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1、mef培养个人总结MEF及饲养层的制备(实验记录)MEF及饲养层的制备（实验记录）及饲养层的制备（实验记录）1.MEF的获取：（步骤412已经进行实践）（1）激素处理小鼠同期发情和超数排卵（2）2：1合笼过夜(雌：雄)_r%m)E3Y6i“C4F:b'J_（3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物确定其已经怀孕）的开始记时间为0.5天-U1-b)o_p（4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料（5）颈椎脱臼法处死孕小鼠放于盛有75%酒精的烧杯中消毒拿到超净工作台上解剖先剖开腹部皮肤暴露子宫然后换另外一套手术器械用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角取出子宫置于装有P
2、BS的培养皿中。(6）取出胎鼠在PBS中洗涤数次。去除头、尾、内脏和四肢仅留躯干部。在PBS中充分漂洗弃除红细胞。(用两个镊子配合即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想培养神经干细胞则用剪刀剪取前脑进行培养即可）（可以一起处理多个胚胎）1n.s#$g$（7）在新的培养皿中加入少量PBS放入躯干部分用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点下步的消化时间就可以缩短）。(8）加入24ml0.25%胰蛋白酶培养箱中消化1015min消化结束后加入等体积（多加点也行只要不是少加保证彻底的终止消化反应）的MEFMedium终止消化反应轻轻吹打使细胞分散。（做原代消化的时间稍长胰酶
3、用量也大若是做传代则只需加入500微升最多1ml的胰酶消化13min。）（躯干组织不易消化做原代和传代时故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤组织）原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。）（消化可能不完全也可室温静置510min弃组织块这样下面过滤就相对容易。）（如果消化得到的细胞太少可以离心弃上清洗涤PBS重新加胰酶消化）（胰蛋白酶Trypsin,最适条件pH8.037度溶液中钙镁离子和血清会降低其活力故消化用的胰蛋白酶中加入了EDTA。消化结束时加入含血清的培养基即可终止反应）（9）将收集的细胞悬液离心1500rpm4min弃上清加入红细胞裂解液（35倍体积的细胞体积）轻轻吹打1m
4、in离心除上清若仍有红细胞残留则须继续进行红细胞裂解步骤。(10）离心弃上清重悬细胞过滤（200目筛网）并收集滤液离心除去上清。(11）用MEFMedium洗涤沉淀离心除上清重悬细胞铺板即可。置于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。(一只老鼠会有多个胚胎得到的单细胞可铺到三个培养皿中或者更多的培养皿中进行培养）（12）第二天换液随后每2天换液一次。培养24d后MEF接近汇合即可按1:3比例传代培养。'u3Z9u6w6Ew-q要点:无菌是操作关键,动物皮毛不能直接或间接接触到子宫,分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相同品系小鼠来源的成纤维细胞。要
5、点:仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象,并且检测支原体,确定无污染后传代扩增。2V)G5o.f%D_Y7v,_2.MEF传代（本步骤已经进行实践）（1）消化：吸去培养皿中的MEFMedium用PBS洗涤1次(加5ml)后加入1ml0.25%Trypsin/EDTA37度消化1min（时间可以浮动视消化效果定在显微镜下观察,当少量细胞漂浮,贴壁的细胞层出现裂隙时即可终止反应）。(注：加PBS洗涤是为了除去血清否则胰酶发挥不了作用）2m6,x._')v（2）终止消化：加入5mlMEFMedia终止消化（此时总体积为6ml）用吸管冲洗培养面并反复吹吸使细胞离散成为单细胞悬液。(离心步骤省略
6、：将细胞悬液移入离心管1500rpm4min。弃去上清液用MEFMedia重悬MEF成单细胞悬液。)5q;x'A-M7I7_7&;a”f$_-（3）分装接种：吸取2ml细胞悬液到新的培养皿中（其中已经加了8ml培养基）再取2ml单细胞悬液加到另外一个新的培养皿中（其中已经加了8ml培养基）此时原来的培养皿中还剩余2ml吸取8ml培养基加入其中轻摇37度5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。（1传3其中2个是新的培养皿1个是旧的（原先的）多省啊！100mm的培养皿通常加10ml培养基）2R8q+t7y#0i0AI$v（4）隔一天视生长状况传代。1x)m.s&;B;L/F3y注意:每次传代尽量
7、把成纤维细胞消化、吹打成单细胞悬液.3.冻存MEF（本步骤已经进行实践）#5L:u+;j(h3f%)N7h)M6r5K在P2传P3代时取三分之一的dishes继续进行MEF传代操作另外三分之二进行冻存处理（本实验中P2有27个dishes其中8个继续做传代成24个dishes；另外19个做冻存处理每个dish冻存一管）。(1）取出19dishes吸弃media加PBS洗一次（5ml）。3k&;A%F&;6B$m$R,W4M（2）1mltrypsin下消化1分钟2mlmedia终止消化加加轻轻吹打下细胞并分散均匀收集细胞悬液到15ml离心管中（本次三个dishes收集到一个15ml离心管中）再加
8、1mlPBS冲洗dish并转移到离心管中。(3）封口膜封口放在离心机里1500rpm4度4min离心。与此同时配制冻存液。取出DMSO（二甲基亚砜作冻存剂。本实验室的DMSO是常温下保存在抽屉里的。瓶子是深色的。）喷撒酒精消毒放在实验台上。取两支15ml的离心管每管加9mlmedia然后每管再加1mlDMSO混匀。(4）取出离心机里的离心管喷撒酒精消毒放在实验台上。取一管倾倒去上清加入3ml冻存液（因为要分装到3个冻存管中。冻存管总容量是2ml最大刻度是1.8本实验室通常加1ml冻存液进行保存）轻轻吹打几下混匀细胞。取1ml加入到冻存管中放入冻存盒里（使用的是异丙醇冻存盒。异丙醇在冷冻细胞的过
9、程中可以辅助实现缓慢降温直接从室温放进-80可以达到近似于1度/分钟。异丙醇冻存盒在用之前要室温放置一段时间让其达到室温后再用）。然后再对下一管进行操作。(应尽量避免细胞在常温下与DMSO的接触时间）7E5#/w$r;E)w)r2Y+&;w:o（5）把冻存盒放在80度冰箱里过夜第二天拿到液氮中冻存。（由于液氮罐已满所以保存暂时保存在80度冰箱里）g6G8(e%m8J问题：dishes太多一在消化操作时一定要快否则第一个dish可能消化时间较长影响细胞状态。-R9d)i5H,_,hr'y二加1mlPBS收取余下细胞时会由于量太少易产生很多气泡下次要增加量到2ml。9si'/v%d
10、q;k三冻存液使用的是MEFmedia+10%DMSO这样FBS含量少对细胞状态产生影响下次要增加FBS的含量（适当增加FBS的量有利于提高复苏时细胞的成活率）。(MEFmedia由DMEM11965+10%FBS+1%P/S）'p4S5y)p;x+M0_(m“e(z0-h1Y”K%4.mitomycinC处理MEF并冻存（本步骤已经通过实践）1Z“F%3c_N（1）当P3代MEF生长接近汇合时吸去原培养基用PBS洗2次（每次5ml）然后加入4ml10g/ml的mitomycinC处理MEF细胞置于培养箱内2h。(2）弃去mitomycinC用PBS洗涤2次（每次5ml）。#H$I/T
11、&;%n+n（3）加0.25Trypsin1ml消化1-3分钟用2mlMEFMedia终止反应。轻轻吹打下细胞并把悬液转移到15ml离心管中用2mlPBS洗涤收集余下的细胞。（两个dishes的细胞转移至一个离心管中总体积为5ml_2）2i#p!i9C-u$w1/c+|（4）1500rpm,4度4min离心。与此同时配制冻存液（20mlMEFmedia+2.5mlFBS+2.5mlDMSO）。（此处相对3中冻存液提高了FBS的含量以期维持更好的细胞状态）（5）倾倒去上清加2ml冻存液重悬分装到2个冻存管中每管1ml。标注信息。置于异丙醇冷冻盒中放入80度冰箱中过夜第二天转移到液氮罐中保存。”V
12、%)S8,o;p0I:p:7w3d7f)T4b4s/J$w8注：上面用的mytomicinC可以用MEFmedia(DMEM应该以可以吧)配制也可以用无菌的PBS配制。(MytomicinC是针剂瓶装的10mg/支可以采用无菌PBS溶解配制成1mg/ml装在15ml离心管中锡纸包裹（需要避光）4度保存即可。用时再配制成工作浓度；若是用MEFmedia配制可以直接配制成工作浓度用时直接取用。最好买sigma的。）注意丝裂霉素C的有效期和使用方法。若发现分装的丝裂霉素C溶液析出结晶或溶液由浅蓝色转变成紫红色时,说明丝裂霉素C已经失效,不能再使用。&;k;I!'Z.r'w)_1C8R
13、0B6b&;K:A5.复苏（本步骤已经通过实践）（1）取出冻存管在37度水浴中迅速融化（12min）当有少量冰块剩余时取出用吸水纸拭干水75%酒精喷一下。用（剩少量冰块与完全融化效果差别不大。也可完全融化）（2）用移液枪把冻存液转移至已加有5mlMEFMedia的15ml离心管中1000转度44min离心。(3）2mlMEFMedia重悬转移至加有8mlMEFMedia的100mm培养皿中于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。建筑工程设计个人工作总结三一文库/工作总结/双击可删除页眉建筑工程设计个人工作总结.31doc.特征码IwFOqCKGMbMEFQstVpCA我于_年来到集团建筑设计院
14、工作我通过个月的试用期有幸成为集团的一名员工回顾这几个月来的工作我在公司领导及各位同事的支持与帮助下严格要求自己按照公司的要求较好地完成了自己的本职工作;在此对公司各位领导及各位同事表示衷心的感谢感谢公司给我一个展示自己的机会。通过这段时间的工作与学习在专业技能上、思想上都有了较大的改变现将这几个月以来的工作情况总结如下：一、实习阶段的认识与学习对于刚刚毕业的大学生来说从事设计工作是机遇也是挑战。我有幸成为_集团建筑设计院的一员在刚刚开始工作的这几个月尽快适应了工作的环境融入到设计院这个集体中。在领导及各位同事的关怀、支持与帮助下认真学习钢结构设计知识不断提高自己的专业水平积累经验。这期间主要
15、学习了门式刚架轻型房屋钢结构技术规程、钢结构设计手册、建筑设计规范、结构设计规范等等特别是对于钢结构设计的理念由初步的认识上升到更高层次的水平。这几个月学了提工程量工程量报价门式刚架的设计通过做这些工作对钢结构轻型房屋设计的认识逐步提高各构件的连接与设计更加全面、经济合理。在此期间通过办理资质升级文件整理简单的资料锻三一文库/工作总结/双击可删除页眉认真看图纸、看懂看透熟悉设计规范;第二有些时候工作中比较懒散不够认真积极工作效率有待提高;第三自己的理论水平、专业知识、工作经验还是很欠缺的应当更加努力的学习与实践。建筑工程个人工作总结在以后的工作与学习中自己决心认真提高专业知识水平加强责任心为设
16、计院的快速发展为公司经济跨越式发展贡献自己应该贡献的力量。我想我应努力做到：第一加强学习拓宽知识面。努力学习专业知识与相关的经验多向领导及同事等有经验的人请教。加强对钢结构设计企业培训管理年终工作总结三一文库/工作总结/双击可删除页眉企业培训管理年终工作总结.31doc.特征码mEfzePJwmPOCAIPPCZrP“培训是永不折旧的投资”“培训是企业给员工的福利”。这两句话在企业培训中经常会听到。随着知识和技能在经济社会发展中的作用愈来愈重要如今越来越多的企业都把如何提高企业员工的知识和技能放在了重要位置不断在实际工作中摸索和探讨员工培训的有关问题。从我这几年做培训角度出发我个人认为培训工作
17、要抓好“六个一”建设这就是制定一部符合企业实际的培训制度与流程;组建一支培训管理团队;打造一支高素质的内部培训师队伍;开发一套适合企业实际、容可操作性、知识技能性、趣味性于一体的培训课件;开展一系列符合企业实际的培训模块与培训形式;建立一套科学合理的培训效果评估体系;1、制定一部符合企业实际的培训制度与流程每半年对企业生产、运营中存在的问题进行分析对员工在工作中暴露的问题进行论证并根据培训执行反馈的情况适时修改现有的培训管理制度和培训流程建立一部科学合理的培训制度与培训流程。2、组建一支专业的培训管理团队培训离不开相应的组织离不开强有力的团队因此要组建一支培训管理团队通过开展对培训管理团队成员的一系列相关培训以及举办培训工作研讨会加强培训管理经验的沟通与三一文库/工作总结/双击可删除页眉5、开展一系列符合企业实际的培训模块与培训形式为了便于对培训工作的管理树立全员培训意识建议培训实行分级管理也就是实行三级培训管理一级培训由公司培训主管部门安排培训;二级由各职能系统(如管理类、业务类、技术类、研发类、生产类等)组织员工培训;三级由各车间、职能部门安排培训;在培训模块上根据岗位与工作职责的不同采取多模块的形式如管理知识模块、后备干部队伍建设模块、岗位技能模块、新员工培训模块、企业文化与制度建设模块(员工行为规范、行为准则、管理制度流程)、在职员工第 12 页 共 12 页