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1、 凋亡的概念，与坏死的区别 凋亡信号通路 细胞凋亡相关蛋白、细胞凋亡与疾病 细胞凋亡检测英国英国AberdeenAberdeen大学病理系大学病理系 KerrKerr教授教授19721972年我和年我和WyllieWyllie在研在研究中观察到一种不同于究中观察到一种不同于坏死的细胞死亡方式，坏死的细胞死亡方式，联想到秋日落叶，我们联想到秋日落叶，我们 就把它称作就把它称作Apoptosis Sydney Brenner 1/3 of the prize United Kingdom The Molecular Sciences Institute Berkeley, CA, USA b. 1
2、927(in Union of South Africa)H. Robert Horvit 1/3 of the prize USA Massachusetts Institute of Technology (MIT) Cambridge, MA, USA b. 1947John E. SulstonUnited Kingdom The Wellcome Trust Sanger Institute Cambridge, United Kingdom b. 1942THE 2002 NOBEL PRIZE WINNER王晓东：王晓东： 从事的是细胞凋亡规律从事的是细胞凋亡规律的研究。的研究。
3、20002000年，他和助手年，他和助手们进行了一项实验，研究一们进行了一项实验，研究一种神秘的线粒体蛋白质种神秘的线粒体蛋白质SmacSmac，这种蛋白质可以打破肿瘤的这种蛋白质可以打破肿瘤的“坚硬堡垒坚硬堡垒”，诱使肿瘤细，诱使肿瘤细胞胞“自杀自杀”，对研究治疗癌，对研究治疗癌症方法有重要帮助。从症方法有重要帮助。从19961996年他建立起自己的研究室后，年他建立起自己的研究室后，他的论文成果在他的论文成果在8 8年间被其他年间被其他科学家引用超过了科学家引用超过了1500015000次。次。一、细胞凋亡的基本特征 程序性细胞死亡程序性细胞死亡programmed cell death,
4、 PCD在发育过程中定时出现的生理性刺激诱在发育过程中定时出现的生理性刺激诱导的细胞死亡。导的细胞死亡。用于选择性地清除多细胞动物体内一些无用的或危险的细胞。用于选择性地清除多细胞动物体内一些无用的或危险的细胞。依据形态学不同，程序性细胞死亡可划分为凋亡（依据形态学不同，程序性细胞死亡可划分为凋亡（apoptosis）、自噬）、自噬（autophagy）、肿胀性死亡）、肿胀性死亡3种形式。种形式。细胞凋亡：细胞凋亡：apoptosis 在生理和病理条件下，由基因控制的自主有序的死亡过程。在生理和病理条件下，由基因控制的自主有序的死亡过程。生理条件下，凋亡用以清除单个细胞，继而由巨噬细胞内吞，最
5、后再由溶酶体执行生理条件下，凋亡用以清除单个细胞，继而由巨噬细胞内吞，最后再由溶酶体执行降解功能。降解功能。自噬自噬autophagy:是一种在进化上保守的真核细胞内转运泡的运输机制，它可将细胞是一种在进化上保守的真核细胞内转运泡的运输机制，它可将细胞本身的亚细胞成分如蛋白、胞质或细胞器，通过溶酶体中的水解酶进行消化降解本身的亚细胞成分如蛋白、胞质或细胞器，通过溶酶体中的水解酶进行消化降解和循环。和循环。凋亡和自噬都是细胞内重要的生理过程。凋亡和自噬都是细胞内重要的生理过程。 坏死坏死Necrosis ：各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外各种致病因子，干扰和中和了细胞
6、的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。死亡。诱发因素特定的生理病理因素，药物缺氧、药物、毒素组织分布单个细胞分布成片细胞组织反应形成凋亡小体，被周围组织细胞内容物溶解 细胞吞噬，无炎症反应 释放，有炎症反应 坏死坏死凋亡凋亡细胞体积皱缩变圆，细胞浆失水浓缩肿胀，外形不 规则化细胞膜保持完整，保持完整，形成泡状，凋亡形成泡状，凋亡 破裂破裂 后期内陷包裹核物质和细胞器后期内陷包裹核物质和细胞器 形成凋亡小体形成凋亡小体细胞核核膜完整，核皱缩，染色质固缩核肿胀破裂， 聚集在核膜下，最后核裂成碎片 染色质不规 则外移细胞器大多数保持完整，线粒体肿胀，多受损，溶 通透性增加，释放细胞色素 酶体破裂，线
7、粒体肿胀破裂 凋亡凋亡坏死坏死DNA 阶梯状片段化 随机断裂 磷脂 凋亡早期磷脂酰丝氨酸外翻 外翻 ATP 合成并提供能量 耗竭 凋亡凋亡坏死坏死生物化学：出现出现180-200bp180-200bp大小及其倍数的核苷酸片段，大小及其倍数的核苷酸片段，DNA LADDERDNA LADDER细胞坏死与凋亡的形态区别细胞凋亡的诱发因素细胞凋亡的诱发因素 生理性因素生理性因素 损伤刺激损伤刺激 肿瘤坏死因子家族 病毒感染 FasL、TNF P53 、PTEN 转化生长因子 细胞毒素 细胞癌基因 自由基 神经递质神经递质治疗因素治疗因素 谷氨酸、多巴胺 化疗药物 去除细胞生长因子 紫外线 基质失去粘
8、附特性 中草药 1、 确保正常发育、生长，确保正常发育、生长，根据代谢需要调节细胞数量、保根据代谢需要调节细胞数量、保持成体器官正常体积。持成体器官正常体积。 如：指（趾）间隙的形成如：指（趾）间隙的形成2、 维持内环境稳定维持内环境稳定 如：清除受损、突变或衰老的细胞如：清除受损、突变或衰老的细胞3、 防御功能防御功能 如：使受到病毒感染的细胞凋亡如：使受到病毒感染的细胞凋亡 一、 凋亡相关基因（一）ced基因线虫（c.elegans），1090个体细胞，其中131个细胞在发育过程中产生凋亡，发现14个基因与凋亡有关；且虫体透明，易于观察。1存活基因：存活基因：ced-9： bcl-2蛋白家
9、族蛋白家族 2致死基因：致死基因：ced-4： 凋亡蛋白酶活化因子凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1, apoptosis protease activating factor-1, 3. 致死基因：致死基因：ced-3： Caspase 家族家族(cycteinyl aspartate-specific protease).天冬氨酸特异性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶线虫线虫人类人类Caspase：1996 年年 Alnemri 等统一命名的一类等统一命名的一类与与ICE/Ced-3 同源性同源性半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶。（二）（二）caspase caspase 与细胞凋亡与
10、细胞凋亡1.1.特点：特点：(1) 是一种是一种Cys 蛋白酶蛋白酶(2) 底物底物Asp-X(3) 以酶原形式存在以酶原形式存在(4) 活化的活化的Caspase 特异性水解一套底物，导致不可特异性水解一套底物，导致不可逆的细胞凋亡逆的细胞凋亡(5) 细胞内有细胞内有Caspase抑制剂。抑制剂。 IAP, inhibitors of apoptosis proteins以无活性的形式存在。以无活性的形式存在。在在Pro-Caspases的的NN端均含有一段的前区域端均含有一段的前区域（Prodomain）。活性形式均是由活性形式均是由2 2个大亚基和个大亚基和2 2个小亚基组成的杂四个小亚
11、基组成的杂四聚体。聚体。 一分子一分子Pro-Caspase只能分裂产生只能分裂产生1 1个大亚基和个大亚基和1 1个小个小亚基亚基 。大亚基的大亚基的C C端含有活性中心，其中半胱氨酸（端含有活性中心，其中半胱氨酸（C C）是）是必需氨基酸，故属于半胱氨酸蛋白酶类。必需氨基酸，故属于半胱氨酸蛋白酶类。3. 3. 分类：分类：1414种种 （1）细胞因子前体：）细胞因子前体： caspase caspase 1，4，5， 11，12，13，14 不是凋亡的直接效应分子。不是凋亡的直接效应分子。 （2）凋亡起始分子：）凋亡起始分子： caspase caspase 2，8，9，10 （3）凋亡效
12、应分子：）凋亡效应分子： caspasecaspase 3，6，7 参与介导细胞凋亡。参与介导细胞凋亡。ICE家族成员A：3类caspase：蓝色参与炎症反应，红色为执行者，绿色为启动者；B：caspase-3的结构模型；C：caspase-3的活化过程执行者启动者4. 4. caspase活化：活化：Caspase 酶原有很低的活性酶原有很低的活性若若caspase 过表达，酶原在高浓度下可自身活化过表达，酶原在高浓度下可自身活化Caspase 8，9 含有死亡效应域（含有死亡效应域（death effect domain , , DED），可相互作用，使酶原自身活化。可相互作用，使酶原自身
13、活化。Caspase 8：激活所有酶原激活所有酶原, ,如如: :Caspase 3, ,6, ,7, ,9Caspase 9：活化需线粒体释放活化需线粒体释放Cyt C, 活化后活化后激激 活活Caspase2, 3, ,6, ,8, ,10。 Caspase 3,6,7: 效应效应 Caspase 。（1 1）灭活细胞凋亡抑制蛋白）灭活细胞凋亡抑制蛋白: :鼠鼠: : CaspaseCaspase活化的活化的DNADNA酶酶: Caspase activated deoxyribonuclease, : Caspase activated deoxyribonuclease, CADCAD
14、， 细胞凋亡抑制物：细胞凋亡抑制物：inhibitor of CAD, ICAD ICADICAD与与CADCAD结合，结合，CADCAD无活性，无活性， CaspaseCaspase剪切剪切ICADICAD，ICADICAD失活，失活，CADCAD活化，活化， CADCAD游离，进入细胞核内降解游离，进入细胞核内降解DNADNA。人：人：Hela cellHela cell，DFFDFF（DNA fragment factor)DNA fragment factor) ，与，与ICADICAD同源同源Ca2+/Mg2+ 依赖的核酸内切酶：依赖的核酸内切酶： 多聚多聚ADP-核糖聚合酶（核糖聚
15、合酶（poly ADP-ribose polymerase, PARP）抑制）抑制Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶依赖的核酸内切酶,与基因完整性的与基因完整性的监护有关。监护有关。PARP降解，降解， Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶依赖的核酸内切酶活性增加活性增加，裂，裂解核小体间的解核小体间的DNA，导致细胞凋亡。，导致细胞凋亡。 Caspase（2 2） 降解细胞结构蛋白：降解细胞结构蛋白： 降解核纤层蛋白，肌动蛋白，核分裂相关蛋白降解核纤层蛋白，肌动蛋白，核分裂相关蛋白(3)切割细胞效应蛋白。切割细胞效应蛋白。(4)降解降解其他的其他的caspases6.Caspase活化抑制剂
16、IAP,inhibitorsofapoptosisproteins 细胞内存在的Caspase抑制蛋白，IAPinhibitorsofapoptosisproteins家族，阻止细胞凋亡过程。二、细胞凋亡的诱导发生二、细胞凋亡的诱导发生 细胞凋亡的信号传递细胞凋亡的信号传递 （1）Fas介导细胞凋亡介导细胞凋亡 （2）细胞色素细胞色素C介导的细胞凋亡介导的细胞凋亡 （3 3）粒酶）粒酶GrB诱导细胞凋亡诱导细胞凋亡12DR：死亡受体：死亡受体 death receptors, DR含含DD：死亡结构域，死亡结构域，death domain, DD （DD存在于存在于DR之胞内区，和之胞内区，和
17、FADD蛋白中）蛋白中）FADD蛋白蛋白：Fas相关的死亡结构域，相关的死亡结构域，Fas-associated death domain（FADD蛋白蛋白含有含有DD，DED；可与；可与pro-caspase 8结合）结合）DED：死亡效应结构域，死亡效应结构域，death effecter domain, DED （存在于存在于FADD蛋白、一些起始蛋白、一些起始caspase酶原如酶原如pro-caspase 8中中）（1）死亡受体介导的细胞凋亡（外源性的）FasFas/ /FasLFasLFas-细胞表面细胞表面受体，跨膜蛋受体，跨膜蛋白；白；共4个蛋白1.FasLigand（FasL
18、）是是Fas 的天然配体，两者介导细胞凋亡，的天然配体，两者介导细胞凋亡，Fas L主主要在淋巴细胞膜上表达。要在淋巴细胞膜上表达。2.FasFas /Apo-1存在于细胞表面的特定区域，一旦被存在于细胞表面的特定区域，一旦被Fas L或或Fas抗体激活，可将信号传递到细胞内。抗体激活，可将信号传递到细胞内。 Fas 属肿瘤坏死因子受体属肿瘤坏死因子受体(TNFR)及神经生长因子受及神经生长因子受体（体（NGFR）超家族，）超家族，是细胞凋亡的受体信号，又叫是细胞凋亡的受体信号，又叫死亡分子。死亡分子。Fas 从人从人KT3细胞株分离的细胞株分离的cDNA克隆。克隆。 Apo-1从人从人SKW
19、6.4细胞株分离的细胞株分离的cDNA克隆。克隆。 后来证明两者完全一致，命名为后来证明两者完全一致，命名为Fas/Apo-1，或称，或称CD95。 Fas蛋白位于蛋白位于10q33，编码，编码335AA，成熟，成熟319AA，是跨膜蛋，是跨膜蛋白。白。 由胞外区，跨膜区、胞内区组成。由胞外区，跨膜区、胞内区组成。 胞内区有胞内区有80AA,称死亡结构域（称死亡结构域（death domain, DD）3. FADD蛋白蛋白: Fas相关死亡结构域蛋白：相关死亡结构域蛋白：Fas-associated death domain protein 包括：包括：DD ，死亡结构域死亡结构域 deat
20、h domain DED ，死亡效应结构域死亡效应结构域 death effect domainDeathinducingsignalcomples,DISCFas L与与Fas 结合结合( (同三聚体同三聚体) ) Fas 的的DD成簇，与成簇，与FADD蛋白蛋白结合，结合， FADD 蛋白蛋白活化活化 Caspase 8活化活化 Caspase 3，6，7活化活化 细胞凋亡细胞凋亡（1）Fas介导细胞凋亡死亡诱导信号复合物Deathinducingsignalcomplex,DISC诱导因素诱导因素跨膜电位跨膜电位（ m） PTP开放（通透性转换孔）开放（通透性转换孔）凋亡启动因子（细胞色
21、素凋亡启动因子（细胞色素C，smac，AIF）释出）释出AIF：凋亡诱导因子（2）线粒体相关的细胞凋亡途径（内源性的）现在，提得最多的、比较现在，提得最多的、比较公认的线粒体在凋亡中的公认的线粒体在凋亡中的作用有两点：作用有两点：（1）细胞色素）细胞色素C的释放；的释放；（2）Smac/Diablo 的释放。的释放。CytC释放入胞质 与胞浆接头蛋白Apaf-1结合 Apaf-1寡聚化，募集Caspase9原 Caspase9活化 Caspase2,3,6,8,10活化 细胞凋亡凋亡蛋白酶激活因子凋亡蛋白酶激活因子1，Apoptotic protease activating factor-1
22、5 Fas介导细胞凋亡 Caspase8活化凋亡诱导因子凋亡蛋白酶激活因子EndoG:endonucleaseG核酸内切酶GAIF：ApoptosisinducingfactorsApaf-1:Apoptoticproteaseactivatingfactor-1 线粒体仍有足够的线粒体仍有足够的Cyt C，及其他细胞色素，呼吸链完整，及其他细胞色素，呼吸链完整，产生产生ATP，保证，保证 Caspase 活化活化，细胞凋亡。，细胞凋亡。 Cyt C释放过多，呼吸链破坏，氧消耗，但是不产生释放过多，呼吸链破坏，氧消耗，但是不产生ATP，导，导致细胞坏死致细胞坏死。细胞含有细胞含有caspase
23、抑制剂，不能导致抑制剂，不能导致caspase依赖的细胞凋亡；依赖的细胞凋亡； AKtJNKp53Bcl-2（3）粒酶的基本结构和功能粒酶的基本结构和功能定义：定义：粒酶，粒酶，Granzyme，Gr，是，是CTL和和NK细胞细胞杀杀伤性颗粒中伤性颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称，以酶原形丝氨酸蛋白酶家族的总称，以酶原形式存在。式存在。分类：分类：GrA, GrB, GrH, GrM, 类胰蛋白酶类胰蛋白酶2功能：酶切靶细胞的多种底物蛋白，启动细胞凋亡。功能：酶切靶细胞的多种底物蛋白，启动细胞凋亡。 GrB活性最高，与其他粒酶，穿孔素（活性最高，与其他粒酶，穿孔素（PEN, Perforin）一起
24、储存在）一起储存在CTL的的杀伤颗粒杀伤颗粒中。中。CTL识别靶细胞，杀伤性颗粒移向靶细胞一极（极化） GrB,PEN等蛋白释放入细胞间隙 穿孔素(PEN)协助GrB进入靶细胞，定位在胞浆和胞核 CTL肿瘤细胞肿瘤细胞（1）Caspase依赖途径： GrB切割Caspase10 Caspase3,7,PARP(多聚ADP核糖聚合酶)，Bid，DNA片段化因子(DFF)细胞凋亡GrB确保靶细胞即使缺失1种或几种Caspase成员时，仍能走向凋亡。 切割 DFF，使，使CAD游离，降解游离，降解DNA 结构蛋白结构蛋白Filamin，使细胞骨架破坏，使细胞骨架破坏 PARP，使，使Ca2+/Mg2
25、+依赖的核酸内切酶活依赖的核酸内切酶活性性增加增加，裂解核小体间的，裂解核小体间的DNA 细胞凋亡GrBDFF：DNA片段化因子CAD：caspase活化DNA酶PARP：多聚ADP-核糖聚合酶人：Helacell，DFF（DNAfragmentfactor)，与ICAD同源 GrB切割胞浆Bid，产生活化Bid（tBid） tBid移至线粒体，募集Bax， 诱导线粒体释放CytC，Smac等因子， 细胞凋亡 诱导线粒体开启膜通透性孔道PTP，破坏线粒体内膜电位，损伤线粒体功能，导致细胞死亡。细胞自身蛋白的调控作用（一）P53（二）Bcl-2家族蛋白（三）c-myc（四）IAP家族蛋白抑制凋亡
26、基因：抑制凋亡基因：Bcl-2、IAPs促进凋亡基因促进凋亡基因: Fas 、Bax、P53、双向调控基因双向调控基因: c-myc野生型的P53蛋白是一种包含393AA的转录因子，活性形式为四聚体，自N端起依次包括转录活化区，DNA结合区，四聚体化区，C端调节区。 1. P53表达细胞中的DNA损伤，纺锤丝断裂，癌基因异常激活，缺氧，ATP储备下降等信号都能导致p53表达增加。已发现有数十种p53的相互作用蛋白，P53在胞浆中的含量受到严密的监控。（1）抑制细胞周期p53主要作用于细胞周期的G1/S期，G2/M期等检查点，并引起细胞周期停滞于G1或G2期。p53通过促进p21的表达，抑制如c
27、yclinD-CDK4,cyclinE-CDK2等的活性，引起细胞周期阻滞于G1期。细胞周期负调节因子14-3-3sigma是p53下游靶基因之一，主要通过调节细胞周期的G2/M检查点引起G2期阻滞，且与p21有相互增强作用。细胞周期在细胞周期在G1，G2/M期的停滞为细胞期的停滞为细胞DNA修复提修复提供了时间，供了时间，一旦修复失败一旦修复失败，p53则在其他因素作用则在其他因素作用下，有效诱导细胞凋亡。下，有效诱导细胞凋亡。P53促进一系列细胞凋亡的相关分子的表达如促进一系列细胞凋亡的相关分子的表达如Fas，DR5，Bax，Apaf-1，Noxa， PUMA 等，增加细等，增加细胞对凋亡
28、信号的敏感性。胞对凋亡信号的敏感性。 P53:molecular policeman?（1）Bcl-2家族的结构Bcl-2B cell lymphoma/leukemia-2 两个结构域： 羧基端的跨膜结构域Bcl-2同源结构域（Bcl-2homology,BH）Bcl-2 229aa构成，分布在线粒体内膜，细胞内膜表面，内质网，核膜构成，分布在线粒体内膜，细胞内膜表面，内质网，核膜等处等处Bcl-2 和和C. elegans 中的中的ced-9 有很高的同源性，具有促进细胞存活的功有很高的同源性，具有促进细胞存活的功能能Bcl-2的功能是的功能是延长细胞的寿命，而不是刺激细胞的增殖延长细胞的
29、寿命，而不是刺激细胞的增殖Bcl-2家家族分子族分子结构结构抗凋亡作用，抗凋亡作用，促凋亡作用，有促凋亡作用，有Bax，Bak, BH3 only protein: BcL-2基因家族成员自身或彼此之间有形成二聚体或多聚体的能力，基因家族成员自身或彼此之间有形成二聚体或多聚体的能力，BcL-2家家族的蛋白与蛋白相互作用调节着细胞的存活与凋亡。族的蛋白与蛋白相互作用调节着细胞的存活与凋亡。 因此，Bcl-2表达增加，并不一定抑制凋亡（1）Bax/Bax形成二聚体，形成二聚体，诱导凋亡诱导凋亡（2）Bcl-2/Bax二聚体更稳定，二聚体更稳定，Bcl-2增加，增加， Bcl-2/Bax增加，增加，
30、Bax/Bax减少，减少，抗凋亡抗凋亡。（3）Bcl-xs存在，与存在，与Bcl-2形成二聚体，形成二聚体，Bcl-2/Bax减减 少，少，B Bax/Bax增加，增加，诱导凋亡诱导凋亡(3)Bcl-2抗凋亡机制n直接的抗氧化n抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质n抑制促凋亡的Bax，Bak的作用n抑制Caspases激活n维持细胞钙稳态8q24，编码产物p62，在核内，具有转录因子活性，调节基因转录。功能：促进细胞增殖。c-myc低水平时，细胞生长停滞。c-myc表达，血清生长因子存在时，促进细胞增殖。c-myc表达，血清生长因子不存在时，促进细胞凋亡。 几乎所有肿瘤都有c-myc基因的异常表达（高
31、表达）。 IAP(inhibitorofapoptosisproteins)家族蛋白是细胞凋亡抑制蛋白家族，已发现8个IAP家族成员，NIAP,cIAP-1,cIAP-2，XIAP,survivin,BRUCE,livin,ILP-2（1）IAP直接抑制直接抑制Caspase途径的途径的caspase 3，7，9的活性。的活性。 如在如在Fas/caspase 8 途径中，途径中，IAP抑制抑制caspase 3 活性而发挥抑活性而发挥抑制。制。 在在Cyt C/Apaf-1途径中，途径中， XIAP直接与直接与caspase 9 酶原结合，酶原结合，抑制抑制caspase 9 活化；又结合活
32、化；又结合caspase 3，抑制，抑制caspase 3 作作用。用。 （2）作用于）作用于TNFR介导的信号传导通路，抑制细胞凋亡。介导的信号传导通路，抑制细胞凋亡。作用：第五节 细胞凋亡与疾病 细胞增殖过快及凋亡过少均在肿细胞增殖过快及凋亡过少均在肿瘤的发生中起了重要作用瘤的发生中起了重要作用P53突变，突变，Bcl-2的高表达在许多肿的高表达在许多肿瘤中都存在瘤中都存在BladderBloodBrainBreastColonEsophagusLiverLungSpleenThyroidCancer TypesChemicalsVirusesRadiationMutatep53 Gene
33、生长生长坏死、凋亡坏死、凋亡正常机体正常机体细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病肿瘤、自身免疫性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等病毒感染等 肿瘤肿瘤 肿瘤的重要发病机制肿瘤的重要发病机制: 细胞增殖过度细胞增殖过度 细胞凋亡受抑、死亡不足细胞凋亡受抑、死亡不足 病变组织内细胞存活病变组织内细胞存活 死亡死亡, 肿瘤细胞数目的净增长加大肿瘤细胞数目的净增长加大 可能机制：可能机制：Bcl-2高表达、高表达、IAPs高表达，高表达，P53基因突变基因突变 从发病学上，细胞凋亡实际是机体天然的抗癌机制之一从发病学上，细胞凋亡实际是机体天然的抗癌机制之一神经退行性疾病、造血衰神经退行性疾病、造血衰竭性疾
34、病、竭性疾病、心肌缺血心肌缺血/ /再灌注损伤再灌注损伤 心血管疾病心血管疾病 心肌缺血、缺血心肌缺血、缺血- -再灌伤所致再灌伤所致心肌细胞死亡：心肌细胞死亡： 坏死和凋亡坏死和凋亡 可能机制：氧化应激、钙超载、可能机制：氧化应激、钙超载、p53p53基因激活基因激活 心肌细胞凋亡心肌细胞凋亡造成心肌细胞数量减少也可能是心力衰竭发造成心肌细胞数量减少也可能是心力衰竭发生、发展的主要原因之一生、发展的主要原因之一一、形态学检测（一）HE染色（二）透射电镜观察（三）荧光显微镜观察 凋亡早期，凋亡早期，染色体核边集染色体核边集，在核膜周围边聚形成新月体形，在核膜周围边聚形成新月体形，随之染色体发生
35、固缩，呈电子密度增强，核形不规则。随之染色体发生固缩，呈电子密度增强，核形不规则。 核膜表面凹凸不平，核发生碎裂。核膜表面凹凸不平，核发生碎裂。 细胞体积变小，细胞浆浓缩，其内的细胞器保存较好，或轻细胞体积变小，细胞浆浓缩，其内的细胞器保存较好，或轻度增生。度增生。 线粒体数目轻度增加和轻度肿胀，细胞浆可见空泡增多，线粒体数目轻度增加和轻度肿胀，细胞浆可见空泡增多，细细胞膜保持完整胞膜保持完整。 细胞膜表面微茸毛和伪足减少或消失。细胞膜表面微茸毛和伪足减少或消失。 凋亡晚期，可见膜包裹内有较完整细胞器和细胞核碎片的凋凋亡晚期，可见膜包裹内有较完整细胞器和细胞核碎片的凋亡小体。亡小体。 概概 述
36、述Morphological features of Morphological features of apoptosisapoptosisMembrane blebbing Hoechst33258,Hoechst33342,均为DNA特异性染料，与AT键结合，在pH2.0时优先与RNA结合，染色DNA时应调pH7.0。染料不溶于磷酸缓冲液，所以配制时先必须用蒸馏水溶解，4避光保存。染料对死细胞或70冷乙醇处理的细胞可立即染色，对活细胞的染色是渐进的，在10min内可达到饱和。 （一）琼脂糖凝胶电泳（二）原位末端标记技术原理：染色体从核小体间断裂，为原理：染色体从核小体间断裂，为18020
37、0bp或其倍数组成的寡核苷酸片段。或其倍数组成的寡核苷酸片段。通过提取通过提取DNA，电泳，电泳，UV下，可见下，可见DNA Ladder。观察：凋亡细胞Ladder坏死细胞Smear 操作： 收集细胞，PBS洗涤细胞裂解液酚抽提氯仿异戊醇抽提无水乙醇沉淀TE溶解 电泳 观察观察：凋亡细胞 Ladder 坏死细胞 Smear坏死坏死 凋亡凋亡1 2 3 4 5 M 7 8 9Marker 10000 Marker 10000 bpbp，7500 7500 bpbp，5000 5000 bpbp，2500 2500 bpbp，1000 1000 bpbp，250bp250bpDNADNA电泳电泳
38、原位末端标记是：原位末端标记是： 将渗入到凋亡细胞的将渗入到凋亡细胞的外源性核苷酸（生物素标或荧光外源性核苷酸（生物素标或荧光标）标）在在末端脱氧核苷酸转移酶的末端脱氧核苷酸转移酶的作用下，与断裂的作用下，与断裂的ssDNA或或dsDNA聚合，再通过显色系统显示。聚合，再通过显色系统显示。通常的方法是：末端脱氧核苷酸转移酶介导的通常的方法是：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺缺口末端标记（口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick endlabeling,称称TUNEL）常用的标记和显色系统： 生物素标记的dU
39、TP地高辛标记的dUTP荧光素标记的dUTP 显色系统： 辣根过氧化物酶标记的抗生物素抗体和DAB,辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体和DAB,荧光素标记的dUTP(FITC-dUTP)，流式细胞仪或荧光显微镜观察。 该技术不能区分凋亡、坏死、自溶性死亡的细胞，必须结合凋亡细胞的形态学特征加以判断： 凋亡细胞成单个或少数几个孤立地分布在组织中；凋亡细胞成单个或少数几个孤立地分布在组织中； 具有凋亡细胞的核特征，核固缩，显一个或多个染色体团具有凋亡细胞的核特征，核固缩，显一个或多个染色体团块，或凋亡小体；块，或凋亡小体； 周围或局部无炎症反应周围或局部无炎症反应。 （一）PI单染 （二）Hoech
40、st33342/PI双染色 （三）Annexin/PI双染色 Hoechst33342是双苯并咪唑家族成员，能特异性与是双苯并咪唑家族成员，能特异性与DNA螺旋小沟中螺旋小沟中AT结合。它能被活细胞摄入，也结合。它能被活细胞摄入，也能在摄入后被细胞排出。能在摄入后被细胞排出。活细胞对碘化丙锭（活细胞对碘化丙锭（PI），溴化乙锭（），溴化乙锭（EB）有拒染）有拒染性，当细胞被这些染料着染，提示为晚期凋亡或性，当细胞被这些染料着染，提示为晚期凋亡或坏死。坏死。细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥
41、散到胞浆中，切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。但是细胞膜完整，不能离开细胞。 乙醇固定，乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆弥散出胞外。但是大分子弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。在胞内，不能被抽提。坏死细胞中，坏死细胞中，DNA可染性并不立即下降，甚至反而增加，可可染性并不立即下降，甚至反而增加，可能是由于细胞坏死时部分能是由于细胞坏死时部分DNA变性，引起更多的可染位点。变性，引起更多的可染位点。 收集细胞，PBS洗涤冷70乙醇固定12h以上离心，PBS洗涤，400目筛网过滤PI
42、（含RNase）染色 流式细胞仪检测 操作：判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。（检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死） ABPI单染检测细胞周期改变细胞周期分析（二）Hoechst33342/PI双染色 染料配制：Hoechst33342：配10ug/ml,4避光保存。PI：5ug/ml,4避光保存。 原理： 凋亡细胞膜在早期是完整的，但细胞膜的通透性凋亡细胞膜在早期是完整的，但细胞膜的通透性已有增加已有增加，因此进入早期凋亡细胞的，因此进入早期凋亡细胞的Hoechst比正比正常细胞多；而常细胞多；而EB、PI等不能进入凋亡细胞。等不能进入凋亡细胞。 即即正常细胞不经固定
43、，对正常细胞不经固定，对EB、PI是拒染的。是拒染的。而坏而坏死细胞早期就被破坏，能被这些染料染色。死细胞早期就被破坏，能被这些染料染色。操作：悬浮细胞Hoechst33342，终浓度1ug/ml,贴壁细胞消化后，培养液重悬，加Hoechst，37,7-10min， 离心，洗涤， 加PI，4避光15 min， 400目滤网过滤， 流式细胞仪检测。 结果判断： 在双变量流式细胞仪散点图上 正常细胞Hoechst(-),PI(-)凋亡细胞Hoechst(+),PI(-)坏死细胞Hoechst(+),PI(+) 原理：磷脂酰丝氨酸（原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内侧，）主要存在于细胞膜内
44、侧，细胞凋亡时，它移向细胞外侧。可能是细胞凋亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜内外转膜内外转位酶的早期激活有关。位酶的早期激活有关。Annexin是一种是一种Ca2依赖磷依赖磷脂结合蛋白，对脂结合蛋白，对PS有高度亲和性。有高度亲和性。 PSPS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。 两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死细胞膜完整性受到破坏细胞膜完整性受到破坏, , 可用可用PIPI区分。区分。 消化收集细胞，消化收集细胞，1000 rpm离心离心 6min，弃上清。，弃上清。 加
45、入加入1 mL冷的冷的PBS，轻轻振荡使细胞悬浮，离心，弃，轻轻振荡使细胞悬浮，离心，弃上清。上清。加入加入1 mL冷的冷的1binding buffer，轻轻振荡使细胞悬，轻轻振荡使细胞悬浮，离心，弃上清。浮，离心，弃上清。4. 4. 将细胞重悬于将细胞重悬于200 L 1binding buffer。5. 5. 加入加入10 L Annexin -FITC 和和 5 5 L 碘化丙锭碘化丙锭（PI），轻轻混匀，室温避光反应），轻轻混匀，室温避光反应15 min。加入。加入300 L 1binding buffer，立即上机检测。，立即上机检测。6. 6. 流式细胞仪流式细胞仪Cell Qu
46、est软件分析细胞凋亡和坏死的软件分析细胞凋亡和坏死的百分率。每个样本随机分析百分率。每个样本随机分析 10000个细胞。个细胞。 检测标准：早期凋亡细胞： Annexin -FITC (+)；PI (-)； 坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞： Annexin -FITC (+)；PI (+)； 机械性坏死及非特异性染色： Annexin-FITC (-)；PI (+)； 正常细胞：Annexin -FITC (-)；PI (-)； C-myc ASO200nmol/L亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光（527 nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590 nm）
47、. JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体的膜电位（）具有极性，JC-1依赖于的极性被迅速摄入线粒体内，并形成多聚体，发出红色荧光（590 nm，线粒体）和绿色荧光（527 nm，胞液）. 而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，线粒体内红光强度减弱（590 nm），以单体的形式存在于胞液内而发绿色荧光（527 nm）. 因此在双色滤光片下观察，正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红. Caspase3，6，7的检测我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物50.1 27.9 27.4ApoptosisoflivinASODNonHepG2cellsMTT inhibitory rates: 77.510.47 livin ASODN on HepG2 cells