涵体）。 T7lac 启动子是严谨启动子， IPTG诱导时可以优化最佳浓度（ 25uM-1mM 之间
24、）使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。（3）温度：一般 37诱导 3-4 小时，30诱导 6 小时是蛋白表达的最大产量期。22、18、16等低温诱导时间在12h-48h。低温诱导可使蛋白缓慢合成，利名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 9 页 - - - - - - - - - 于蛋白正确折叠形成可溶性蛋白。为了得到更多的可溶性蛋白， 可以考虑将温度再降（但表达总量会有所降低），可以考虑25，诱导 8-10 个小时； 20诱导14-18 个小时；甚至 1524-3
25、6 小时诱导。二、 检测诱导表达1. 细菌的裂解裂常用方法有：高温珠磨法；高压匀浆；超声破碎法；酶溶法；化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法、已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法结合使用的实验步骤。（1）常用的溶解酶有溶菌酶；-1,3 - 葡聚糖酶； -1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶； 糖昔酶等。 溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。4 ， 5000rpm 离心， 15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（30 mL ）。弃上清， 1mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀， 30作用 1h。（2）超声破碎细菌， 40w,1
26、0s,10s,50 次；12000rpm ,4 离心， 15min ，分别收集上清液和沉淀。分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2 凝胶电泳加样缓冲液，待检测。注意事项：超声破碎与声频、 声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。2进行 SDS PAGE 检测（1）表达结果：a 细胞质中表达； b 包涵体形式表达。（2）包涵体的纯化a 包涵体的洗涤； b 包涵体的溶解； c 包涵体的检测从基因角度改造一下， 如果能够去掉一些疏水区段会很大程度上改善蛋白的可溶性（4）注意事项a 所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性；
27、b 根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。具体的序列和说明都可以从 中下载。c 包涵体蛋白溶液保存在四度里，避免反复冻融，否则体系不稳定，蛋白以沉淀析出；胞质蛋白不能在四度放置很久，因为上清中含有很多蛋白酶，会把靶蛋白降解掉。1. 了解实验课题对目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大， 表达目的（是蛋白结晶、 药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达； 另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化，纯化标签有多大， 蛋白纯化后是否需要将标签去
28、除（即标签的存在是否会影响蛋白的活性）。还要对目的蛋白进行稀有密码子 （仅限于真核生物基因通过原核表达系统表达时参考，注意稀有密码子的多少，位置5 位或 3 位，稀有密码子是否成串出现等）和可溶性网上预测等。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 9 页 - - - - - - - - - 稀有密码子预测网址：http:/molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.htmlhttp:/www.faculty.ucr.edu/mmaduro/c
29、odonusage/usage.htmhttp:/nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/http:/www.doe-mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html原核表达蛋白可溶性预测网址：http:/www.biotech.ou.edu/综合以上，选取合适的表达载体及宿主菌。注意：不是所有的标签都是用来纯化蛋白的，有的标签有促进蛋白溶解的作用，有的则是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。一般我们最常用的是胞内诱导型表达（即蛋白翻译后是存在于细胞内，通过加诱导物的方法来控制表达水平）。2. 搜索要表达的目的基因的序列，根据其编码区序列来设计引物；注意：要注意在
30、引物上加入限制性内切酶识别位点（首先应分析蛋白编码区内是否含有相同的内切酶识别位点），并通过查阅资料看两种酶 （上下游引物分别加入酶切位点）是否可以在同一反应体系中起作用，并注意标签序列是在N 端还是在 C 端，若要在 C 端保留标签，则需要将下游引物的终止密码子替换掉；若要在引物上引入标签序列， 则引物上应加入标签序列碱基 （即在上游引物或下游引物处引入 His 的密码子）；另外，还要注意引物不能造成蛋白的编码框发生改变；1，2 步的分析至关重要，只有在完成前两步的工作后才可以进行后续的实验操作。3. 摇菌，进行 RNA 抽提（注意选取不同表现型的菌株），摇菌的时间一定不要太长，太长的话RN
31、A 活性不高；4. mRNA 反转成 cDNA （此步应在第三步完成后立即操作，RNA 存放时间长易降解）；5. 以 cDNA 为模板，利于设计好的引物进行PCR 扩增；6. 通过胶回收试剂盒回收目的DNA 片段。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 9 页 - - - - - - - - - 真核基因组DNA 的克隆cDNA 的克隆化技术的成熟，很多染色体的mRNA 互补的序列已弄清楚，为丰富人体遗传信息库做出了贡献。除此以外， 真核细胞染色体DNA 消化后的
32、片段， 合适的载体进行克隆，也是得到目的基因的重要方法。染色体 DNA 序列大部分含有插入序列，即内含子（intron) 内含子的数量不等。而cDNA 则仅代表了外显子(exon）的序列。大肠杆菌等原核细胞不能识别真核细胞染色体DNA 的内含子，因此其表达研究，仅可应用cDNA ，而不能应用真核基因组带有内含子的DNA ，基因治疗中的目的基因，既可选择。 DNA ，也可选择染色体DNA 。一、染色体DNA 克隆的载体构建染色体DNA 文库并进行克隆的载体有两大类：入噬菌体载体和粘粒载体。质粒载体其容量有限，而染色体DNA 由于带有内含子序列而较长；单链丝状噬菌体载体仅用于克隆单链 DNA, 因
33、此质粒载体和单链丝状噬菌体载体都不适用干染色体DNA 的克隆。由于粘粒可接纳近45kb 的外源 DNA ，几乎是入噬菌体载体载量的2 倍，因此， 在一个哺乳动物基因组DNA 文库中，仅需350000 个重组枯粒，则可望某一特定的单拷贝序列存在于其中的概率达99。然而，在粘粒中构建和贮存文库要比在入噬菌体中更困难得多，因而只有当靶基因过大，而不能为单个入噬菌体所包容，或者要分离一系列跨过染色体DNA 特大区段的重叠克隆时，才采用粘粒。染色体DNA 克隆最为常用的载体还是入噬菌体载体。以入噬菌体为基础构建的载体尽管已是分离众多真核cDNA 及基因组DNA 的有力 工具 ，但它们也只能接纳大小在一定
34、范围内的插入片段。许多基因由于过于庞大，而不能作为单一片段克隆于这些载体之中，如人凝血因子讯基因长达180kb，肌营养不良基因至少长1800kb，因此需要建立容量更大的克隆载体。酵母人工染色体（YAC ）方法的建立，使克隆DNA 大区段的工作至少有了可循之经。使用YAC 载体进行克隆时， 基因组 DNA 须在剪切力较小的条件下从实验组织中小心制备，以便得到平均数百万碱基对大小的片段。随后应用一限制酶（如EcoRD 部分消化DNA ，以产生平均大小为20。 一 500kb 的大片段 这些片段再连接到经过适当处理以防止自身环化的YAC载体两臂上。除EooRI 以外，也可用Notl 和 Mlul 一
35、类切点稀少的限制酶进行完全消化。二、从哺乳动物细胞中分离高分子量 DNA 哺乳功物 DNA 的分离通常是在有EDTA 和 SDS 一类的去污剂存在！ 、一 l!l 蛋白酶 K，消化细胞， 随后用酚抽提而实现的。低分子量的杂质以透析法加以去除。这一方法获得的DNA ，其大小为100 一 150kb适用于以入噬菌体载体构建基因组DNA 文库。然而，若要用粘粒建立基因组DNA 文库，则要求用更大的DNA 。从哺乳动物细胞中分离高分子量的DNA 有如下三种办法。1单层贴壁生长或悬浮生长的细胞，组织标本及血液标本中的细胞，利用蛋白酶K,SDS 和酚等，可分离纯化1。 。一 1sokb大小的 DN 段，适
36、用于入噬菌体载体构建DNA 文库。2将细胞、组织碎片或血液细胞标本，以蛋白酶K 进行消化，应用高浓度甲酞胺使DNA从 DNA 一蛋白质复合物中解离，再通过火棉胶袋透析，去除残存的蛋白酶K，因而省去酚等有机溶剂抽提等步骤。由于DNA 未经机械振摇，不通过移液管的操作和酒精沉淀，故其分子量特别大，缺点是收获率小，DNA 浓度低。3以盐酸服裂解细胞，所生成的DNA 较短（约SOkb.)，但此法简便快速，并可用来同时处理不同的细胞或组织中抽提DNA, 这一方法制备的DNA 尽管不应用于构建基因组DNA 文库，但用于Southem 杂交则效果极佳。三、染色体DNA 文库的建立不论 DNA 的碱基组成及序
37、列，而以真正随机的方式将DNA 打断成片段的唯一方法就是机名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 9 页 - - - - - - - - - 械剪切。 但由此方法制备的染色体DN 段的末端， 并非用于克隆的粘性末端，需要进一步处理。包括末端的修复、 甲基化、 与接头连接并以合适的内切酶进行消化以便产生合适的粘性末端。经过机械剪切或限制性内切酶的消化，产生的片段长度也不一致，必须通过密度梯度离心纯化，才能得到所需的大小的片段。按照。 DNA 克隆化中程序的方法，将入
38、噬菌体载体用合适的限制性内切酶消化，然后再与处理过的染色体DNA 在 T4DNA 连接酶的作用下进行连接，进行大规模地包装反应，并建立预期大 小的基因组DNA 文库。基因组 DNA 文库建立以后，还必须对此文库进行扩增。四、染色体DNA 文库的筛选一 染色体 DNA 文库的筛选主要是应用Southern 杂交分析方法等。1将可疑阳性克隆，快速小量法提取DNA ，以同位素或地高辛等标记的探针进行杂交，显影或显色分析。2入噬菌体噬菌斑的原位杂交先将入噬菌体的噬菌斑在硝酸纤维素膜上或尼龙膜上进行固定，入噬菌体噬菌斑也可以原位进行扩增后再固定然后对入噬菌体分离物进行快速分离快速分析3.DNA 序列分析克隆的DN 段，最后以DNA 序列分析，加以证实名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 9 页 - - - - - - - - -