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1、著名的两个发现 1924年，法国科学家De.Broglie(德布罗利)证明了任何一种粒子，当它们在快速运动的时候，必定都伴随有一定频率电磁辐射，辐射波的波长与粒子的质量及粒子运动的速度成反比。 1926年，德国科学家Busuch（布施）在射线研究中发现，高速运动的电子在电场或磁场的作用下会发生折射，并且能被汇聚，就如同普通的可见光通过光学透镜折射聚焦一样。 电子显微镜：可基本定义为是一种以电子束为光源，以电磁透镜聚焦和放大成像的，具有极高放大倍率和分辨率的显微镜。 透射电子显微镜结构：主要由镜筒系统、电子光学系统、操作系统、真空系统和冷却循环系统组成。 透射电子显微镜的基本成像原理 透射电子显
2、微镜是一种利用透射电子放大成像的光学设备，它的设计和制作与光学显微镜有许多相似之处，但在电子显微镜中所使用的光源是电子束，透镜为电磁透镜，整个成像光路的内介质为高真空环境。因此，电子显微镜是集电子学、电子光学、材料学、物理学、机械制造以及生命科学于一体的精密设备，光源是电子束，透镜为电磁透镜，整个成像光路的内介质为高真空环境。（电子束的产生、照明电子束的获得、电子束与样品的相互作用、电子图像的获得与成像）电子束产生后，经照明透镜系统的多级汇聚，产生高能高速高密的照明电子束，其轰击经特殊处理的样品，透射电子束经过成像透镜系统多级放大投射到荧光屏后激发绿光，进而变成人眼可见的图像。其中电子束经过结
3、构致密区时，透射的电子量少，能量低，表现在图像上为暗区，反之为明区。利用电子显微镜观察物体的过程，是一个电子束攻击被视样品的过程。电子束穿越均匀磁场，发生折射并汇聚，因此，透射电子显微镜设置了两到三组透镜系统，又称为照明透镜系统。当初级电子束穿越磁透镜时便产生汇聚，经过多级的汇聚.照明电子束特征：高能、高速、高密获得电子束光源需要特定的条件：高真空、高电压。电磁透镜有五部分构成：物镜（OBJ）、两级中间透镜、两级投影镜放大倍数的模式包括：常规放大倍数(ZOOM)、扫描普查(SCAN)、选区观察(SA)和低倍放大(Low Mag)分辨率(R)：是指电子显微镜分辨本领的极限值，包括晶格分辨率和点分
4、辨率镜筒系统照明透镜系统样品室成像透镜系统观察与记录系统电子枪(G)第一聚光镜(C1)第二聚光镜(C2)第三聚光镜(C3)电磁偏转线圈物镜(OBJ)第一中间镜(I1)第二中间镜(I2)第一投影镜(P1)第二投影镜(P2)观察室摄影与录像室TV系统 操作台亮度/亮度中心：亮度，调节光斑大小，及调节光斑强度；亮度中心，调节光斑位置，不调节光斑强度电镜常规操作：开机预抽、观察操作、关机操作三个阶段透射电子显微镜与光学显微镜的比较 1.光源部分 可见光；电子束（钨丝加热，高电压，高真空） 2.成像部分 物镜和目镜（玻璃）；电磁透镜（物镜，两级中间镜，两级投影镜；循环冷却系统） 3.观察系统 人眼可直接
5、观察，或相机直接拍摄；荧光屏（信号转换）、相机和胶片（高真空操作）扫描电子显微镜的基本结构（1）电子光学系统 a. 电子枪 b. 电磁透镜 c. 扫描系统 (2）电子信号的收集、处理和显示系统 a. 信号的种类b. 信号的收集和处理系统 c. 信号的显示与记录系统 (3) 真空系统扫描电子显微镜的基本成像原理从电子枪发出的直径2030m的电子束，受到阴极和阳极之间的140KV加速电压的作用，以极高的速度射向精细的电子通道，形成初级电子束。初级电子束经过第一、第二级聚光镜及物镜(末透镜)的汇聚作用，缩小成直径几十的电子探针。在末透镜上部的扫描线圈的作用下，电子探针样品表面作光栅状扫描并且激发出多
6、种电子信号。这些电子信号被相应的检测器俘获，经过放大、转换，将最初的光信号转换成电压信号，最后被送到显像管的栅极上并且调制显像管的亮度。显像管中的电子束在荧光屏上作光栅状扫描，且这种扫描运动于样品表面的电子束的扫描运动严格同步，这样显像管受信号电压调制形成了反映样品表面特征的图像。这就是衬度与所接收信号强度相对应的扫描电子图像。由此可见，扫描电子显微镜的成像原理不同于透射电子显微镜，它没有成像透镜系统，代之的是闭路电视成像系统。扫描电子显微镜的成像原理见图。 S250-MKIII 基本操作简介1、 开机操作（接通电源和启动真空系统）2、常规校正操作 3、聚焦 4、样品的放入和取出 5关机操作电
7、镜冷却系统包括：冷却水循环装置、整机冷却管道样品制备技术中所要解决的三个主要问题1、 电子束的特点 穿透能力有限，细胞直径大于其穿透能力，无法研究它的内部结构超薄切片技术2、 生物组织的特性 水分的存在在高真空的环境中会使得结构发生变化，不能代表其真实结构，污染镜筒3、 电子成像的机制 在透射电子显微镜中，电子像的反差主要是由于样品散射电子能力之间的差别造成的。但是构成生物样品的元素，如碳、氢、氧、氮、磷；这些元素之间散射电子的能力相差无几，所以说生物样品的固有反差总是很弱，观察起来会感到十分困难。超薄切片制作过程：也包括取材、固定（双固定）、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节。厚度
8、在10-100nm之间1、 取材：要求（1.快，最大限度保存组织在生活状态下的结构；2.小，组织块大小主要决定于组织的性质和制备样品过程中要用到的溶液的扩散和渗透能力，一般样品块的大小不超过1mm；3.准，位置准确；4.器材干净，刀，剪锋利）2、 固定：尽可能的保存组织细胞内的结构以及细胞内各种成分之间的相互关系，把超微结构改变控制在最小范围内。化学固定法中，有两个很重要的过程：一是形成稳定的蛋白胶体结构，这一结构的形成有赖于蛋白与蛋白之间稳定的交联作用，戊二醛、甲醛和四氧化锇都有很强的交联蛋白作用；另一个是稳定细胞以及细胞内部的膜结构，四氧化锇和醋酸铀都对膜结构的固定有重要作用，四氧化锇主要
9、稳定不饱和脂类，而醋酸铀主要稳定磷脂。 1）固定方式：A 浸泡固定 步骤：前固定（一般使用醛类固定剂）缓冲液洗涤后固定（一般使用四氧化锇）缓冲液洗涤 它适用于一些能允许在短时间内停止供血仍保持其功能和结构的器官或组织，以及一些病理检查的样品。 B 灌注固定：所谓灌注固定就是将固定液通过血液循环的途径灌注到所需固定的组织中。灌注固定时，首先必须把动物麻醉。又称血液固定，使用于一些取材比较复杂或对缺氧比较敏感的器官或组织等 C 培养细胞的固定 v 实验室常规固定方法：使用戊二醛或戊二醛-多聚甲醛初步固定后再使用四氧化锇后固定的双重化学固定对大多数动物和植物组织都十分有效2） 固定剂：四氧化锇优缺点
10、：优点：A对脂类糖类以及蛋白的固定作用都很明显，弥补醛类对脂类固定的不足；B据电子染色作用，膜结构清晰 C配置时无需考虑渗透压 缺点：A渗透力弱（组织块小）B不能保存糖原、不能固定核酸，对微管的固定效果也不好 C时间不宜太长（易变脆，不利于切片；交联复合体易水解）D与乙醇或醛类起氧化还原反应，生成沉淀 甲醛：分子量小，穿透能力强，适用于前固定，但反应部分可逆；原理与戊二醛相似，主要引起蛋白交联；可与核酸及核算蛋白反应，但反应部分可逆，对脂类固定能力弱，可与脂类交联的蛋白作用。 戊二醛：反应速度快，渗透力强；蛋白质、糖原的强固定剂。脂类固定较弱；可以长时间固定；需要选择合适的固定液渗透压 缓冲液
11、作用：1.维持稳定的pH值；2.提供合适的渗透压；3.提供适宜的离子成分磷酸盐缓冲液的优点：1.无毒，容易操作 2.价格便宜，容易获得 3.能满足多数固定的需要 缺点：1.不能与Ca2 + 共存，容易产生沉淀 2.长期储存容易长菌。 v 注意事项：固定液的浓度、渗透压、PH、固定温度、时间温度、固定剂和组织材料是固定时间长短的主要因素3. 、脱水：目的和影响因为绝大多数的包埋剂是不溶于水的，样品经双重固定及缓冲液冲洗后，在包埋之前必须彻底脱水，使既能与水又能与包埋剂互容的脱水剂替代水，以方便包埋剂渗透到组织或细胞中。脱水过程对样品影响在于对脂类的抽提并引起组织细胞的收缩。4. 脱水过程逐级进行
12、，一般的程序如下： 5. （30% 乙醇或丙酮 5-10min）6. 50% 乙醇或丙酮 5-10min7. 70% 乙醇或丙酮 5-10min（或过夜）8. 90% 乙醇或丙酮 10-15min9. 100% 乙醇或丙酮 三次，每次10-15min 注意事项：脱水必须彻底；时间不宜太长；动作要迅速；经过常温双重固定的样品一般在常温进行脱水。4、 渗透和包埋 目的是使包埋剂逐步渗透入组织细胞内，以便与细胞外的包埋剂同时聚合，超薄切片优良 包埋剂特点：对样品伤害小，体积变化小；能经受电子束轰击；能溶于脱水剂和过度的渗透试剂，粘度低；透明度好；毒性低5、超薄切片 原理：热膨胀式、机械进刀式 铜网、
13、支持膜、制刀、刀槽、修块、装块、装刀、对刀、超薄切片、捞片6、 染色 增大时像反差原理：是利用某些重金属盐类（如铅盐、铀盐等）与细胞的某些成分或结构结合起来，由于重金属对电子散射能力很强，使那些与其结合的结构或成分对电子散射能力增强，从而达到提高样品本身反差的一种方法。经过染色的超薄切片不仅提高了反差，而且重金属沉淀在切片上还增加了切片对电子束损伤的抵抗力。最常用的染色剂是铀盐和铅盐（醋酸铀和柠檬酸铅）、双重染色负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠(分别简称为PTA、KPT、NaPT)。此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用常规超薄切片程序：1、 取材 2、固定（双固定）3、清洗
14、4、脱水 5、渗透包埋聚合 6、修块切片染色扫描电子显微镜切片注意事项：A尽量保持活体时的形貌和结构 B干燥过程中尽量减少样品形貌 C样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应样品制备程序：v 取材 尽可能小v 清洁 毛笔清扫、蒸馏水清洗、有机溶剂浸洗、酶解法、离心法v 固定 除常规固定外亦可采用戊二醛单固定或配合使用，如戊二醛做前固定，锇酸做后固定v 漂洗v 脱水v 干燥 乙醇置换了水之后通常采取空气干燥法、临界点干燥法、冰冻干燥法、真空干燥法等v 镀膜 减轻荷电现象，增大图像反差；金属镀膜和组织导电处理电子图像的获得与成像 通常要求样品切成500800 的薄片。当
15、电子束轰击这些薄片样品时，由于样品是由结构和密度不同的区域交织组成的，轰击使电子在不同的区域产生强度不同的散射，对于结构致密的区域，电子散射率就高，透过的电子量会显著减少，其能量也会下降，成像过程中呈现为暗区；而对于结构密度稀疏的区域，电子将顺利通过，散射率很低，其速率和能量不会明显下降，在成像过程中呈现为明区。这样，我们就获得了由明暗混杂的透过电子束，这种电子束被描述为带有样品固有信息的透射电子束。透射电子束经过成像透镜体统的多级放大，最终投影在荧光屏上。电子显微镜设置了一个荧光屏。这是一张金属板，在其表面涂有一层荧光物质，当经过放大的电子束轰击荧光屏时，激发荧光物质发浅绿色光(波长约500
16、0 )，从而，将不可见的电子图像转换为可见的图像了；透射电子显微镜则是采用电子束作为照明光源。获得电子束光源需要特定的条件：高真空和高电压。在通常使用钨灯丝的情况下，处于高真空中的钨丝被加热到白炽程度，钨丝尖端便会发射出电子，电子在阳极很高的正电压（加速电压）的吸引，从而获得极高的加速度形成高能电子束。透射电子显微镜则是采用电磁透镜，是由看不见的磁场构成的，通常由五级透镜系统组成物镜(OBJ)、两级中间镜(I)和两级投影镜(P)。另外，电子显微镜中的电磁透镜在使用过程中，会产生大量的热，对电磁透镜的使用寿命和工作的稳定性均构成极大的威胁，因此，在透射电子显微镜上还配备的一个极其重要和庞大的系统
17、循环冷却系统。透射显微镜的主要种类普通型透射电子显微镜。 分析型透射电子显微镜。 高压型透射电子显微镜。超高压型透射电子显微镜。生物型透射电子显微镜 H-7000型透射电子显微镜的主要特点1加速电压连续可变 2自动定位阳极3散射电子吸收套筒4波纹管密封可动光阑5真空系统的改进 6图像观察与图像记录系统的改进H-7000型透射电子显微镜的主要结构3.2.1 镜筒系统电子光学系统 在这个系统中，主要包括共用电源、高压电源、透镜电源、束偏转电源、控制电路、相机电源以及CRT显示电路。3.2.3 真空系统和冷却系统 H-7000透射电镜的真空系统是有两套真空线路构成的，因此，它拥有两套抽真空设备，即两
18、三台油旋转泵和两台油扩散泵；其他组成部分包括：真空管道、预抽管道、预抽室(胶片干储装置)、潘宁规(PE)、普拉宁规(PL)、抽真空指令装置和保险装置。 冷却系统包括：冷却水循环装置和整机冷却管道常规操作可分为开机预抽、观察操作和关机操作三个阶段。4.1.2扫描电子显微镜的基本结构1） 电子光学系统 a. 电子枪 b. 电磁透镜 c. 扫描系统(2) 电子信号的收集、处理和显示系统 a. 信号的种类b. 信号的收集和处理系统c. 信号的显示与记录系(3) 真空系统扫描电子显微镜的基本成像原理从电子枪发出的直径2030m的电子束，受到阴极和阳极之间的140KV加速电压的作用，以极高的速度设想精通的
19、电子通道，形成初级电子束。初级电子束经过第一、第二级聚光镜及物镜(末透镜)的汇聚作用，缩小成直径几十的电子探针。在末透镜上部的扫描线圈的作用下，电子探针样品表面作光栅状扫描并且激发出多种电子信号。这些电子信号被相应的检测器俘获，经过放大、转换，将最初的光信号转换成电压信号，最后被送到显像管的栅极上并且调制显像管的亮度。显像管中的电子束在荧光屏上作光栅状扫描，且这种扫描运动于样品表面的电子束的扫描运动严格同步，这样显像管受信号电压调制形成了反映样品表面特征的图像。这就是衬度与所接收信号强度相对应的扫描电子图像。由此可见，扫描电子显微镜的成像原理不同于透射电子显微镜，它没有成像透镜系统，代之的是闭
20、路电视成像系统。扫描电子显微镜的成像原理见图。1.检测器2. 扫描控制系统3. 视频放大器扫描电子显微镜的种类 1 普通型扫描电子显微镜2 高分辨扫描电子显微镜3 超高分辨扫描电子显微镜4 场发射扫描电子显微镜5 环境扫描电子显微 6 低压扫描电子显微镜 7 扫描隧道显微镜超薄切片的厚度在10-100nm之间。它的制作过程与石蜡切片的制作过程很相似，也包括取材、固定（双固定）、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节。v 取材要求：1快。分离切取组织要迅速，尽快使组织与固定液作用，从而最大程度地保存组织在生活状态时的结构。 2、小。组织块大小主要决定于组织的性质和制备样品过程中要用到的溶液
21、（包括固定液、缓冲液、脱水剂和包埋剂等溶液）的扩散和渗透能力。一般样品块的大小不超过1立方毫米。3、准。位置准确。 4、取样时所用的器具必须干净，刀、剪等必须锋利，在 操作时尽量避免拉、锯、压等动作对组织细胞造成的机械损伤。 v 取材方法： 1、 动物组织：轻微麻醉并固定住，用锋利的刀、剪等暴露出取材部位，立即用吸管将配好的固定液滴到预定取材部位，然后用刀、剪、镊等准确而平稳地取下一块大小合适的组织块，置缓冲液中漂洗其表面之血液等 捞出切成小于1立方毫米的小块，用牙签尖端挑起组织块，放入盛有冷却的固定液的小瓶中固定2、培养细胞、细菌等样品 ：取足量的混悬液，离心，去上清液。v 固定的作用：就是在组织块从有机体中取出之后，组织细胞内的结构以及细胞内各种成分之间的相互关系都尽可能地被保存下来，宛如活体状态时候的情况一样；即，这一步将终止组织细胞的生化过程，同时把它们的超微结构改变控制在最小范围内。 化学固定法。一是形成稳定的蛋白胶体结构，这一结构的形成有赖于蛋白与蛋白之间稳定的交联作用，戊二醛、甲醛和四氧化锇都有很强的交联蛋白作用；另一个是稳定细胞以及细胞内部的膜结构，v 浸泡固定前固定（一般使用醛类固定剂）缓冲液洗涤后固定（一般使用四氧化锇）缓冲液洗涤 v 灌注固定双重固定v 使用戊二醛或戊二醛-多聚甲醛初步固定后再使用四氧化锇后固定的双重化学固定对大多数动物和植物组织都十分有效，