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1、课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法样品的处理样品的处理 色谱柱
2、填料的处理和色谱柱的装填。色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。占细胞干重的占细胞干重的5050以上，细胞中含量最多的有机物以上，细胞中含量最多的有机物DNADNA的多样性的多样性 根据蛋白质各种特性的差异，根据蛋白质各种特性的差异，如如分子的形状和大小分子的形状和大小、所带、所带电荷的性质和多少电荷的性质和多少、溶解度溶解度和和吸附的性质吸附的性质和和对其他分子的亲和力对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不等等，可以用来分离不同蛋白质。同蛋白质。问：依据什么来分离和提取蛋白质问：依据什么来分离和提取蛋白质基础知识基础知识阅读并回答（阅读并回答（P64P64） 1 1、凝胶色谱法另一个名称；凝胶色谱
3、法另一个名称； 2 2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据；凝胶色谱法分离蛋白质的依据； 3 3、凝胶的实质；凝胶的实质； 4 4、凝胶色谱法的原理。、凝胶色谱法的原理。基础知识（一）基础知识（一） 凝胶色谱法凝胶色谱法1 1、别名：、别名： 是根据是根据 ，利用具有利用具有网状结构网状结构的凝的凝胶的胶的分子筛分子筛作用作用分离蛋白质的有效方法分离蛋白质的有效方法。3 3、凝胶、凝胶 性质：一些微小的性质：一些微小的 ，球内含许多，球内含许多贯穿的通道；贯穿的通道； 化学本质：化学本质： 实例：实例：（一）（一） 凝胶色谱法凝胶色谱法2 2、依据的特性、依据的特性: :分配色谱法分配色谱法相对分子质
4、量的大小相对分子质量的大小蛋白质相对分子质量的大小蛋白质相对分子质量的大小多孔球体多孔球体多糖类化合物多糖类化合物葡聚糖、琼脂糖葡聚糖、琼脂糖 当不同的蛋白质通过凝胶当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量时，相对分子质量 的蛋白质的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程容易进入凝胶内部的通道，路程较较长长，移动速度，移动速度较慢较慢，而相对分子质，而相对分子质量量 的蛋白质无法进入凝胶的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在内部的通道，只能在 移移动，路程动，路程 ，移动速度，移动速度 ，相，相对分子质量不同的蛋白质因此得以对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。分离。较小较小较大较大凝胶外部凝胶外部较
5、短较短较快较快分离出分离出 的蛋白质。的蛋白质。相对分子质量较大相对分子质量较大原理：原理：（一）（一） 凝胶色谱法凝胶色谱法分离蛋白质分离蛋白质1、缓冲物质有哪些？、缓冲物质有哪些？2、缓冲溶液的作用是什么？、缓冲溶液的作用是什么？3、怎样配制缓冲溶液？、怎样配制缓冲溶液？（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液1 1、缓冲溶液概念、缓冲溶液概念 在一定的范围内，能对抗外来在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱少量强酸、强碱或稍加稀或稍加稀释不引起溶液释不引起溶液PHPH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具具有缓冲作用的溶液有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。叫做缓冲溶液。能够
6、抵制外界的酸或碱的对溶液的能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PHPH值的影响，值的影响，维维持持PHPH基本不变。基本不变。缓冲溶液缓冲溶液基础知识基础知识（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液3 3、缓冲溶液配制、缓冲溶液配制 通常由通常由1 12 2种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在不同就可以制得在不同PHPH范围内使范围内使用的缓冲液。用的缓冲液。 思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲在血红蛋白整个实验室中用的缓冲
7、液是液是磷酸缓冲液磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模，目的是利用缓冲液模拟细胞内的拟细胞内的PHPH环境，保证血红蛋白的正环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）料的科学研究（活性）1 1、概念：带电粒子在、概念：带电粒子在 的作用下发生迁移的过程。的作用下发生迁移的过程。 电场电场2 2、原理：许多重要的生物大分子，如、原理：许多重要的生物大分子，如 等等都具有都具有 ， 在在 下，这些下，这些基团会带上基团会带上 。在电场的作用下，这些带。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其电分子会向着与其 移动。电泳利移动。电泳利用了待
8、分离样品中各种分子用了待分离样品中各种分子 以及分以及分子本身子本身 、 的不同使带电分子产生不同的不同使带电分子产生不同的的 ，从而实现样品中各种分子的分离。，从而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电一定的一定的PHPH所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度( (三三) )电泳电泳3、分类：、分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定测定 通常用十二烷基硫酸钠通常用十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分
9、子质量蛋白质相对分子质量 电泳检测结果电泳检测结果实验操作实验操作阅读课本阅读课本6666页页-67-67页相关内容，思考以下问题：页相关内容，思考以下问题：1 1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？、蛋白质的提取和分离一般分成几步？2 2、洗涤红细胞的目的是什么？怎样洗涤？洗涤干净的、洗涤红细胞的目的是什么？怎样洗涤？洗涤干净的标志是什么？标志是什么？3 3、采用什么方法分离血红蛋白？离心分层后，各层的、采用什么方法分离血红蛋白？离心分层后，各层的成分各是什么？用滤纸过滤，去掉什么成分？成分各是什么？用滤纸过滤，去掉什么成分？4 4、透析目的？、透析目的？ 实验操作实验操作1.1.样品处理：样
10、品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程 1 1、人们用鸡的红细胞提取、人们用鸡的红细胞提取DNADNA，用猪、牛、羊，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞鸡的红细胞具有细胞核具有细胞核，含有，含有DNADNA，便于进行，便于进行DNADNA的提取；的提取；猪牛羊（哺乳动物）成熟的红细胞猪牛羊（哺乳动物）成熟的红细胞无细胞核无细胞核，血红蛋白含血红蛋白含量丰富量丰富便于提取血红蛋白。便于提取血红蛋白。2 2、血液有哪些成分？、血液有哪些成分？1 1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤（1 1）洗涤的目
11、的：）洗涤的目的：（2 2）洗涤方法：）洗涤方法： （3 3）洗涤干净的标志：）洗涤干净的标志：除去杂蛋白（血浆蛋白）除去杂蛋白（血浆蛋白）上清液不再呈现黄色。上清液不再呈现黄色。（一）样品处理（一）样品处理生理盐水生理盐水2 2、血红蛋白的释放、血红蛋白的释放 在在 和和 的作用下，红细胞破裂，的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。释放出血红蛋白。 1 1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤（一）样品处理（一）样品处理蒸馏水蒸馏水甲苯甲苯3 3、分离血红蛋白溶液、分离血红蛋白溶液（1 1）方法：）方法：离心离心（2 2）离心分层后，各层的成分）离心分层后，各层的成分甲苯层甲苯层（3 3）滤纸过滤，除
12、去）滤纸过滤，除去 ，于分液漏斗静置片刻，分出下层的于分液漏斗静置片刻，分出下层的 。脂溶性沉淀层脂溶性沉淀层脂溶性沉淀层脂溶性沉淀层红色透明液体红色透明液体 取取1mL1mL的的血红蛋白溶液血红蛋白溶液装入装入透析袋透析袋中，将透析袋放中，将透析袋放入盛有入盛有300mL300mL的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/L20mmol/L的的磷酸磷酸缓冲液缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析12h12h。4.4.透析透析问：透析过程及问：透析过程及透析目的？透析目的？透析目的是：透析目的是：除去样品中除去样品中分子量较小分子量较小的杂质。的杂质。说明：说明：透析袋是一
13、种透析袋是一种半透膜半透膜，能使小分子自由，能使小分子自由进出，而大分子不能通过。进出，而大分子不能通过。 （二）粗分离（二）粗分离4.4.透析透析实验操作实验操作 （二）粗分离（二）粗分离 阅读课本阅读课本P67-69，了解凝胶色谱的操作过程。，了解凝胶色谱的操作过程。实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作1 1、凝胶色谱柱的制作、凝胶色谱柱的制作2 2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填3 3、样品的加入和洗脱、样品的加入和洗脱2.2.实验操作实验操作(1)(1)样品处理：通过红细胞的洗涤、样品处理：通过红细胞的洗涤、 、 等等操作收集到血红蛋白溶液。操作收集到血红蛋白溶液
14、。(2)(2)粗分离：通过透析去除血红蛋白溶液中的粗分离：通过透析去除血红蛋白溶液中的 较较小的杂质。小的杂质。(3)(3)纯化：通过纯化：通过 分离相对分子质量不同的分离相对分子质量不同的蛋白质。蛋白质。(4)(4)纯度鉴定：用纯度鉴定：用 进行进行样品纯度鉴定。样品纯度鉴定。 搅拌搅拌离心离心相对分相对分子质量子质量凝胶色谱法凝胶色谱法SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳DNADNA粗提取与血红蛋白提取的比较粗提取与血红蛋白提取的比较提取提取物质物质DNADNA血红蛋白血红蛋白提取提取方法方法盐析法盐析法凝胶色谱法、电泳凝胶色谱法、电泳法法提取提取原理原理DNADNA在不同浓度
15、的在不同浓度的NaClNaCl溶溶液中溶解度不同液中溶解度不同DNADNA不溶于酒精，但某些不溶于酒精，但某些蛋白质则溶于酒精蛋白质则溶于酒精根据相对分子质根据相对分子质量的大小量的大小各种分子带电性各种分子带电性质差异质差异步骤步骤溶解在溶解在2 mol/L2 mol/L的的NaClNaCl溶溶液中液中加水稀释至加水稀释至0.14 mol/L 0.14 mol/L NaClNaCl溶液使溶液使DNADNA析出过滤析出过滤2mol/L NaCl2mol/L NaCl溶解溶解加加入冷却酒精析出入冷却酒精析出样品处理样品处理粗提取粗提取纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，
16、对蛋、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较
17、小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较3、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长防止微生物生长 D 防止血液凝固防止血液凝固5、一分子血红蛋白最多可携带的、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数分子数或者或者CO2分子数分别是分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序分层顺序自上而下自上而下是：是：有有机溶剂机溶剂-脂脂类物质类物质-血血红蛋白溶液红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀