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1、原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109 或BL21 等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109 菌株中。一鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109 或 BL21 中大量表达（一） 制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB 培养基，加入0.7ul Amp（100mg/mL） ，37oC200r/min 摇床培养，过夜活化。2. 以 1：50比例（200ul） ，将活化的过夜培养物加入10mL LB 液体培养基中，加入 10uLAmp（100mg/ml） ，37oC200r/min
2、摇床扩大培养 2h-3h，期间取样监控菌液的 OD 值，控制菌液 OD600 在 0.6-1.0 之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。 (一般 3h时，菌液浓度及达到标准， 但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间) 3. 从 10ml 扩大培养物中取 3ml 菌液作为不加 IPTG 的空白对照（ CK） ，其余7ml 菌液加入 7ul IPTG（储存浓度为 0.5mol/l） ，使 IPTG 终浓度达到 0.5mmol/l。以 200r/min 的转速， 37oC 摇床培养 3h。4. 以 5000r/min 离心 2min 收集菌体，倾倒上清，每个
3、离心管收集3ml 培养物。5. 加入 1ml dH2O， 将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤， 8000r/min离心 2min，倾倒上清。6. 重复步骤 5。将离心管中的水倒干净。（二）菌落 SDS-PAGE 1. 在收集的菌体中加入200ul 1SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少 loading buffer 的量，一般 200ul 比较合适 )。用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。2. 将样品于 100恒温加热器上开盖加热10min （Marker 也要加热）。样品凉后，12000r/min离心 3min，取每管的上清点样。上样量一般30ul40ul
4、，marker 20ul。（三） SDS-PAGE分析1. 根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶蛋白分子量(kDa) 凝胶浓度(%) 4-40 20 12-45 15 10-70 12 15-100 10 25-200 8 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 6 页 - - - - - - - - - 分离胶（两块）配方15% 12% 8% ddH2O 3.4ml 4.9ml 6.9ml 30% Acr-Bis (29:1) 7.5ml 6.0ml 4.0
5、ml 1.5M Tris-HCl （ pH8.8）3.8ml 3.8ml 3.8ml 10%SDS 150ul 150ul 150ul 10%过硫酸铵150ul 150ul 150ul TEMED 20ul 20ul 20ul 总体积15ml 15ml 15ml 按表中所列顺序从上到下加试剂，加完TEMED后，轻轻摇匀液体， 一块胶加7ml溶液。加完后，用1mLddH2O 封住分离胶液面，在室温（37）凝结 30min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倾倒水层，用滤纸条将残余的水吸干。2. 制作浓缩胶浓缩胶（两块）配方5% ddH2O 3.4 mL 30% Acr-Bis (29:1)
6、0.85 mL 1M Tris-HCl （ pH6.8）0.63 mL 10%SDS 50 uL 10%过硫酸铵50 uL TEMED 20 uL 总体积5ml 胶配好后混匀， 灌胶 2ml，插梳子时根据点样量和浓缩胶长短调整梳子插入的深度，于室温 (37 )凝胶 30min。3. 胶凝好后， 拔梳子，将胶放入电泳槽中， 加入 1 Tris-Gly 电泳缓冲液没过点样孔，胶外侧缓冲液界面应完全没过电极4. Marker 点 5uL，用 10uL 小枪点样，以防样品冲出点样孔与旁边样品混杂。电压打到 70V，保证电流在 20mA-30mA 之间，当样品跑入浓缩胶时可适当调高电压，但不宜多次调整电
7、压，否则条带会跑歪。5. 当溴酚蓝电泳至胶槽底部时, 一般需要 2.5h ，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min 染色 3h，可以过夜染色。6. 用移液器回收考马斯亮蓝染色液，再用蒸馏水将浮色冲洗干净后，倒入考马斯亮蓝脱色液， 40r/min 脱色至胶背景透明，期间可每2h 更换一次脱色夜。根据菌落 SDS-PAGE的结果，可以看到目的蛋白是否大量表达。二鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白1. 从冻存的菌液中取10ul，接种于 5ml 的 LB 培养基中， 加入 5ul Amp(100 mg/ml), 过夜活化菌株。2. 按照 1：50 的比例，从活化
8、的菌株中，取1ml 菌液接种于 50ml LB 培养名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 6 页 - - - - - - - - - 基中，加入 50ul Amp(100 mg/ml)，扩大培养 3 h。3. 扩大培养后的菌液 , 取出 10ml，不加 IPTG ，作为空白对照。剩余的40ml菌液中加入 40ul IPTG（0.5mol/l）, 诱导蛋白表达。 两者在 37 ，200rpm的条件下培养 3h。4. 用 50ml 离心管收集菌体， 8000rpm，
9、离心 3min。注意配平。5. 倒掉上清， 加入 40ml 左右的 dH2O 洗菌体一遍， 12000 rpm，离心 2min。注意要将菌体充分打散。6. 倒掉上清，用枪头将上清吸干净。根据菌体的浓度，加入适量的PBS buffer 悬浮菌体。7. 用大功率的超声波将菌体破碎，其间超声波每工作2min，停止 1min。菌体要始终保持在冰水混合物上，以保证低温，蛋白不易变性。如此反复 6-10 遍，直至菌液清澈。8. 12000rpm， 离心 3min，分离上清和沉淀。9. 在沉淀中加入 250ul 1 SDS Loading buffer , 取 200ul 上清，加入 50 ul 5 SDS
10、 Loading buffer，在恒温加热器上100 加热 10min。10. 加热后的样品冷却到室温后，12000rpm，离心 2min。11. 取上清 40ul 点样，按照一中的方法进行SDS-PAGE 检测。点样顺序是：对照的上清，沉淀，样品的上清，沉淀。12. 根据 SDS-PAGE结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生。如果蛋白在沉淀中大量表达，则形成包涵体，需要改变诱导表达条件，比如将扩大培养与诱导培养的温度改为25 ，并延长相应培养时间。如果蛋白在上清中表达，则形成可溶性蛋白，可继续进行下一步实验。三纯化目的蛋白（整个过程要尽量保持在4 进行）1. 大量诱导目的蛋
11、白（一般需要2-4 L 的菌量），用超声波破碎细胞，收集上清。2. GST纯化柱的柱床保存在20%的乙醇中，使用之前，先用吸管将柱床轻轻加入到柱子中，打开柱子，流出乙醇，使柱床沉积下来。3. 加入 10ml PBS buffer, 洗柱床 3 遍，使得柱床重新平衡。4. 将准备好的样品加入到柱子中，每次加入 5-10ml 样品，使样品结合在柱子上（ 每次上样量不能太多，因为柱子的结合能力有限） 。5. 用 PBS buffer洗柱子 3 遍，每次用 10ml，去除柱子中非特异性结合的杂蛋白。6. 加入 5ml 洗脱液（ 10m mol/l 的还原型谷胱甘肽，用50mmol/l tris-buf
12、ferr或者 PBS buffer 溶解）将目的蛋白洗脱出来。用 1.5ml 离心管收集流出来的样品，每管接0.5ml 样，一共收集6-8 管( 一般情况，第一管流出的是 PBS ，第二和第三管大部分是目的蛋白，所以OD值很大，第三至第六管的 OD值慢慢降低。不要偷懒一次接太多，不然会影响后续收集蛋白。还原型谷胱甘肽很容易被氧化，如果一次没有用完，请用保鲜膜封口置于 4 度冰箱保存，超过2 天的话请更换新的洗脱液。) 7. 用 PBS buffer洗柱子 1 遍。8. 用分光光度计测每一管的OD 值，记录下读数，将读数大于200 的样品留下(一般是第 2 至第 4 管) ，冻于 -20 冰箱中
13、。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 6 页 - - - - - - - - - 9. 重复步骤 4-8，直至所有样品均纯化完毕。10. 可以用 SDS-PAGE检测纯化出来的样品浓度以及纯度。重生柱子的方法 ： （柱子使用三四次之后，需要重生，即让柱子上的GST结合基团重新暴露出来）1用还原型谷胱甘肽洗脱液洗柱子3 遍，每次加入 10ml。2. 用 PBS缓冲液洗柱子 4 遍，每次加入 10ml。3. 用 50 mmol Tris HCl（pH 8.0）洗柱
14、子 3 遍，每次加入 10ml。4用 0.5M NaCl（pH 8.0）洗柱子 3 遍，每次加入 10ml。5. 用 100 mM 醋酸钠（ pH 4.5）洗柱子 3 遍，每次加入 10ml。6. 用 0.5M NaCL 洗柱子 3 遍，每次加入 10ml。柱子长时间不用，需要按照以下方式清洗及保存：1. 按照重生的 1-6 步骤先将柱子重生一遍。2. PBS洗柱子 2 遍，每次加入 10ml。3. 将柱床用吸管吸出，分别用5%，10%，15%，20%的乙醇洗 2 遍。4. 用单蒸水轻轻冲洗柱子底部的膜，洗出杂蛋白。5. 柱床保存在含 20%乙醇的 PA 瓶中。柱子和柱床置于4 度冰箱保存。如
15、果柱子用于纯化不同的蛋白，只需要按照重生方法的1， 2 步骤操作即可，然后直接纯化另外一个蛋白。如果柱子流速很慢，可能是柱子底部的膜被杂蛋白堵住了。柱子重生之后，将柱床用吸管吸出，然后用单蒸水将柱子底部的膜轻轻冲洗，再将柱床加入到柱子中，重新上样。如果柱子需要重生，请用完柱子的同学自觉完成这份工作，以免影响下一位同学的使用。四根据不同的用途浓缩蛋白1. 若蛋白用于制作抗体如果洗脱液用的是tris-bufferr 配制的，需要用 1/4 的 PBS buffer 进行透析，然后在冷冻干燥机中冻干浓缩，因为公司最终需要将目的蛋白溶于 PBS buffer中。如果洗脱液是用PBS buffer 配制
16、的，则直接在冷冻干燥机中冻干浓缩。GST 纯化柱手册上建议的是用tris-bufferr 配制洗脱液，但用PBS buffer 配制的洗脱液可以将目的蛋白洗脱下来。可自己选用。2. 若蛋白用于活性检测由于蛋白在 tris-bufferr 和 PBS buffer 中，均能保持活性， 所以不论用哪种，都不需要透析，直接浓缩干燥即可。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 6 页 - - - - - - - - - 大肠杆菌 IPTG 诱导原核表达(2011-04-1
17、2 20:16:14)转载标签：杂谈分类：生物医药行业小量表达1 取单克隆菌落小养过夜2 大养 50ml，至 OD600 达 0.4-0.63 取 1ml 培养液， 13000rpm，1min 离心收集， 30ul 水溶，加入30ul 2SDS loading buffer ， 20 保存4 加入 IPTG 至 1mM ，每隔 2hr 重复步骤 35 配置相应的SDSPAGE 胶6 将样在沸水中煮5min，上样 10ul，60V 跑浓缩胶， 120V 跑分离胶。7 取胶，考马斯亮蓝染色30min，脱色液脱色过夜大量表达1 前三步相同2 加入 IPTG 至 1mM，培养 6hr3 4， 8000
18、rpm，离心 10min，去上清4 用 10ml 1PBS 重悬沉淀，加入溶菌酶10mg，25， 30min5 加入蛋白酶抑制剂PMSF 至终浓度为1mM6 冰上超生破碎，200W，30S 超声， 30S间隔， 30 个循环7 加入 TritonX 100，至终浓度为1，室温混合30min 以提高融合蛋白的可浓性8 4， 12000rpm，离心 10min，分别取上清，沉淀9 上清，沉淀同时跑电泳，观察蛋白是在上清还是沉淀中包涵体中蛋白的纯化1 将离心收集的菌体用包涵体蛋白纯化缓冲液洗涤一次2 用 1/50 菌液的上述缓冲液悬浮菌体，按每1ml 加入 1mg 溶菌酶，于25水浴 30min3
19、加入 PMSF 至 1mM ，800W 超生破碎菌10min4 剪切菌体 DNA5 5000rpm ， 4， 10min 离心，去上清6 25ml 上述缓冲液洗涤沉淀3 次7 用上述缓冲液悬浮至终浓度为0.5mg/ml8 悬浮蛋白溶液装入透析袋，于50倍体积透析液I 中透析， 4， 10hr9 换 100 倍体积透析液II 进行透析， 4，10hr10换 100 倍体积透析液III 进行透析， 4， 10hr11换 100 倍体积透析液IV 进行透析， 4， 10hr12吸出透析后的蛋白，稍离心除去丝状不溶物，分光光度计测蛋白浓度名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - -
20、 - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 6 页 - - - - - - - - - His6 标记蛋白过NTA 柱纯化1 将 Ni NTA 填料从 4取出，与乙醇混匀，装上柱子2 以 10 倍柱体积的H2O 过柱，洗去乙醇3 以 50ml binging buffer过柱4 蛋白溶液于4， 12000rpm 离心 10min，取上清，用bingding buffer 稀释至 5 倍5 蛋白稀释液过柱，可适当降低过柱速率，使蛋白与柱充分结合6 以 50ml washing buffer 过柱7 以 20ml elution buffer 过柱，用 Eppendorf 管接过柱溶液，每管测A280 值，与未过柱前所测A280 值比较8 每管进行 SDS-PAGE 鉴定蛋白丰度名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 6 页 - - - - - - - - -