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1、叶酸靶向紫杉醇胶束对EMT-6乳腺癌细胞株及动物模型的抗肿瘤作用背景 : 乳腺癌已经成为中国女性最常见的恶性肿瘤之一 , 在世界范围内也是如此。紫杉醇 (Paclitaxel,PTX) 是乳腺癌的一线化疗药物。但其水溶性差 ,且会引起较严重的不良反应 ,如过敏反应等 ,使其临床应用受到了一定限制 4 。易溶于水、毒性更低的新型紫杉醇药物传送系统就成为研究的热点。中国科学院应用化学研究所合成了一系列功能性聚乙二醇 -聚(乳酸 - 碳酸酯 )poly(ethylene glycol)-b-poly(L-lactide-co-carbonate) 及其与紫杉醇和靶向基团的键合物。但这种药物传递系统对
2、乳腺癌在体内及体外的作用情况仍未知晓。本研究中 , 我们选择叶酸作为靶向基团 ,并制成紫杉醇胶束 (PTX micelles,M(PTX) 和叶酸靶向紫杉醇胶束 (folic acid-bearing polymer-PTX micelles,(M(FA/PTX) 。我们期待这些胶束能拥有多种功能 , 包括水溶性、缓释作用、生物降解能力、叶酸受体靶向能力等 , 与目前临床应用的药物剂型相比较 , 疗效相近或更优 , 但副作用更低。目的：探索紫杉醇胶束和叶酸靶向紫杉醇胶束作用于 EMT-6 小鼠乳腺癌细胞株和动物模型的效果 , 检测两种胶束的肿瘤抑制率、肿瘤细胞的凋亡效果和对生存率的影响。材料与
3、方法：制备含25%PTX 勺(M(PTX) 和含 22.5%PTX 勺(M(FA/PTX) 两种 PTX 键合物胶束。(1)对 EMT-6 小鼠乳腺癌细胞进行常规培养、传代。应用 MTT 法检测 PTX M(PTX 和(M(FA/PTX) 以等量 PTX 的不同浓度梯度 (10ug/ml、1ug/ml 、0.1ug/ml、0.01ug/ml、1ng/ml)作用 EMT-6 细胞 24、48、72 小时的细胞抑制率应用流式细胞仪检测含等量 PTX 浓度为 1ug/ml时,PTX、M(PTX 和(M(FA/PTX) 作用于 EMT-6 细胞 24、48、72 小时的细胞凋亡率。应用倒置显微镜观察含
4、等量 PTX 1 卩名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页 - - - - - - - - - g/ml浓度的 PTX M(PTX) M(PTX作用于 EMT-6 细胞 24 和 72 小时的细 胞形态变化。应用 Hoechst 33258荧光染色检测含等量 PTX1 卩 g/ml浓度的 PTXM(PTX) M(PTX作用于 EMT-6 细胞 72 小时的凋亡指数。制作EMT-6 小鼠乳腺癌动物模型。在抑瘤实验中,分为空白对照、 PTX M(PTX 和 M
5、(FA/PTX)4个组,每组 12 只 小鼠,给药总剂量为 20mg/kg为标准 (以等量 PTX 计算 ),第 5 天处死动物。测量瘤重, 计算肿瘤抑制率。瘤组织一部分做流式细胞检测 , 其余的迅速用 4%多聚甲醛固定 , 石蜡包埋 , 进行 H&E染色、 Bax 和 Bcl-2 的免疫组化检测。生存实验中,分为空白对照、 PTX M(PTX 和M(FA/PTX)4个组,每组 18 只小鼠,给药总剂量为26.7mg/kg为标准 (以 等量 PTX 计算 ),每日观察记录小鼠生存状态。(3)应用 SPSS18.0 统计软件，计量资料用均数土标准差描述,组间差异应用单项方差分析比较，以 p<
6、;0.05为有统计学意义。计数资料应用x 2 检验进行 样本率间比较 , 以p<0.05 为有统计学意义。应用 Kaplan-Meier 法计算生存率 , 绘制生存曲线。各组间生存差异比较采用 Log-rank 检验。结果 :(1)在体外实验中 ,MTT 试验结果显示在72h 时，在 1ug/ml的浓度下 M(PTX) 和M(FA/PTX) 的抑制效果达到最佳。随着作用时间的延长,各组药物对EMT-6 乳腺癌细胞生长的抑制率也随之增加流式细胞结果显示在药物作用 72h 时, 各用药组的细胞凋亡率均高于对照组 , 对照组、PTX 组、 M(PTX 组和 M(FA/PTX) 组的细胞凋亡率分
7、别为 14.4% 、20.7% 、 19.7% 和25.7%,M(FA/PTX)组的细胞凋亡率最高,与其他两用药组比较其差异有统计学意义(p<0.05)。倒置显微镜下，PTX、M(PTX 和 M(FA/PTX三种药物作用于 EMT-6 小鼠乳名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 3 页 - - - - - - - - - 腺癌细胞后可以观察到细胞形态较对照组细胞发生明显的改变。Hoechst 33258染色结果显示对照组、PTX 组、M(PTX 组和 M(
8、FA/PTX) 组的 细胞凋亡率分别为 5.8% 、15.8% 、15.2% 和 21% (2) 在体内抑瘤实验中,PTX 组的 动物在通过尾静脉给药时,均烦躁不安,持续尖叫,而 M(PTX) 和 M(FA/PTX) 两组的 小鼠在给药时均无明显的异常反应出现。在给药 5 天后 ,PTX、M(PTX) 和 M(FA/PTX组的瘤重抑制率分别为 29.0% 、46.5% 和54.9% 。在组织学观察中,三个用药组均可观察到坏死区域,M(FA/PTX) 组的坏 死区域的面积要比 PTX 和 M(PTX 组明显增大。对照组、 PTX M(PTX 和 M(FA/PTX组的 Bax 蛋白阳性表达率分别为
9、8.3% 、50% 60 唏口 75%,Bcl-2蛋白阳性表达率分别为 91.7% 40% 60唏口 50% 流式细 胞检测结果显示,对照组、 PTX M(PTX) 和 M(FA/PTX组的细胞凋亡率分别为1.0% 、 36.6% 、55.9% 和 66.1% 。生存时间结果显示,对照组、 PTX 组、 M(PTX 组和 M(FA/PTX组在用药 30 天 时的生存率分别为 50% 、 55.6% 、 72.2% 和 77.8%, 中位生存时间分别为 33 天、 31 天、34 天和42 天(log-rank test:c2=9.789,P=0.02) 。结论：在体外细胞试验中,M(PTX)
10、和 M(FA/PTX) 两种药物可以获得与 PTX 近似的对 EMT-6 小鼠乳腺癌细胞的肿瘤抑制效果,且 M(FA/PTX表现出比 M(PTX 更好的肿瘤抑制效果在体内动物实验中,与 PTX 和 M(PTX 相比 ,M(FA/PTX) 显示出更好地对小鼠皮下移植瘤的抑制效果,能够更有效诱导肿瘤细胞凋亡。M(FA/PTX) 能更好的延长荷瘤小鼠的生存时间。M(FA/PTX) 在人乳腺癌中治疗效果值得期待。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 3 页 - - - - - - - - -