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1、授课进度第周，第次课2 学时授课日期年 月日授课题目(教学章、 节或主题 )细菌的形态学检查一教学目标学会显微镜的使用，重点掌握油镜的使用与保护。进一步认识细菌的形态，明确细菌的大小与测量单位。熟悉细菌的特殊结构。教学重点油镜的观察和使用教学难点油镜的观察和使用教学方法请选择你授课时所采用的教学方法在括号中画“” ：讲授法，讨论法，演示法，案例法，发现法，探究法，谈话法，实验法，参观法，考察法，自学辅导法，练习法习题或操作课，读书指导法，听说法，写生法，视唱法，工序法技能课，实习作业法，其他教学手段请选择你授课时所采用的教学手段在括号中画“” ：实物，多媒体， 投影， 影像，CAI课件，PPT
2、 ，标本 ，挂图，模型，其他讨论、思考题、作业实验报告参考文献 (1) 杨致邦，叶彬. 病原生物学与免疫学实验【M】.北京 .科学出版社 .2013 年.(2) 潘丽红 . 病原生物学与免疫学实验及学习指导【M】.中国科学技术大学出版社，2013 年. 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 22 页1实验内容：2显微镜油镜的使用与保护。3细菌的形态与结构的观察。4实验目的：5学会显微镜的使用，重点掌握油镜的使用与保护。6进一步认识细菌的形态，明确细菌的大小与测量单位。7熟悉细菌的特殊结构。8实验材料：显微镜、擦镜纸、液体石蜡、
3、消毒液、细菌的基本形态标本、细菌的特殊结构标本。4实验方法：(1)显微镜油镜的使用与保护显微镜是一种贵重的光学仪器，而油镜又是显微镜的最精密部分，是观察细菌最重要的工具。因此，要求大家必须熟练地掌握显微镜的使用和保护，尤其是油镜，防止损坏。1识别油镜： 95、100、HI、OeL。2对光：自然光用平面反光镜，人工光用凹面反光镜；先用低倍镜对光， 次用高倍镜。对好光源后，染色标本将聚光器升高，光圈放开。3、调节焦距：选一张细菌染色标本置于载物台上，用推进器固定，用低倍镜先找准物象，再用高倍镜看清物体，于标本上加镜油一滴。用眼从侧面观察，转动粗螺旋调节器，将油镜头徐徐下降浸入其中，切不可用力过猛，
4、以免损坏油镜。用左眼从接目镜观察，徐徐向上转动粗螺旋调节器，见模糊物象后，再用细螺旋调节器，直到物象完全清晰为止。4、显微镜的保护：所有的光学部分结构都不能用手指、普通布擦拭， 用过的油镜头应立即先用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭，再用干擦镜纸擦去二甲苯，以防二甲苯镜头上的固定胶，致使镜片脱落。显微镜的光学部分应防止日光直射。防止接触强酸、强硷、氯仿、酒精。显微镜用毕， 将物镜转成品字形并下降集光器和镜筒，用软布擦拭各部件后覆盖于接目镜上，双手端平送入镜箱内。置于干燥处，以防受潮。(二)细菌形态观察1、细菌的基本形态；球菌：肺炎球菌、脑膜炎球菌、葡萄球菌、链球菌杆菌：大肠杆菌、精选学习资料 - - -
5、 - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 22 页炭疽杆菌、结核杆菌、白喉杆菌弧菌：霍乱弧菌2、细菌的特殊结构：荚膜：肺炎球菌、产气荚膜杆菌鞭毛：水弧菌周毛菌芽胞：破伤风杆菌芽胞位于菌体顶端，呈鼓槌状精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 22 页授课进度第周，第次课2 学时授课日期年 月 日授课题目(教学章、 节或主题 )细菌的形态学检查二教学目标进一步了解细菌特殊结构在鉴别细菌过程中的实用意义。掌握革兰染色的操作法，充分认识革兰染色的临床意义。教学重点革兰染色的操作法教学难点革兰染色的
6、操作法教学方法请选择你授课时所采用的教学方法在括号中画“” ：讲授法，讨论法，演示法，案例法，发现法，探究法，谈话法，实验法，参观法，考察法，自学辅导法，练习法习题或操作课，读书指导法，听说法，写生法，视唱法，工序法技能课，实习作业法，其他教学手段请选择你授课时所采用的教学手段在括号中画“” ：实物， 多媒体， 投影， 影像， CAI课件， PPT ，标本，挂图，模型，其他讨论、思考题、作业实验报告参考文献 (1) 杨致邦，叶彬. 病原生物学与免疫学实验【M】.北京 .科学出版社 .2013 年.(2) 潘丽红 . 病原生物学与免疫学实验及学习指导【M】.中国科学技术大学出版社，2013 年.
7、 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 22 页一、实验内容：3细菌标本片的制备操作4革兰染色法操作二、实验目的：1进一步了解细菌特殊结构在鉴别细菌过程中的实用意义。2掌握革兰染色的操作法，充分认识革兰染色的临床意义。三、实验材料：革兰染色液全套、擦镜纸、二甲苯、大肠杆菌培养物、葡萄球菌培养物、生理盐水、玻片、接种环、酒精灯。四、实验方法：细菌标本片的制备操作1、涂片：点燃酒精灯；取洁净玻片一张，右手持接种环一酒精灯火焰中消毒，稍冷后取12环生理盐水置于玻片中央；再次消毒后，用接种环取菌落中的细菌或菌液或标本少许，在生理盐水中
8、涂匀制成约1cm左右的薄膜，并将接种环再次消毒后，置于试管架中。2、干燥：在室温中自然干燥；天冷时可在酒精灯火焰上方略加温，不可高温加热，否则，细菌被破坏后染色效果差。3、固定：右手持玻片一端，标本面向上，在酒精灯火焰上方快速地来回通过三次，约2妙种。固定的目的是杀死细菌，使细菌与玻片粘附较紧密。革兰染色法操作1、初染：滴加结晶紫染液于标本上，以覆盖满为度，染1分钟后水洗，洒去积水。2、媒染：加鲁格碘液，媒染1分钟后水洗，洒去积水。7脱色：加 95酒精脱色边加酒精边摇晃玻片，使酒精流去再加酒精，如此反复2 3次约 30妙钟后水洗，洒去积水。12复染： 加复红染液染30妙钟后水洗， 洒去积水，待
9、干或用吸水纸吸干后镜检。先低倍镜观察效果，再用高倍镜看清物象，滴加镜油后用油镜观察。结果 ：G菌呈紫色， G菌呈红色。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 22 页授课进度第周，第次课2 学时授课日期年 月 日授课题目(教学章、 节或主题 )细菌的培养及代谢产物的检查教学目标熟悉细菌的培养方法，进一步掌握人工培养细菌的临床意义。了解细菌代谢产物在鉴别细菌中的意义。教学重点培养基的制备教学难点细菌代谢产物教学方法请选择你授课时所采用的教学方法在括号中画“” ：讲授法，讨论法，演示法，案例法，发现法，探究法，谈话法，实验法，参观法
10、，考察法，自学辅导法，练习法习题或操作课，读书指导法，听说法，写生法，视唱法，工序法技能课，实习作业法，其他教学手段请选择你授课时所采用的教学手段在括号中画“” ：实物， 多媒体， 投影， 影像， CAI课件， PPT ，标本，挂图，模型，其他讨论、思考题、作业实验报告参考文献 (1) 杨致邦，叶彬. 病原生物学与免疫学实验【M】.北京 .科学出版社 .2013 年.(2) 潘丽红 . 病原生物学与免疫学实验及学习指导【M】.中国科学技术大学出版社，2013 年. 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 22 页一、实验内容1、
11、培养基的制备操作2、细菌的人工培养法操作3、细菌代谢产物观察示教4、药敏试验示教二、实验目的1、熟悉细菌的培养方法，进一步掌握人工培养细菌的临床意义。2、了解细菌代谢产物在鉴别细菌中的意义。三、实验材料牛肉膏、 蛋白胨、氯化钠、 琼脂、 SS 琼脂、 蒸馏水、 1molNaOH 、0.1 molNaOH 、粗天平、 0.02%酚红指示剂、 pH比色器、无菌培养皿、无菌试管、接种环、酒精灯、各种鉴别培养基、高压消毒灭菌器、量筒、三角烧瓶、吸管、剪刀、绳索、葡萄球菌菌液、大肠杆菌菌液、伤寒杆菌菌液、乙型副伤寒杆菌菌液等。四、实验方法培养基的制备操作1、培养基的制备程序称量溶化pH测定与矫正分装灭菌
12、检定保存。2、液体培养基的制备1 称量：称取牛肉膏 3g、 蛋白胨 10g、 氯化钠 5g， 置于 1000ml三角烧瓶中， 加入蒸馏水 1000ml。2混合溶解：加热溶化，待冷至40? 50oC时，测定并矫正pH为 77.6 。3pH测定与矫正方法：准备工作：取pH7.4、 7.6 酚红标准比色管及蒸馏水管各1支，按图示装好；取口径与比色管相同的试管3支，各加待测液体基5ml，分别编上、号，按图示装好。 比色：将比色架对光目视比色，比较二排管的颜色是否相同，假设基为酸性一般呈酸性 ，则向号管中加0.02%酚红指示剂 0.25ml 摇匀，取 1ml吸管一支吸取0.1 molNaOH1ml，缓慢
13、滴入号管内，边加边摇匀，直至与标准管其中一侧颜色相同，准确记录NaOH 的用量。计算：5ml基矫正至 pH7.6用去 0.1 molNaOH0.2ml， 剩余的培养基则需加入1 molNaOH 为Xml。用比例公式计算。N1 ：V1N2：V2 5：975 0.2 ：X X0.2*975/5=39(ml) 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 22 页0.1 molNaOH需要 39ml，而加 1 molNaOH只需 3.9ml 。4分装： 分装十适当容器内试管，包装好，高压蒸气灭菌后备用。细菌的人工培养法操作1、平板划线接种法
14、：1点燃酒精灯，右手以握笔式持接种环，在火焰上灭菌后稍冷，挑取葡萄球菌、大肠杆菌混合菌液一环。2用左手掌持琼脂平板，以左手拇指将平板盖启开，右手将取了菌液的接种环伸入平板，呈45O角，用分段划线法别离细菌如下图，盖好平板。3于平板底部贴上标签，写明班、组、菌名、日期，底向上，置于37OC温箱中培养 24h后，观察结果。2、液体培养基接种法：左手持液体培养基， 按照平板划线取葡萄球菌少许，用右手小指拔开棉塞， 夹于指间示教，并将管口在火焰上灭菌，将细菌接种于液体培养基内。再次灭菌管口， 塞好棉塞。 贴上标签，置于 37OC温箱中培养 24h后，观察结果。细菌代谢产物观察示教1、糖发酵试验：细菌分
15、解糖后产酸产气，产酸后使批示剂显色，产气后可见到气泡。产酸产气以 “ ” 表示，只产酸不产气以“ ” 表示，不分解以“ ” 表示。大肠杆菌和伤寒杆菌分解糖的结果如下：菌种葡萄糖乳糖大肠杆菌伤寒杆菌2、硫化氢试验：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生硫化氢气体。硫化氢与培养基中的铁盐或铅盐反应，形成黑色的硫化铁或硫化铅沉淀，为阳性，无黑色沉淀为阴性。大肠杆菌硫化氢试验为阴性，乙型副伤寒杆菌为阳性。药敏试验示教1、平板划线：1用密集划线法将细菌布满平板，方法同平板划线接种法。2在无菌接种箱内，用左手启开平板盖，用无菌镊子夹取抗菌素纸片，间隔 5cm 放置平板培养基外表，盖好平板，贴上标签，置于
16、37OC温箱中培养 24h后，观察结果。3结果：观察抑菌区有无，测量抑菌区的直径。直径15mm 为高度敏感。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 22 页授课进度第周，第次课2 学时授课日期年 月日授课题目(教学章、 节或主题 )细菌的分布与消毒灭菌检查教学目标证明在自然界和正常人体体表有许多细菌存在，以树立严格的消毒及无菌观念。了解常用消毒灭菌器械的使用方法，初步掌握紫外线的灭菌方法护注意事项。教学重点细菌的检查及消毒灭菌器械的使用方法教学难点灭菌方法使用时的注意事项教学方法请选择你授课时所采用的教学方法在括号中画“” ：讲
17、授法，讨论法，演示法，案例法，发现法，探究法，谈话法，实验法，参观法，考察法，自学辅导法，练习法习题或操作课，读书指导法，听说法，写生法，视唱法，工序法技能课，实习作业法，其他教学手段请选择你授课时所采用的教学手段在括号中画“” ：实物， 多媒体， 投影， 影像， CAI课件， PPT ，标本，挂图，模型，其他讨论、思考题、作业实验报告参考文献 (1) 杨致邦，叶彬. 病原生物学与免疫学实验【M】.北京 .科学出版社 .2013 年.(2) 潘丽红 . 病原生物学与免疫学实验及学习指导【M】.中国科学技术大学出版社，2013 年. 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结
18、 - - - - - - -第 10 页，共 22 页一、实验内容1、空气中细菌的检查操作2、皮肤消毒试验操作3、咽喉部细菌的检查操作4、常用消毒灭菌器械的使用示教二、实验目的1、证明在自然界和正常人体体表有许多细菌存在，以树立严格的消毒及无菌观念。2、了解常用消毒灭菌器械的使用方法，初步掌握紫外线的灭菌方法护注意事项。三、实验材料普通琼脂平板、 SS 琼脂平板、 血平板、 接种环、 酒精灯、 高压消毒灭菌器、干烤箱、 紫外线、大肠杆菌培养液、1龙胆紫、 2.5 碘酒， 75乙醇、无菌棉签、镊子等。四、实验方法空气中细菌的检查操作1、取普通琼脂平板4个，启开皿盖，培养基面向上，分别放在实验室、
19、寝室、室外及无菌操作台等处，暴露10? 20min后加盖。2、于平板底部贴上标签，写明班、组、菌名、日期，底向上，置于37OC温箱中培养 24h后，观察结果。3、结果：如实填写。皮肤消毒试验操作1、取普通琼脂平板1个，在底部用玻璃蜡笔划线分区并标号，启开皿盖，用右手食指轻轻涂抹培养基外表。2、用 2.5 碘酒消毒右手食指后，再用消毒后的手食指轻轻涂抹培养基外表，加盖。3、于平板底部贴上标签，写明班、组、菌名、日期，底向上，置于37OC温箱中培养 24h后，观察结果。4、结果：如实填写。咽喉部细菌的检查操作1、取血平板 1个，启开皿盖，口对培养基外表距离约10cm ，深咳嗽三次不可吹痰，加盖。2
20、、于平板底部贴上标签，写明班、组、菌名、日期，底向上，置于37OC温箱中培养 24h后，观察结果。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 22 页3、结果：如实填写。常用消毒灭菌器械的使用示教、介绍1、紫外线杀菌试验点燃酒精灯， 取普通琼脂平板1个，在底部用玻璃蜡笔划线分出二个区并标号，启开皿盖，右手持接种环在火焰上灭菌后，稍冷，取大肠杆菌培养液一环，密集划线，加盖。将培养基置于无菌接种箱内，启开皿盖，将盖子盖于培养基上的一半，打开紫外线灯开头，照射 30min后，加盖。于平板底部贴上标签，写明班、组、菌名、日期，底向上，置于
21、37OC温箱中培养 24h后，观察结果。结果：如实填写。2、手提式高压蒸气灭菌器介绍构造：略用法：加水至规定的水平面、放入灭菌物品，加盖、旋紧，打开排气阀；通电加热、温度逐渐上升时，器内冷空气由排气阀排出，待有大量蒸气逸出时，关闭排气阀，继续加热，直到压力表的指针指在所需的位置后，调节电源，控制温度，维持20? 30min后，打开排气阀排气，待压力表指针指向“0”时，再开盖取物。注意事项：灭菌开始时必须排尽冷空气；灭菌完毕，切不可突然打开盖子排气减压，以免瓶内液体等冲出外溢；放置物品不应太挤。用途：用于耐高温和不怕潮湿的物品灭菌。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结
22、- - - - - - -第 12 页，共 22 页授课进度第周，第次课2 学时授课日期年 月 日授课题目(教学章、 节或主题 )病原性球菌的检查教学目标通过实验让学生掌握病原性球菌的形态、染色特性。了解脓汁标本的病原性球菌的别离鉴定的程序。了解抗“O ”试验的原理、方法及临床意义。教学重点1、病原性球菌标本的观察。2、脓汁标本中病原性球菌的别离鉴定的程序。3、抗 “O”试验教学难点抗“O ”试验的原理教学方法请选择你授课时所采用的教学方法在括号中画“” ：讲授法，讨论法，演示法，案例法，发现法，探究法，谈话法，实验法，参观法，考察法，自学辅导法，练习法习题或操作课，读书指导法，听说法，写生法
23、，视唱法，工序法技能课，实习作业法，其他教学手段请选择你授课时所采用的教学手段在括号中画“” ：实物， 多媒体， 投影， 影像， CAI课件， PPT ，标本，挂图，模型，其他讨论、思考题、作业实验报告参考文献 (1) 杨致邦，叶彬. 病原生物学与免疫学实验【M】.北京 .科学出版社 .2013 年.(2) 潘丽红 . 病原生物学与免疫学实验及学习指导【M】.中国科学技术大学出版社，2013 年. 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 22 页病原性球菌的检查实验目的：1掌握病原性球菌的形态、染色特性。2了解脓汁标本的病原性
24、球菌的别离鉴定的程序。3了解抗 “ O”试验的原理、方法及临床意义。实验内容：1、病原性球菌标本的观察。2、脓汁标本中病原性球菌的别离鉴定的程序。3、抗 “ O”试验实验材料：显微镜、细菌标本、玻片、试管、试管架、吸管、水浴箱、注射器、2.5%碘酒、棉签、生理盐水、血平板、兔血浆、抗“O ”试剂、血平板。实验方法：(2)病原性球菌标本的观察1、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌、淋球菌的形态观察操作。2、葡萄球菌、链球菌溶血现象观察示教。(4)脓汁标本中病原性球菌的别离鉴定的程序直接涂片革兰染色镜检脓汁标本观察菌特征及溶液血情况接种血平板 24h培养后观察取菌落涂片革兰染色镜检取菌落作生化
25、反应、致病力试验(5)抗“ O”试验原理：乙型溶血性链球菌能产生溶血素“O ”，能溶液解人和兔红细胞并有很强的抗原性，能刺激机体产生抗溶血素“O ”抗体。抗溶血素 “O ”能中和溶血素“O ”的溶血作用。 本法是将病人血清与已知溶血素“O ”抗原先混合，作用一段时间后，再加入红细胞悬液。假设红细胞不被溶解为阳性，溶解为阴性。方法：1、取小试管 6支，分别编号，分两排置于试管架上1-3为第一排， 4-6为第二排。2、第一排试管加待检血清(0.25ml)分别稀释为 200、400、800倍；第二排试管加待检血精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -
26、第 14 页，共 22 页清(0.25ml)分别稀释 300、600、1200倍。3、分别加链球菌溶血素“ O”抗原 0.25ml，充分混匀，置于37oC水浴箱中 10min。7分别加 5%红细胞悬液 0.25ml，充分混匀，置37oC水浴箱中 30min 后观察结果。结果：以完全不溶液血的血清最高稀释度为抗“O ”抗体的效价。正常值为500单位以下。用途：600单位及以上有诊断意义，用于辅助诊断活动性风湿。(四) 血浆凝固酶试验3取玻片一张，加生理盐水一环。用接种环取葡萄球菌少许，混匀。4加血浆一滴、混匀，数分钟后观察结果。出现颗粒状凝集的为阳性、反之为阴性。精选学习资料 - - - - -
27、 - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 15 页，共 22 页授课进度第周，第次课2 学时授课日期年 月 日授课题目(教学章、 节或主题 )肠道杆菌的检查教学目标通过实验让学生掌握肠道杆菌的形态、染色特性。了解肠道杆菌的别离鉴定的程序。了解肥达试验的原理、方法及临床意义。教学重点1、肠道杆菌形态标本的观察。2、肠道杆菌的别离鉴定程序。3、肥达试验。教学难点肥达试验的原理方法及结果分析教学方法请选择你授课时所采用的教学方法在括号中画“” ：讲授法，讨论法，演示法，案例法，发现法，探究法，谈话法，实验法，参观法，考察法，自学辅导法，练习法习题或操作课，读书指导法，听说法，写生
28、法，视唱法，工序法技能课，实习作业法，其他教学手段请选择你授课时所采用的教学手段在括号中画“” ：实物， 多媒体， 投影， 影像， CAI课件， PPT ，标本，挂图，模型，其他讨论、思考题、作业实验报告参考文献 (1) 杨致邦，叶彬. 病原生物学与免疫学实验【M】.北京 .科学出版社 .2013 年.(2) 潘丽红 . 病原生物学与免疫学实验及学习指导【M】.中国科学技术大学出版社，2013 年. 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 16 页，共 22 页肠道杆菌的检查实验目的：1、 掌握肠道杆菌的形态、染色特性。2、 了解肠道杆菌的
29、别离鉴定的程序。3、 了解肥达试验的原理、方法及临床意义。实验内容：1、肠道杆菌形态标本的观察。2、肠道杆菌的别离鉴定程序。3、肥达试验。实验材料：显微镜、细菌标本、玻片、试管、试管架、吸管、水浴箱、注射器、2.5%碘酒、棉签、生理盐水、 SS培养基、患者血清1：10 稀释、伤寒杆菌O 菌液、 H 菌液、甲、乙型副伤寒H 菌液。实验方法：一、肠道杆菌的形态观察【材料】大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌革兰染色示教片。【方法】注意上述肠道杆菌形态、排列、染色的共同点， 故肠道杆菌的染色镜检不能做为肠道杆菌之间的鉴别依据。二、肠道杆菌培养物与生化反应观察【材料】 大肠杆菌、 变形杆菌、 痢疾杆
30、菌、 伤寒杆菌及乙型副伤寒杆菌在SS 培养基、 双糖铁、尿素及蛋白胨水培养基上24小时培养物。【方法】1、观察大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及乙型副伤寒杆菌在EMB 培养基上生长情况，注意菌落的形态、大小、颜色及透明度。表1 五种肠道杆菌在SS 培养基上的菌落特征菌种培养基大肠杆菌变形杆菌伤 寒 沙门菌乙型副伤寒沙门菌痢疾杆菌S.S 菌 落 红 色或 呈 红 色菌 落 无 色 半透明，有时带菌 落 无色，半透同伤寒杆菌菌落，菌落同 伤 寒 杆菌菌落。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 17 页，共 22 页琼脂平板之中心， 不透
31、明， 直径2-3mm 左右黑 心 ， 直 径2mm 左右，有时 呈 膜 状 生长。明，直径2mm左右。可带黑心。EMB 菌落扁平，紫黑色， 具有 金 属 光泽圆形菌落，扁平，无色或半透明，似沙门菌小 至 中等 透 明或 半 透明，不发酵乳糖无 色 或 半透明，光滑不 发 酵 乳糖，中等大小2、观察大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及乙型副伤寒杆菌在双糖铁、尿素及蛋白胨水培养基上生长情况，注意生化反应与动力的鉴别。表2 五种肠道杆菌生化反应与动力鉴别表菌 名生化反应动力葡萄糖乳糖H2S 尿素靛基质大肠杆菌- - + + 变形杆菌- +/- + +/- + 副伤寒乙杆菌- + - - + 伤寒
32、杆菌+ - -/+ - - + 痢疾杆菌+ - - - +/- - 三、粪便标本中肠道杆菌的别离鉴定一标本采集尽可能在发病早期或治疗前采集新鲜粪便，选取脓血或粘液部分，取材后应立即送检。如不能立即送检，可将标本保存于30% 甘油缓冲盐水中。二检验程序精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 18 页，共 22 页肠道杆菌检验程序三检验方法：1、别离培养【材料】新鲜粪便标本、SS 琼脂平板。【方法】按上述检验程序进行第一日的检验步骤，即用接种环挑取新鲜粪便标本，划线接种于EMB 或SS 平板上， 37培养 24小时。【结果】观察平板上菌落， 依
33、据其大小、 颜色、透明度等特点， 初步识别可疑病原菌菌落，进行鉴定。在EMB 平板上非致病菌菌落较大、紫黑色、 有金属光泽， 不透明， 而可疑菌落略小，半透明。2、初步鉴定【材料】双糖铁培养基【方法】用接种针从可疑病原菌菌落中心点取细菌，穿刺接种双糖铁培养基Kligler培养基，37培养 18-24小时后，观察结果，并据此判定细菌属性。【结果】上层下层动力H2S + + - 非致病菌+ +- - - + - - 痢疾杆菌- + + + 伤寒杆菌- + + 副伤寒杆菌【用途】初步鉴别肠道致病菌用，可以观察葡萄糖、乳糖的发酵，并可观察有无H2S 产生及细菌有无动力。【原理】克氏双糖铁培养基中含有葡
34、萄糖、乳糖、 硫酸亚铁及酚红指示剂等成分。经菌分解葡萄糖产酸时， 使培养基的下层由红变黄，斜面培养基中虽然也含有葡萄糖但量小，且分解产生的酸为挥发性酸并且可被氧化，所以只发酵葡萄糖的细菌斜面仍为红色；产酸并产气时， 培养基精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 19 页，共 22 页中有气泡或裂隙出现。培养基中乳糖含量大，被分解后产酸多，因此不仅培养基下层变黄，而且斜面处也由红变黄，基于上述现象， 通常将培养基的斜面部分代表乳糖，下层部分代表葡萄糖。培养基中含有硫酸亚铁，如有硫化氢产生，则生成黑色硫化亚铁，使培养基中出现黑色。硫代硫酸钠是一
35、种复原剂，防止培养基中氧化物与H2S 作用而影响 FeS的生成。3、血清学鉴定【材料】沙门菌属、志贺菌属多价诊断血清，生理盐水，载玻片等。【方法】1根据初步鉴定结果，选用相应诊断血清做玻片凝集试验。用接种环自双糖铁培养基上挑取少许菌苔，分别磨匀于生理盐水与相应诊断血清中，摇动玻片1-2分钟，观察结果生理盐水+ 细菌诊断血清+ 细菌2凝集试验阳性者，报告结果；凝集试验阴性者应保留菌种进一步鉴定。【思考题】1、肠道杆菌有何共同特征？2、大肠、变形、痢疾、伤寒杆菌及乙型副伤寒杆菌的鉴别要点是什么？3、如果大肠杆菌、伤寒杆菌、乙型副伤寒杆菌和痢疾杆菌混杂在肉汤培养基中，你怎样把它们别离出来，使各自成为
36、纯培养物? 【附注】痢疾杆菌荧光菌球试验【原理】将相应抗体加在痢疾杆菌的培养液中，虽相互结合， 但细菌不被杀死，在适宜温度下仍能生长，形成痢疾杆菌微小菌团。如在抗体上标记荧光，则形成痢疾杆菌荧光菌球。【材料与方法】1. 将痢疾杆菌接种于含有一定量的荧光抗体的蛋白胨水中，37培养 10小时。2. 蘸取上述培养物接种环于清法玻片上，放上盖玻片，在荧光显微镜下观察。【结果】荧光球大而发亮呈圆球状，结构较疏松， 周围近似卷发状。 随孵育时间增长， 菌球结构致密，周围较圆，整齐，菌球周围有刺毛，孵育时间短时，菌球往往呈多形性。肥达反应精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - -
37、 - - - - -第 20 页，共 22 页【方法】1. 取清洁小试管32支，分成 4排，每排 8支，依次编号。2. 于小试管内各注入0.5ml 生理盐水。3. 于每一排第一管内加入1： 10稀释的患者血清0.5ml ， 用1ml吸管吹吸三次， 混匀，吸出0.5ml注入第二管作对倍稀释，依次稀释至第7管，弃去 0.5ml ，第 8管为对照。4. 从第 8管开始，从后向前，第一排各管内注入伤寒杆菌H菌液 0.5ml ；第二排各管注入伤寒杆菌 O 菌液 0.5ml ；第三排各加入甲型副作寒杆菌H液0.5ml ；第四排各管加入乙型副伤寒杆菌H菌液 0.5ml ；5. 加完菌液后，振荡试管架，混匀，
38、置于56水浴箱 24小时，放冰箱过夜，或放置37水浴箱 18小时后观察结果肥达氏反应操作表单位 :ml 试管1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 7 8 对照生理盐水0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1：10 病人血清0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5弃去诊断菌液0.5 0.5 0.5 0.5 05 0.5 0.5 0.5 血 清 最 终稀释度1： 40 1：80 1：160 1：320 1：640 1： 1280 1： 2560 结果【结果与分析】先观察对照管，正确结果应无凝集现象，再观察各试验管的凝集现象，凝集程度以“+”多少
39、表示之。+最强，上液澄清，细菌全部凝集沉淀于管底。+强，上液轻度混浊，细菌大部分凝集沉淀于管底。+弱，上液混浊，细菌少部分凝集。- 不凝，液体呈乳状与对照管相同。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 21 页，共 22 页效价判定：以能出现“+”凝集现象的血清最高稀释度为该血清的凝集效价。一般认为 O 抗体效价在 1：80以上， H抗体效价在 1： 160以上，有辅助诊断意义。但在分析结果时，应注意以下两点：1首先应了解当地正常人效价，一般凝集价超过正常凝集价时才有诊断意义。2非肠热症患者，由于曾接种过伤寒，副伤寒疫苗或以往在流行区有过隐
40、性感染或患过伤寒， 副伤寒， 近期又感染流感、或布鲁氏菌病时，可产生高效价的H凝集素和较低效价的O凝集素，此种反应称非特异回忆反应，也可呈现阳性结果，其它如结核病、败血症、斑疹伤寒、肝炎等也可出现类似反应。不过，由这些原因所引起的阳性反应主要是H抗体升高， O抗体效价一般不高，同时，每隔57天试血一次，其抗体效价一般不会随病程而升高。上述这些都有别于现症感染。3少数肠热症患者，由于发病初期曾使用大量抗生素，或机体有免疫缺陷病，或机体反应性极弱等原因，抗体效价可以很低，甚至为阴性结果。大约占10% ，故阴性结果不能完全排除肠热症的诊断。4 采血时间不同， 肥达反应的阳性率也不同，发病一周 50% ， 第二周 80% ，第四周 90% 以上，恢复期凝集价最高，以后逐渐下降。一般以双份血清急性期和恢复期比照，凝集价有明显上升者作为新近感染的指标。因此不能只根据肥达氏试验的结果去作简单肯定或否认的结论，必须结合当地流行情况，既往接触史，以及临床症状和体征，作出正确的判断。肥达反应精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 22 页，共 22 页