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1、第一章第一章 微生物的利用微生物的利用实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物课题背景：课题背景：尿素尿素是一种重要的农业氮肥。但是尿素不是一种重要的农业氮肥。但是尿素不能直接被能直接被农作物吸收农作物吸收。只有当。只有当土壤中的细菌土壤中的细菌将尿素分将尿素分解成氨气以后，才能被植物利用。而土壤中的细菌之解成氨气以后，才能被植物利用。而土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶合成脲酶。什么是尿素和脲酶？什么是尿素和脲酶？（NH2）2C=O +H2O脲酶脲酶2NH3 + CO2尿素：尿素：又称又称脲脲，是，是蛋白质降解蛋白质降解的产物。
2、的产物。脲酶脲酶：降解尿素的酶。：降解尿素的酶。如何筛选分解尿素的细菌？如何筛选分解尿素的细菌？原理：原理：培养基中的唯一氮源是尿素，只有能培养基中的唯一氮源是尿素，只有能分解尿分解尿素素的细菌（的细菌（能合成脲酶能合成脲酶）能够在该培养基上正常生）能够在该培养基上正常生长和繁殖。长和繁殖。碳源碳源氮源氮源实验原理实验原理u利用将尿素作为利用将尿素作为唯一氮源唯一氮源的的选择培养基选择培养基分离出能利用尿分离出能利用尿素的细菌，再通过素的细菌，再通过稀释涂布分离法稀释涂布分离法，将该菌分散开来，以，将该菌分散开来，以形成单菌落。形成单菌落。 u细菌合成的脲酶能将尿素分解成细菌合成的脲酶能将尿素
3、分解成NH3，致使，致使 pH 升高，升高，碱性增强，使碱性增强，使酚红指示剂变红酚红指示剂变红。酸碱指示剂：酸黄碱红酸碱指示剂：酸黄碱红例题：例题：下列能选择出下列能选择出分解尿素的细菌分解尿素的细菌的培养基是（的培养基是（ ）A. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿葡萄糖、尿素素、琼脂、水、琼脂、水B. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、葡萄糖、琼脂琼脂、水水 C. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素尿素、琼脂、琼脂、水水D. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏牛肉膏、蛋蛋白胨白胨、琼脂、水
4、、琼脂、水选择培养基：只能以尿素为唯一氮源。选择培养基：只能以尿素为唯一氮源。实验设备及用品实验设备及用品三角瓶、试管和试管架、培养皿、超净台、三角瓶、试管和试管架、培养皿、超净台、移液器移液器、玻玻璃刮刀璃刮刀、酒精灯。、酒精灯。从土壤中采集微生物从土壤中采集微生物土壤采样方法：土壤采样方法：用小铲子用小铲子去除去除5 cm表土表土，取离地面，取离地面5-15cm处的土样处的土样1克，盛于预先克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋灭菌的牛皮纸袋中扎紧。中扎紧。从有哺乳动物排泄物的地方取得从有哺乳动物排泄物的地方取得稀释涂布分离法稀释涂布分离法玻璃刮刀玻璃刮刀Step1：培养基的配制和灭菌：培养基的配制和
5、灭菌全营养全营养LB培养基培养基/25mL尿素培养基尿素培养基/25mL 蛋白胨蛋白胨 0.25g酵母提取物酵母提取物 0.12gNaCl 0.25g琼脂糖琼脂糖 0.5g水水 25 mL葡萄糖葡萄糖 0.025gNaCl 0.12gK2HPO4 0.12g酚红酚红 0.25g琼脂糖琼脂糖 0.5g水水 15mL尿素溶液尿素溶液 10mL特别注意：特别注意：尿素溶液用尿素溶液用G6玻璃漏斗过滤，使之无菌。玻璃漏斗过滤，使之无菌。Step2：倒平板：倒平板将将已灭菌已灭菌的的LB固体培养基和尿素固体培养基固体培养基和尿素固体培养基在酒精灯火在酒精灯火焰旁焰旁分别倒入培养皿中，在超净台上分别倒入培
6、养皿中，在超净台上摇匀摇匀，平放至凝固平放至凝固。冷却至冷却至60Step3：制备细菌悬液：制备细菌悬液1g 土样土样99 mL 无菌水无菌水10-2稀释液稀释液10-3、10-4、10-5稀释液稀释液怎样梯度稀释菌液？怎样梯度稀释菌液？高浓度高浓度低浓度，换枪头低浓度，换枪头微量移液器微量移液器平行重复平行重复每一个稀释度的菌液：接种到每一个稀释度的菌液：接种到3个培养皿中。个培养皿中。Step4：用涂布分离法分离细菌：用涂布分离法分离细菌全营养全营养LB培养基培养基（对照组）（对照组）尿素培养基尿素培养基（实验组）（实验组）10-310-410-5需要倒需要倒3个个LB平板，平板，9个尿素
7、平板个尿素平板重复重复1 重复重复2 重复重复3重复重复1 重复重复2 重复重复3重复重复1 重复重复2 重复重复3取取10-3、10-4和和10-5的土壤稀释液的土壤稀释液各各0.1 mL，分别加到，分别加到有有LB培养基和尿素培养基的培养基和尿素培养基的培养皿培养皿中。中。在在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁打开培养皿，用打开培养皿，用玻璃刮刀玻璃刮刀将菌液涂布将菌液涂布到整个平板上。到整个平板上。70%酒精酒精恒温培养箱恒温培养箱Step5：恒温培养箱中：恒温培养箱中37培养培养培养皿要倒置培养皿要倒置将培养皿倒置，在将培养皿倒置，在37恒温箱中培养恒温箱中培养2448 h。实验结果：实验结果：
8、全营养培养基全营养培养基中有较多的菌落，而中有较多的菌落，而尿素尿素培养基培养基中只有少量的菌落。中只有少量的菌落。Step6：观察培养基中的菌落数：观察培养基中的菌落数Step7：统计菌落数目：统计菌落数目统计菌落数目：统计菌落数目：选择菌落数在选择菌落数在30300的平板计数。的平板计数。每个稀释度取每个稀释度取3个平板个平板取其菌落的取其菌落的平均值平均值。统计的菌落数往往比统计的菌落数往往比活菌活菌的实际数目的实际数目低低。例题：例题：用用稀释涂布平板法稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的测定同一土壤样品中的细菌数细菌数，在对，在对应应稀释倍数为稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计
9、结果，正确的的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是（是（ ） A. 涂布了涂布了一个平板一个平板，统计的菌落数是，统计的菌落数是230 B. 涂布了涂布了两个平板两个平板，统计的菌落数是，统计的菌落数是215和和260，取平均值，取平均值238 C. 涂布了三个平板，统计的菌落数分别是涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和和256，取平，取平均值均值163 D. 涂布了涂布了三个平板三个平板，统计的菌落数分别是，统计的菌落数分别是2l0、240和和250，取平，取平均值均值233例题：例题：稀释涂布平板法稀释涂布平板法分离纯化土壤中微生物的正确操作分离纯化土壤中微生物的正确操作步骤
10、是（步骤是（ ）土壤取样土壤取样称取称取10 g土壤加入盛有土壤加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，制备无菌水的锥形瓶中，制备土壤提取液土壤提取液吸取吸取0.1 mL溶液进行平板涂布溶液进行平板涂布依次稀释至依次稀释至101、102、103、104、105、106、107的稀释的稀释度度 A B C D思考与练习思考与练习（1）为什么要用）为什么要用琼脂糖代替琼脂琼脂糖代替琼脂配制配制固体培养基固体培养基？（2）有）有脲酶脲酶的细菌在的细菌在生态稳态生态稳态上起什么作用？上起什么作用？（3）有脲酶的细菌菌落周围为什么有）有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带着色的环带出现？出现？（4）与全营养
11、培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基）与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上上只有少数菌落只有少数菌落？u琼脂琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物含氮化合物。u能将尿素转化为氨，供植物利用，而对生态系统中能将尿素转化为氨，供植物利用，而对生态系统中N元素的元素的循环循环有重要作用。有重要作用。u细菌合成的脲酶能将尿素分解成细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使，致使 pH 升高，使升高，使酚酚红指示剂变红红指示剂变红。u能利用尿素的细菌在土壤菌群中能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量只占极少数量。例题：（例题：（2012浙江高考）浙江
12、高考）幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（Hp）感染是急慢感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成本并制成菌液菌液后，进行后，进行分离培养分离培养。实验基本步骤如下：。实验基本步骤如下：请回答：请回答：（1）在配制培养基时，要加入）在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂尿素和酚红指示剂，这是因，这是因为为Hp含有含有，它能以尿素作为，它能以尿素作为氮源氮源；若有；若有Hp，则，则菌落周围会出现菌落周围会出现色环带色环带。（2）下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是）下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是灭菌。灭菌。A.高压蒸汽高压蒸汽
13、B.紫外灯照射紫外灯照射C.70%酒精浸泡酒精浸泡 D.过滤过滤脲酶脲酶红红（3）步骤）步骤X表示表示。在。在无菌条件无菌条件下操作时，先将下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液菌液稀释，然后将菌液到培养基平面上。菌液稀到培养基平面上。菌液稀释的目的是获得释的目的是获得菌落菌落。（4）在培养时，需将）在培养时，需将培养皿倒置培养皿倒置并放在并放在中。中。若不倒置培养，将导致若不倒置培养，将导致。（5）临床上用）临床上用14C呼气实验呼气实验检测人体是否感染检测人体是否感染Hp，其基本，其基本原理是原理是Hp能将能将14C标记的标记的分解为分解为NH3和和14CO2。接种接种涂布涂布单（个）单（个）
14、恒温培养箱恒温培养箱无法形成单菌落无法形成单菌落尿素尿素倒平板倒平板平板划线分离平板划线分离练一练，识一识练一练，识一识稀释涂布分离稀释涂布分离接种环接种环玻璃刮刀玻璃刮刀例题：（例题：（2011新课标全国卷）新课标全国卷）有些细菌可有些细菌可分解原油分解原油，从而，从而消除由原油泄漏造成的消除由原油泄漏造成的土壤污染土壤污染。某同学欲从污染的土壤。某同学欲从污染的土壤中筛选出能中筛选出能高效降解原油的菌株高效降解原油的菌株。回答问题：。回答问题：（1）在）在筛选筛选过程中，应将过程中，应将土壤样品稀释液土壤样品稀释液接种于以接种于以 为为唯一碳源唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培的固体
15、培养基上，从功能上讲，该培养基属于养基属于培养基。培养基。（2）纯化菌种时，为了得到）纯化菌种时，为了得到单菌落单菌落，常采用的接种方法有，常采用的接种方法有两种，即两种，即和和。（3）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈分解圈的大的大小，分解圈大说明该菌株的小，分解圈大说明该菌株的降解能力降解能力。（4）通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭）通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有菌方法有灼烧灭菌灼烧灭菌、和和。无菌。无菌技术要求实验操作应在酒精灯技术要求实验操作应在酒精灯 附近进行，以避免周附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。围环境中微生物的污染。（1）原油、）原油、 选择选择 （2）划线法）划线法 涂布法涂布法 （3）强（）强（4）高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 干热灭菌干热灭菌 火焰火焰