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1、1 Western blot 标准操作规程 (SOP) 【原理】一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶）。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA 法外，也可用与检测DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。前两法有“ 南” 和“ 北” 之意，故本法遂被延伸称为Western （西）印迹法，该法能用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。 将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。 第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合，然后用另一种蛋自质， 如 135I- 蛋白 A 或辣根过氧化物酶连接的山羊抗Ig
2、G 检测已结合上去的抗体。本法所需时间6 小时或过夜。蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂 SDS 与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS 结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS 多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下， 每克多肽约可结合 1.4 克去污剂，借助已知分子量的标准参照物， 则可测算出多肽链的分子量。SDS
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液， 当两电极间接通电流后， 凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS 多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964) 和 Davis(1964) 设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8) ，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸 (pH8.3) ，分离胶中含
4、 Tris-Cl(pH8.8) 的。 系统中所有组分都含有0.1的 SDS(Laemmli, 1970) ，样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH 值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。 从移动界面中解脱后， SDS 多肽复合物成一电位和pH 值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。【常用试剂】1）30%丙烯酰胺 /0.8% N,N -亚甲丙烯酰胺将 30 克丙烯酰胺和 0.8 克
5、 N,N -亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中，加热至 37溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45 m 微孔滤膜过滤除菌，查证该名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 15 页 - - - - - - - - - 2 溶液 pH 应不大于 7.0，置棕色瓶中保存。小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。 称量丙烯酰胺和 N,N -亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材
6、料。2）4Tris?Cl/SDS, pH8.8, 在 300mlH2O 中溶解 91g Tris 碱(1.5mol/L) ，用 1mol/L 调节 pH 至 8.8, 补加 H2O 至体积 500ml 。 用 0.45um 滤膜过滤溶液，再加入 2g SDS0.4%(w/v) ， 于 4可保存 1 月。3）4Tris?Cl/SDS, pH6.8, 在 40mlH2O 中溶解 6.05g Tris 碱(0.5mol/L) ， 用 1mol/L 调节 pH 至 6.8, 补加 H2O 至体积 100ml 。用 0.45um 滤膜过滤溶液， 再加入 0.4g SDS0.4%(w/v) ，于4可保存
7、1 月。4）4 SDS 电泳缓冲液Tris base 24.2 g Glycerin 115.3 g 20%SDS 20 ml 加水至总体积 1000ml 。应用时稀释 4 倍即为 1 SDS 电泳缓冲液 (Tris 0.05M, Glycerin 0.38M, SDS 0.1%)。5）TEMED (N,N,N ,N-四甲基乙二胺 ) TEMED 通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N -亚甲丙烯酰胺的聚合。6）10%过硫酸铵过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量 10%(w/v) 的贮存液并保存于4。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。
8、【步骤】1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm 垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。2）按表 7.1 配制分离胶液体并脱气，然后加入10的过硫酸铵和 TEMED ，轻轻搅拌混匀。表 7.1 聚丙烯酰胺分离胶的配制试剂成分配制不同浓度分离胶所需试剂(ml) 5% 8% 10% 12% 15% Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50 4Tris?Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75 10%过硫酸铵0.05 0.05 0.0
9、5 0.05 0.05 TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5的凝胶可用于 60200kDa 的 SDS 变性蛋白质分子的分离，10用于 1670kDa，15用于 1245kDa 。3）用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 15 页 - - - - - - - - - 3 板夹层中，至凝胶约5cm 高为止。样
10、品体积少于10l 不需灌制积层胶。4）用另一根已斯德吸管，先从一边的垫片，再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇（厚约1cm）。让凝胶在室温聚合30min 。聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线，胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或TEMED ，或两者都有。5)倾去顶层的异丁醇，并以1 Tris-Cl/SDS, pH8.8 缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干。6)按表 7.2 配制积层胶液体，用吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至夹层的顶部。表 7.2 聚丙烯酰胺积层胶的配制GEL% （3.9%) Total (10.05ml) Acry:Bis
11、(30:0.8) 1.30 ml 4Tris?Cl/SDS, pH6.8 2.50 mlH2O 6.10 ml 10%过硫酸铵0.05 ml TEMED 0.01 ml 7)将 0.75mm 厚的梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。让积层胶室温聚合30min 。8)在具螺口盖的微量离心管中，用2 SDS 加样缓冲液按 1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于 100煮沸 5-10min 。如样品是蛋白质沉淀物，加入50100l 1SDS 加样缓冲液溶解之， 并同样在 100 煮沸 5-10min 。按供应商的使用指南用2 SDS 加样缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物
12、。对于 0.3cm 宽的加样孔， 推荐加样体积以不超过20 l 为宜。用考马斯亮蓝染色法显迹，成分很复杂的蛋白质混合物需加2550 g，而样品中只有一种或不多的几种蛋白的话，只需 110 g 蛋白量。采用银染显迹时， 样品用量可减小10100 倍 （按样品的复杂程度在小于20 l 的体积溶有 0.010.5ng 蛋白样品不等）。2 SDS 加样缓冲液 (loading buffer)配制：成分 体积 (ml) 0.5M Tris?Cl (pH6.8) 12.520%SDS 11.5 Glycerin 10 2% Blue-Bromo-phenol 2.5 -mercaptoethanol *
13、5.0 加 H2O 至总体积 50 ml，分装* -mercaptoethanol 在临用前加入。9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。取出梳子后，以1 SDS电泳电泳缓冲液冲洗加祥孔，并以此缓冲液充满之。10）按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室（上槽），同时往下缓冲液室（下槽）加入推荐量的1 SDS 电泳缓冲液。11）将固定于上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入部分电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。12）用带平嘴针头的50 l 注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - -
14、 - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 15 页 - - - - - - - - - 4 中，小心加样使样品在孔的底部成一薄层，对照孔加入蛋白质分子量标准样品，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1 SDS 样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。13)再往上槽加入余下的1 SDS 电泳缓冲液。此操作缓慢小心，以防冲起样品孔中的样品。14）连接电源，对于0.75mm 厚的垂直板电泳，先在60V 下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶， 再将电压调至 120V 继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。15）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。1
15、6）将凝胶定位以便识别加样的顺序，将凝胶板从上槽解离出来，放在一叠吸水纸或纸巾上。17）小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆橇起上面的玻璃平板，使凝胶暴露出来。18）小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序，接着就可进行蛋白质的检测。19)转膜将凝胶面与负极相连， 硝酸纤维素膜与正极相连。 （100V ，1 小时）要放于 4。1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride)
16、 membrane at 1Amp constant currentfor 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH). 2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or eq
17、uivalent(250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH). 3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25m
18、M Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS). 4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20%MeOH, 0.05% SDS). Add transfer (or CAPS) buffer t
19、o the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a wat
20、er cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations 20)、清洗将硝酸纤维素膜放入1X TBST 中清洗 3 次，每次 5 分钟。摇床摇动。 （这步忘名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 15 页 - - - - - - - - - 5 了！）21)、封闭1. Remove t
21、he blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20). 2. Incubate the blot for 1 hour at 37, 2 hours at room temperature, orovernight at 4. 22)、一抗孵育一抗用 TBST1:1000 稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37孵育 1.5 小时， (或4过夜 )摇床摇动。
22、Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified pr
23、imary antibodies at a concentration of 1 ug/ml. 23)、清洗将硝酸纤维素膜放入1X TBST 中清洗 3 次，每次 5 分钟。24)、二抗孵育二抗用 TBST1:8000 稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37孵育 1 小时，摇床摇动。25)、清洗同 22，之后，用 1X TBS 在清洗 2 次，每次 5 分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。26)、显色按如下配方配制显色液：1mL 水+1 滴（大约 50 微升）试剂 A(之后混匀 )+1 滴试剂 B+1 滴试剂 C 将硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终
24、止反应。Considerations: Perhaps the most common problem in western blotting is the occurrenceof background staining. The best remedy for high background (in many cases) is simply to dilute the primary antibody further. Other solutions include ensuring that detergent is used in the blocking reagent, usin
25、g an alternate blocking reagent (casamino acids, BSA, serum), and decreasing the amount of protein applied to the electrophoresis gel. ? Occurrences of extra bands in the blot can be resolved by several strategies. Run a control blot omitting the primary antibody to determine if the secondary antibo
26、dy is the source of the problem. Replacing the secondary antibody with a different lot or a similar reagent from a different source can provide resolution. Spurious bands below the targeted molecular weight suggest that the protein is being degraded in the experiment; inclusion of protease inhibitor
27、s can help. ? No or low signal can be remedied by loading more protein in the gel or increasing the amount of primary and/or secondary antibody applied t名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 15 页 - - - - - - - - - 6 o the blot. ? Some antibodies will n
28、ot bind in the presence of detergent; consult thedatasheet for each antibody prior to performing any procedure Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。 Western 使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、20低温冰箱、垂直板电泳转
29、移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。试剂：单去污剂裂解液、 0.01mol/L PBS (pH7.3) 、10分离胶、 4浓缩校、G250 考马斯亮蓝溶液、 0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS 上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X 丽春红染液、封闭液、 TBST 、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。杂品与耗材 ：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（2020cm），X-光片夹， X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L Tris?HC
30、lTris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水200ml 溶解后，用浓盐酸调 pH 至所需点（见下所示） ，最后用蒸馏水定容至250ml ，高温灭菌后室温下保存。PH HCl 7.4 约 17ml 7.5 约 16m 7.6 约 15ml 8.0 约 10ml 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 15 页 - - - - - - - - - 7 异丙醇100ml 溶解后，分装于 1
31、.5ml 离心管中， 20保存。0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98 ）12g 蒸馏水至500ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4?12H2O（MW 358.14 ）71.6g 蒸馏水至1000ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。10SDS SDS 10g 蒸馏水至100ml 50水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10过硫酸胺（ AP）过硫酸胺0.1g 超纯水1.0ml 溶解后， 4保存，保存时间为1 周。1.5mol/L Tris?HCl （pH8.8 ）Tris (MW121.14) 45
32、.43g 超纯水200ml 溶解后，用浓盐酸调pH 至 8.8，最后用超纯水定容至250ml ，高温灭菌后室温下保存。0.5mol/L Tris?HCl （pH6.8 ） Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH 至 6.8，最后用超纯水定容至250ml ，高温灭菌后室温下保存。40Acr/Bic （37.5：1）丙稀酰胺（ Acr）37.5g 甲叉双丙稀酰胺（ Bic）1g 超纯水至100ml 37下溶解后， 4保存。使用时恢复至室温且无沉淀。20Tween20Tween20 20ml 蒸馏水至100ml 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下
33、载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 15 页 - - - - - - - - - 8 混匀后 4保存。（二）使用液单去污剂裂解液 （50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100?g/ml PMSF ）：1mol/L Tris?HCl（pH8.0 ）2.5ml NaCl 0.438g TritonX 100 0.5ml 蒸馏水至 50ml 混匀后， 4保存。使用时，加入 PMSF 至终浓度为 100?g/ml（0.87ml 裂解液加入
34、1.74mg/ml PMSF50 l）。0.01mol/L PBS （ pH 7.2-7.4 ）0.2 mol/L NaH2PO4 19ml 0.2 mol/L Na2HPO481ml NaCl 17g 蒸馏水至2000ml G250 考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝 G250：100mg 95乙醇：50ml 磷酸：100ml 蒸馏水至1000ml 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料， 再加入磷酸和水， 混匀后，用滤纸过滤，4保存。0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44 ）0.877g 蒸馏水至100 ml 高温灭菌后，室温保存。100mg/ml 牛血清白蛋白（ B
35、SA ）BSA 0.1g 0.15 mol/L NaCl 1ml 溶解后， 20保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl 进行 100 倍稀释成 1mg/ml ，20保存。10分离胶和 4浓缩校10分离胶（两块胶，10ml）4浓缩胶（两块胶， 5ml）超纯水 4.85ml 3.16ml 40Acr/Bic （37.5：1） 2.5ml 0.5ml 1.5 mol/L Tris?HCl（pH8.8）2.5ml 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共
36、 15 页 - - - - - - - - - 9 0.5 mol/L Tris?HCl（pH6.8）1.26ml 10SDS 100 l50l 10%AP （过硫酸胺）50 l25 l TEMED 5 l5 l 加 TEMED 后，立即混匀即可灌胶。还原型 5XSDS 上样缓冲液（0.25mol/L Tris?HCl pH6.8， 0.5mol/L 二硫叔糖醇，10 SDS，0.5溴酚蓝， 50甘油）0.5 mol/L Tris?HCl（pH6.8）2.5ml 二硫叔糖醇（ DTT，MW154.5 ）0.39g SDS 0.5g 溴酚蓝0.025 甘油2.5ml 混匀后，分装于 1.5ml
37、离心管中， 4保存。电泳液缓冲液 （25mmol/L Tris，0.25mol/L 甘氨酸， 0.1 SDS）Tris（MW121.14 ） 3.03g 甘氨酸（ MW75.07 ）18.77g SDS 1g 蒸馏水至1000ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用35 次。转移缓冲液 （48mmol/L Tris，39mmol/L 甘氨酸， 0.037 SDS，20甲醇）甘氨酸（ MW75.07 ）2.9g Tris（MW121.14 ）5.8g SDS 0.37g 甲醇200ml 蒸馏水至1000ml 溶解后室温保存，次溶液可重复使用35 次。10X 丽春红染液丽春红 S 2g 三氯乙酸30
38、g 磺基水杨酸30g 蒸馏水至100ml 使用时将其稀释 10 倍。TBS 缓冲液 （100mmol/ L Tris?HCl pH7.5,150mmol/L NaCl ）1 mol/ LTris?HCl（pH7.5）10ml NaCl 8.8g 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 15 页 - - - - - - - - - 10 蒸馏水至1000ml TBST 缓冲液 （含 0.05Tween20 的 TBS 缓冲液）20Tween20 1.65ml TBS
39、 700ml 混匀后即可使用，最好现用现配。封闭液 （含 5脱脂奶粉的 TBST 缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌）5g TBST 100ml 溶解后 4保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。洗脱抗体缓冲液 （100mmol/L 2-Mercaptoethanol ，2SDS ，62.5m mol/L Tris?HCl pH6.8）14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(-巯基乙醇 ) 700 l （通风厨里加）SDS 2g 0.5mol/L Tris?HCl（pH6.8）12.5ml 超纯水至100ml 配制时，在通风厨内进行。4保存。可重复使用1 次。显
40、影液（ 5X）自来水（加热至 50）375ml （以下药品加到温水中）米吐尔1.55g 亚硫酸钠（无水）22.5g 碳酸钠（无水）33.75g 溴化钾20.95g 补水至500ml 配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4保存。使用时用自来水稀释至1 倍。定影液自来水（ 5060）700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠240g 亚硫酸钠（无水）15g 冰乙酸12.6ml 硼酸7.5g 钾明矾15g（水温冷至 30以下时再加入）加水定容至 1000ml ，室温保存抗体用 TBST 稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml 化学发光试剂购自北京中山公
41、司，为Santa Cruz 产品，分 A 和 B 两种试剂。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 15 页 - - - - - - - - - 11 操作步骤 ：（一） 蛋白样品制备（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、每瓶细胞加 3ml 4预冷的 PBS（0.01M pH7.2 7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复
42、以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。3、按 1ml 裂解液加 10 ?l PMSF（100mM ），摇匀置于冰上。（ PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4、每瓶细胞加 400 ?l 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解30min ，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、于 4下 12000rpm 离心 5min。（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于 20保存。（
43、2）组织中总蛋白的提取：1、将少量组织块置于12ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2、加 400 ?l 单去污剂裂解液裂（含PMSF ）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。4、裂解 30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在 4下12000rpm 离心 5min，取上清分装于 0.5ml 离心管中并置于 20保存。（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1、将培养液倒至 1
44、5ml 离心管中，于 2500rpm 离心 5min。2、弃上清，加入 4ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm 离心 5min。弃上清后用 PBS 重复洗涤一次。3、 用枪洗干上清后，加100 ?l 裂解液（含 PMSF ）冰上裂解 30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。4、 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4、12000rpm 离心 5min，取上清分装于 0.5ml 离心管中并置于 20保存。（二） 蛋白含量的测定名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - -
45、- - 第 11 页，共 15 页 - - - - - - - - - 12 （1） 制作标准曲线1、 从20取出 1mg/ml BSA，室温融化后，备用。2、 取 18 个 1.5ml 离心管， 3 个一组，分别标记为0mg，2.5mg ，5.0mg ，10.0mg ，20.0mg ，40.0mg 。3、 按下表在各管中加入各种试剂。0mg 2.5mg 5.0mg 10.0mg 20.0mg 40.0mg 1mg/ml BSA 2.5ml 5.0ml 10.0ml 20.0ml 40.0ml 0.15mol/L NaCl 100ml 97.5ml 95.0ml 90.0ml 80.0ml 6
46、0.0ml G250 考马斯亮蓝溶液1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 4、 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（ BioPhotometer ，Eppentoff）上比色分析。（2） 检测样品蛋白含量1、 取足量的 1.5ml 离心管，每管加入4储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置 30min 后即可用于测蛋白。2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl 溶液 100 l，混匀放置 2 分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank 测空白样品。3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2 次（每次 0.5ml），再用无菌水洗一次。4、取一
47、管考马斯亮蓝加95 l0.15mol/L NaCl NaCl 溶液和 5?l 待测蛋白样品，混匀后静置 2min，倒入扣干的比色杯中按sample 键测样品。注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2 次，无菌水洗一次。 可同时混合好多个样品再一起测， 这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是 5 ?l 样品含的蛋白量。（三） SDSPAGE 电泳（1） 清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。 两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。（2） 灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
48、）2、按前面方法配 10分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用 10ml 枪吸取 5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。 操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。 加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - -
49、 第 12 页，共 15 页 - - - - - - - - - 13 4、按前面方法配 4的浓缩胶 ,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。 插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小， 所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。5、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）6、测完蛋白含量后，计算含50?g 蛋白的
50、溶液体积即为上样量。取出上样样品至 0.5ml 离心管中，加入 5 SDS 上样缓冲液至终浓度为1 。（上样总体积一般不超过 15?l，加样孔的最大限度可加20?l 样品。）上样前要将样品于沸水中煮 5min 使蛋白变性。7、加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品， 将样品吸出不要吸进气泡。 将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。 （加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时， 进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3 次， 以免交叉污染。（3）电泳电泳时间一般 45 h，电压为 40V 较好，也可用 60V。电泳至溴酚兰