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1、如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流糖尿病小鼠模型的制备【精品文档】第 5 页一、糖尿病的概念及分类糖尿病已成为全人类继恶性肿瘤和心脑血管病之后的严重威胁人类健康的第三大非传染性疾病。目前我国己成为世界第一糖尿病大国。糖尿病是一类由遗传、环境、免疫等因素引起的、具有明显异质性的慢性高血糖症及其并发症所组成的综合征，并非单一病因所引起的单一疾病(多原因引起的综合症）。糖尿病分为：型糖尿病、型糖尿病和其它特异性糖尿病。型糖尿病即胰岛细胞大量破坏，常导致胰岛素绝对性缺乏，以往称为胰岛素依赖型糖尿病、青年发病型糖尿病，“三多一少”症状明显。本型病因及发病是由于胰岛细胞受到细胞介导性自身免疫性破坏。
2、型糖尿病由于胰岛素抵抗并胰岛素分泌不足所致，以高血糖高血脂为显著特点。以往称为非胰岛素依赖型糖尿病、成年发病型糖尿病，常伴有明显的遗传因素，但遗传机制尚未阐明。 其它特异性糖尿病包括，细胞功能的基因缺陷、胰岛素作用的基因缺陷、胰腺外分泌疾病、内分泌疾病、药物或化敏学制剂所致的糖尿病、感染、非常见型免疫介导性糖尿病以及有时并发糖尿病的其它遗传综合症。（糖尿病是无法根治的，现在随着人们生活水平的提高，饮食习惯，生活方式的改变糖尿病的发病率节节攀升，成为威胁人类健康的一大难题。人们曾经一度把糖尿病称为富贵病这也是有一定道理的。为了提高人们的生活质量，近几年对糖尿病的研究日益加深）二、糖尿病模型的建立
3、近年来，随着国内外对糖尿病治疗药物研究的深入开展，建立比较理想的糖尿病动物模型显得尤为重要。目前常用的动物模型有实验性动物模型和自发性动物模型。自发性模型应用价值较高，但因价格昂贵，饲养、繁殖条件要求严格，而不能得到广泛应用。实验性模型则应用比较广泛，实验性糖尿病动物模型的建立，是用各种方法损伤动物胰脏或胰岛细胞导致胰岛素的缺乏，或用化学药物对抗胰岛素作用，导致动物出现高血糖形成糖尿病。实验性糖尿病动物模型的建立主要有6种方法：胰腺切除法致糖尿病、免疫性糖尿病、激素性糖尿病、下丘脑损伤性糖尿病、化学性糖尿病、病毒性糖尿病。由于化学性糖尿病动物模型诱发简便、 来源广， 应用较广泛。目前多采用注射
4、化学诱导剂(链脲佐菌素或四氧嘧啶)的方法，引起短时间内胰岛细胞大量损害而诱发糖尿病动物模型的建立。1、糖尿病模型小鼠多采用6-8周龄雄性小鼠，品系国内以昆明小鼠和ICR小鼠居多，由于价格便宜且药物敏感性高，应用较广泛。此外还有NODSCID小鼠、CD-1小鼠、C57BL6小鼠、BALBc小鼠、NMRI小鼠。2、化学诱导剂及致病机制目前常用的药物有链脲佐菌素STZ和四氧嘧啶 ALX ， 其作用机制都是选择性损伤胰腺 细胞，引起细胞坏死，导致血胰岛素不同程度下降伴血糖升高，形成胰岛素依赖型糖尿病。与四氧嘧啶糖尿病不同，链脲佐菌素引起的糖尿病高血糖反应及酮症均较缓和，所致糖尿病模型也更加稳定。（1）
5、链脲佐菌素STZSTZ是由致癌物质MNU衍生的一种2-脱氧-右旋-葡萄糖，STZ致糖尿病的机制是通过其本身含有的葡萄糖部分结构被胰岛细胞上低亲和力的葡萄糖转运蛋白(GLUT2)转运，特异性地作用于胰岛细胞，引起特殊位点烷基化，进一步导致多聚ADP核糖体激活，胞内NAD+和ATP耗竭，最终导致大量反应性氧簇产生，引起其结构破坏和胰岛素分泌功能障碍。此外还可以通过产生活性氧和NO发挥间接损伤作用。STZ是从无色链霉素分离出来的一种广谱抗生素，为无色固体，易溶于水，水溶液在室温下极不稳定，可在数分钟内分解成气体，因此溶液要在pH4低温避光的环境中保存，且现配现用。样品在称取的过程中要严格保证周围环境
6、的干燥，如确实需要多次称取，要严格按照避免受潮的原则操作和存放。操作方法：操作环境、盛装容器、分装工具都必须保证干燥。无需冰浴，分装后用封口膜密封瓶口，用铝箔纸(或锡箔，即避光)将瓶子包好，放入干燥罐里（干燥剂，即保持干燥状态）， 并2-8冷藏，可长期保存。STZ的溶剂一般选用pH 4.2-4.8柠檬酸缓冲液(0.1molL)。溶剂配制完成后，用0.2um的微孔滤膜过滤灭菌消毒备用。STZ配制过程都要在低温环境中进行，以保证STZ的药效性，提高造模的成功率。小鼠注射链脲佐菌素后，血糖水平的改变可分为三个时相：早期高血糖相，持续约12小时，是STZ抑制胰岛释放所致。据此，一般小鼠注射STZ两小时
7、后，给予正常进食；低血糖相，持续约610小时，可能是由于胰岛细胞破坏，大量胰岛素释放，致使血糖显著降低。为防止小鼠出现持续低血糖而惊厥死亡，在给予饲料的同时喂以5%的葡萄糖水24h；24小时后出现稳定的高血糖相即糖尿病阶段，此时大部分胰岛细胞已呈现不同程度的损伤和破坏。（2）四氧嘧啶（alloxan）ALX四氧嘧啶对胰岛 细胞有特异性的毒性作用，可选择性地损伤多种动物的胰岛细胞而引起实验性糖尿病，它通过产生超氧自由基破坏 细胞，使细胞内DNA损伤，并激活多ADP 核糖体合成酶的活性，从而使辅酶I 含量下降，导致mRNA功能受损， 细胞合成前胰岛素减少，最终导致胰岛素缺乏。这种作用机制与临床 I
8、型糖尿病患者的发病机制相近。四氧嘧啶引起的血糖反应也分三个时相,开始血糖升高,持续约2,继而因细胞残存的胰岛素释放引起低血糖约6,12后开始持久的高血糖。 四氧嘧啶其水溶性不稳定， 应现用现配。 注射速度要快， 这样成模率较高。配制所需的溶剂一般为生理盐水。此外，还有肾上腺素诱导的糖尿病。肾上腺素是强有力的升高血糖的激素，它的作用机制是与肝和肌细胞膜的受体结合，通过G蛋白激活腺苷酸环化酶、增高细胞内cAMP浓度，蛋白激酶级联激活磷酸化酶、抑制糖原合酶，从而加速糖原分解、抑制糖原合成。属于胰外性糖尿病。3、造模的方式方法 小鼠造模前一般禁食12-18小时。对普通饲料喂养的小鼠注射STZ前的禁食处
9、理是非常关键的。禁食的时间越长，链脲佐菌素对胰岛细胞的破坏力越明显，即药效越高。所以相对禁食时间延长，可以降低 链脲佐菌素的用量。禁食处理之所以与注射STZ后血糖变化密切相关，推测与禁食处理可以降低血液胰岛素和leptin水平，并显著下调脂肪组织ob基因表达有关(Tray-hurn et a1，1995；Mizuno et a1，1996)，为STZ进一步损害胰岛细胞提供了有利的内部环境。化学诱导剂给药方式有两种，尾静脉注射给药法和腹腔注射给药法。根据给药剂量和给药次数不同，又可将尾静脉给药和腹腔给药分别划分为大剂量一次给药法和小剂量多次给药法。 STZ以腹腔注射居多，大剂量一次性给药剂量多为
10、150-200mg/kg，小剂量多次给药以40-70mg/kg连续五天较多。大剂量注射时，由于直接引起胰岛细胞的广泛破坏，可造成1型动物模型；而注射较少量 链脲佐菌素时，由于只是破坏一部分胰岛细胞的功能，造成外周组织对胰岛素不敏感，同时给予高热量饲料喂养，两者结合便诱导出病理、生理改变都接近于2型 病患的动物模型。 ALX多为大剂量一次性给药，尾静脉给药量多为60-100mg/kg，腹腔注射以100-200mg/kg为主。具体的给药剂量及给药途径，还要根据小鼠自身的特点以及其他多方面综合考虑，先经预实验摸索，以达到最优方法。预实验很重要。实验时链脲佐菌素的给药量应参照预实验的结果，尽量不要盲目
11、按照文献上或他人的给药量来直接使用，鼠均重和空腹(低糖状态)抗药力、禁食时长、注射选时、以及之前饲养过程、测糖选时注射过程等都不相同，通过预实验来确定符合自己实验鼠的给药计量，才是最科学的。有文献在对ALX造糖尿病模型发现，随剂量的增加,小鼠死亡率增高;小鼠体重增加,死亡率亦增高;静脉注射成模率比腹腔注射高;同等剂量分次给药,死亡率、转阴率均降低，认为四氧嘧啶以同等剂量分次给药小鼠糖尿病成模率高。目前，国内造II型糖尿病模型，以高脂饮食和化学诱导剂损伤联合造模。通过给予实验动物少量STZ,破坏一部分胰岛细胞功能,同时饲以高脂肪饲料造成外周组织对胰岛素不敏感,两者结合诱导出接近人类型糖尿病的动物
12、模型。此方法所造模型模拟了II型糖尿病的一定的病理现象，但却很难界定为真正意义上的II型糖尿病。因此，国外在研究II型糖尿病时，多采用Zucker大鼠、db/db小鼠、ob/ob小鼠等转基因鼠。三、检测指标(一)一般情况的观察小鼠外形外观的观察，如体重、毛色、反应能力等，进食量、进水量、排尿量的观察。（二）生化指标的检测血糖、糖化血红蛋白；血清肌酐、尿素氮水平的检测。(三)病理切片及形态学检查 胰腺的损伤于糖尿病造模后一周就可发生病理改变，可见胰腺外分泌大量灶状或散在的单核细胞,胰岛细胞空泡变性,使胰岛呈空虚状态,胰岛毛细血管扩张、充血、胰岛细胞减少。肾脏损伤第四周可见。糖尿病可使小鼠相对肾重
13、增加，糖尿病肾病早期的基本病理改变为肾小球肥大、基底膜增厚和系膜区域扩大，进一步发展，可致肾小球的纤维化硬化。糖尿病是一种常见病、多发病、其发病机制也较为复杂,应用可控的动物模型可正确分析其各种发病机制,严格的组织病理、生化和生理观察均可正确判断药物疗效情况,不同的动物模型应选择合适的测定指标。随着实验动物科学的不断发展,将建立更佳的符合临床发病机理、更经济、重复率高的模型,从而推动糖尿病机制及有效的防治研究。参考文献：1 安吉白茶多糖对实验性糖尿病小鼠的降血糖作用研究2 链脲佐菌素稳定性对诱导糖尿病小鼠模型的影响3 链脲佐菌素致糖尿病小鼠模型的建立及抗氧化能力的影响4 四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的制备及影响因素5 禁食与非禁食处理对构建2型糖尿病小鼠模型血糖的影响