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1、酵母细胞的固定化酵母细胞的固定化一、酶制剂存在的缺陷一、酶制剂存在的缺陷1、对强酸、强碱、高温、有机溶剂较敏感，、对强酸、强碱、高温、有机溶剂较敏感，易失活易失活2、溶液中的酶、溶液中的酶难回收，不能再利用难回收，不能再利用，提高，提高了生产成本了生产成本3、反应后、反应后混在产物中，影响产品质量混在产物中，影响产品质量。葡萄糖葡萄糖1、实例、实例生产高果糖浆：生产高果糖浆：葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶果糖果糖将酶固定在一种颗粒状的载体（不溶于水）上，再将酶固定在一种颗粒状的载体（不溶于水）上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的
2、筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。孔，而反应溶液却可以自由出入。二、二、固定化酶的应用实例固定化酶的应用实例2、固定化酶优点：、固定化酶优点：酶既能与反应物接触，又能与产物酶既能与反应物接触，又能与产物分离分离可被可被反复利用反复利用3、固定化酶缺点：、固定化酶缺点：不利于催化一系列的酶促反应不利于催化一系列的酶促反应一一种酶只能催化一种种酶只能催化一种化学反应。在化学反应。在生产实际中很多生产实际中很多产物的形成都通过产物的形成都通过一系列的酶促反应一系列的酶促反应才能进行，所才能进行，所以操作比较麻烦以操作比较麻烦。可采
3、用固定化细胞技术可采用固定化细胞技术解决方法：解决方法：三、固定化细胞技术三、固定化细胞技术1、固定化细胞的优点：、固定化细胞的优点：成本更低，操作更容易（不需要提取细胞中酶）成本更低，操作更容易（不需要提取细胞中酶）对酶的活性影响小对酶的活性影响小可以催化一系列的化学反应。可以催化一系列的化学反应。2、固定化细胞的缺点：、固定化细胞的缺点：反应物不易与酶接近，尤其是大分子物质，反应物不易与酶接近，尤其是大分子物质，反应效率下降反应效率下降思考：固定化酶与固定化细胞技术，哪种方法更容易？思考：固定化酶与固定化细胞技术，哪种方法更容易？固定化细胞技术更容易固定化细胞技术更容易不需要提取细胞中的酶
4、，所以固定化细胞技不需要提取细胞中的酶，所以固定化细胞技术成本更低、操作更容易、能连续生产。术成本更低、操作更容易、能连续生产。思考：固定化酶与固定化细胞，哪种对酶活性影响小？思考：固定化酶与固定化细胞，哪种对酶活性影响小？固定化细胞对酶活性影响小固定化细胞对酶活性影响小细胞结构完整，保证细胞内各种化学反应正常进细胞结构完整，保证细胞内各种化学反应正常进行（反应物质进入细胞，酶在细胞内发挥作用）行（反应物质进入细胞，酶在细胞内发挥作用）思考：固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？思考：固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？一系列酶一系列酶思考：如果反应物是大分子，最好用什么方法？思考：如果反应
5、物是大分子，最好用什么方法？固定化酶固定化酶大分子一般不能进入细胞内大分子一般不能进入细胞内思考：若想将微生物发酵过程变成连续的酶促，选哪种思考：若想将微生物发酵过程变成连续的酶促，选哪种方法？方法？固定化细胞技术固定化细胞技术网格型网格型微囊型微囊型四、四、固定化技术固定化技术1、概念：、概念：利用物理或化学法，将酶或细胞固利用物理或化学法，将酶或细胞固定定在一定空间在一定空间内内2、常用方法：、常用方法：包埋包埋法：法：将酶或细胞包埋在不溶于水的多孔将酶或细胞包埋在不溶于水的多孔性载体中性载体中化学结合法：化学结合法：利用共价键或离子键，将利用共价键或离子键，将酶或细胞相互结合，或将酶或细
6、胞相互结合，或将其结合到载体上其结合到载体上物理吸附法：物理吸附法：将酶或细胞固定到纤维素、琼脂糖、多将酶或细胞固定到纤维素、琼脂糖、多孔玻璃、离子交换树脂等载体上孔玻璃、离子交换树脂等载体上酶分子很小酶分子很小，易，易从包埋材料中漏出。从包埋材料中漏出。细胞体积大细胞体积大，难以，难以被吸附或结合。被吸附或结合。思考：固定化酶或固定化细胞适合采取哪种思考：固定化酶或固定化细胞适合采取哪种固定化方法？固定化方法？包埋法：包埋法：化学结合法：化学结合法：物理吸附法：物理吸附法：固定化酶固定化酶（细胞体积大，（细胞体积大，很难被吸附或结合）很难被吸附或结合）固定化细胞固定化细胞（酶体积小，容易从（
7、酶体积小，容易从包埋材料中漏出）包埋材料中漏出）固定化固定化方法：方法：固定化酶固定化酶酶的种类：酶的种类： 一种一种所需条件：所需条件： 适宜的温度、适宜的温度、PH固定化细胞固定化细胞酶的种类：酶的种类：一系列一系列所需条件：所需条件：适宜的温度、适宜的温度、PH、溶解氧、溶解氧、营养物质营养物质总结：总结：项目项目直接使用酶直接使用酶固定化酶固定化酶固定化细胞固定化细胞酶的种类酶的种类制作方法制作方法营养物质营养物质催化反应催化反应反应底物反应底物缺点缺点优点优点一种或几种一种或几种一种一种一系列酶一系列酶无无化学结合法化学结合法物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法否否否否是是单一或多种单一
8、或多种单一单一一系列或多种一系列或多种大、小分子大、小分子大、小分子大、小分子小分子物质小分子物质对环境敏感，对环境敏感，易失活；难回易失活；难回收、成本高、收、成本高、影响产品质量影响产品质量不利于催化不利于催化一系列的酶一系列的酶促反应促反应反应物不易与反应物不易与酶接近，尤其酶接近，尤其是大分子，反是大分子，反应效率下降应效率下降催化效率高、耗催化效率高、耗能低、污染低能低、污染低既能与反应物既能与反应物接触，又能与接触，又能与产物分离；可产物分离；可以重复利用以重复利用成本低、操作成本低、操作容易，能催化容易，能催化一系列反应一系列反应例：利用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆过程，正确例
9、：利用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆过程，正确的是的是A.A.固定葡萄糖异构酶时，采用方法固定葡萄糖异构酶时，采用方法2 2比方法比方法3 3对酶活性影对酶活性影响要小响要小B.B.在生产中，需严格控制好在生产中，需严格控制好PHPH、温度、溶解氧等因素、温度、溶解氧等因素C.C.在生产中，通过控制阀调节果糖流出的速率以保证反在生产中，通过控制阀调节果糖流出的速率以保证反应充分进行应充分进行D.D.由于固定化葡萄糖异构酶活性不会降低，此反应柱可由于固定化葡萄糖异构酶活性不会降低，此反应柱可持续用于生产持续用于生产C C例：下列关于固定化酶和固定化细胞叙述，正确的是例：下列关于固定化酶和固定化细
10、胞叙述，正确的是A.A.反应产物对固定化酶的活性没有影响反应产物对固定化酶的活性没有影响B.B.实验室常用吸附法固定化酵母细胞实验室常用吸附法固定化酵母细胞C.C.若发酵底物是大分子，则固定化细胞优于固定化酶若发酵底物是大分子，则固定化细胞优于固定化酶D.D.固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显D D例：多酶固定化技术是将多种酶共同固定在一起的技术，例：多酶固定化技术是将多种酶共同固定在一起的技术，经多酶共同固定化技术固定在一起的酶称为多酶共固定经多酶共同固定化技术固定在一起的酶称为多酶共固定化体系，错误的是化体系，错误的是A.A.与游离的酶
11、催化化学反应相比，固定化酶具有可重复与游离的酶催化化学反应相比，固定化酶具有可重复利用的优点利用的优点B.B.与单酶固定化相比，多酶共固定化体系具有催化一系与单酶固定化相比，多酶共固定化体系具有催化一系列酶促反应的优点列酶促反应的优点C.C.与固定化细胞相比，多酶共固定化体系具有与底物充与固定化细胞相比，多酶共固定化体系具有与底物充分接触的优点分接触的优点D.D.与固定化细胞相比，多酶共固定化体系需要营养物质与固定化细胞相比，多酶共固定化体系需要营养物质来维持酶的活性来维持酶的活性D D五五、实验操作、实验操作酵母细胞的固定化酵母细胞的固定化（无菌条件（无菌条件下进行）下进行）将酵母细胞包埋将
12、酵母细胞包埋在不溶于水的多孔性载体在不溶于水的多孔性载体中中思考：包埋法常用哪些载体？思考：包埋法常用哪些载体？明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等一种天然一种天然多糖多糖（一）制备固定化酵母细胞（一）制备固定化酵母细胞1、酵母、酵母细胞的活化细胞的活化：1g干酵母干酵母10mL蒸馏水蒸馏水50mL烧杯烧杯搅拌均匀搅拌均匀放置放置1h，使之活化。，使之活化。在缺水状态下，微生物处于在缺水状态下，微生物处于休眠状态休眠状态。让休眠让休眠状态的微生物重新恢复状态的微生物重新恢复正常生活状态正常生活状态。思考：活化是思考：活化是指什么？指什
13、么？活化活化时时体积变体积变大大，应选择，应选择体积足够大的容器体积足够大的容器，避免溢出避免溢出操作注意：操作注意：吸胀作用吸胀作用吸水（注意与渗透作用吸水的区别）吸水（注意与渗透作用吸水的区别）2、配制物质的量浓度为、配制物质的量浓度为0.05mol/L的的CaCl2溶液溶液0.83gCaCl0.83gCaCl2 2150mL150mL蒸馏水蒸馏水200mL200mL烧杯烧杯溶解备用。溶解备用。思考：为什么思考：为什么要用蒸馏水，而不用自来水？要用蒸馏水，而不用自来水？防止自来水防止自来水中各种离子影响实验结果中各种离子影响实验结果CaCl2作用：作用：使使胶体聚沉、形成稳定的凝胶珠胶体聚
14、沉、形成稳定的凝胶珠（海藻酸海藻酸钠与钠与Ca2+可迅速发生离子交换生成凝胶，可迅速发生离子交换生成凝胶，让液让液滴形成凝胶珠）滴形成凝胶珠）与海藻酸钠反应形成凝胶珠（凝固剂）与海藻酸钠反应形成凝胶珠（凝固剂）3、配制海藻酸钠溶液：、配制海藻酸钠溶液： 最重要环节最重要环节0.7g海藻酸钠海藻酸钠10mL水水50mL烧杯烧杯酒精灯微酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化蒸蒸馏水定容到馏水定容到10mL。思考：为什么思考：为什么要用要用小火间断小火间断加热，加热，并且不断搅拌并且不断搅拌防止海藻酸钠发生焦防止海藻酸钠发生焦糊糊小火间断小火间断加热加热
15、，并搅拌，反复几次，直到海，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止藻酸钠溶化为止操作注意：操作注意：思考：海藻酸钠作用？思考：海藻酸钠作用？ 包埋剂包埋剂4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液冷却至室温冷却至室温，与酵母细胞混合，与酵母细胞混合（防止高温杀死酵母细胞）。（防止高温杀死酵母细胞）。混合后，将混合液转移至注射器中。混合后，将混合液转移至注射器中。以以恒定的速度缓慢恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加的将注射器中的溶液滴加CaClCaCl2 2溶液溶液中，将形成的凝胶珠在中，将形成的凝胶珠在CaClCaCl2 2溶液中浸泡溶液中浸泡30
16、min30min左右左右。思考：思考： CaClCaCl2 2溶液有什么作用？溶液有什么作用？使胶体聚沉使胶体聚沉，形成稳定的凝胶珠。，形成稳定的凝胶珠。刚刚形成的凝胶珠应在形成的凝胶珠应在CaClCaCl2 2溶液中浸泡一段溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构时间，以便形成稳定的结构。盐盐离子的电荷与胶体微粒电荷相互吸引，形成更大的胶体离子的电荷与胶体微粒电荷相互吸引，形成更大的胶体颗粒颗粒5 5、固定化酵母细胞：、固定化酵母细胞：滴加注射器滴加注射器中溶液中溶液时，时，速度要速度要恒定缓慢恒定缓慢且且不能离不能离CaClCaCl2 2液面的太近液面的太近，以便，以便形成的凝胶珠呈均匀的圆
17、形形成的凝胶珠呈均匀的圆形或椭圆形。或椭圆形。操作注意：操作注意：或乳白色或乳白色若海藻酸钠若海藻酸钠浓度过低：浓度过低：凝胶珠包埋的酵母细胞较少，酵凝胶珠包埋的酵母细胞较少，酵母细胞容易漏出；母细胞容易漏出；凝胶珠颜色过浅。凝胶珠颜色过浅。滴速太快；滴速太快；距离液面太近；距离液面太近；海藻酸钠浓度过高海藻酸钠浓度过高（易破裂）（高浓度海藻酸钠不（易破裂）（高浓度海藻酸钠不易呈滴状落下）易呈滴状落下）凝胶珠不是圆或椭圆形的原因：凝胶珠不是圆或椭圆形的原因：观察凝胶珠的颜色和形状：观察凝胶珠的颜色和形状：检测检测凝胶珠是否合格：凝胶珠是否合格：挤压法：不容易破裂挤压法：不容易破裂摔打法：容易弹
18、起摔打法：容易弹起浅黄色或乳白色、浅黄色或乳白色、圆形或椭圆形圆形或椭圆形（二）用固定化酵母细胞发酵（二）用固定化酵母细胞发酵1、用蒸馏水冲洗凝胶珠、用蒸馏水冲洗凝胶珠23次：次：洗掉凝胶珠表面的洗掉凝胶珠表面的CaCl2溶液和杂溶液和杂菌菌（防止凝胶珠硬度过大，影响通透性）（防止凝胶珠硬度过大，影响通透性）2、用固定好的酵母细胞发酵：、用固定好的酵母细胞发酵：葡萄糖溶液中葡萄糖溶液中气泡（气泡（CO2）：可用澄清石灰水检测）：可用澄清石灰水检测酒味（酒精）：可用酸性重铬酸钾检测酒味（酒精）：可用酸性重铬酸钾检测也可用培养液冲洗：有利于保持细胞活性也可用培养液冲洗：有利于保持细胞活性例：下列关
19、于酵母细胞的固定化技术实验，正确的是例：下列关于酵母细胞的固定化技术实验，正确的是A.A.活化酵母时，将适量干酵母与蒸馏水混合并搅拌成糊活化酵母时，将适量干酵母与蒸馏水混合并搅拌成糊状状B.B.配制氯化钙溶液时，需要边小火加热边搅拌配制氯化钙溶液时，需要边小火加热边搅拌C.C.将海藻酸钠溶液滴加到氯化钙溶液时，凝胶珠形成后将海藻酸钠溶液滴加到氯化钙溶液时，凝胶珠形成后应即刻取出应即刻取出D.D.海藻酸钠溶液浓度过高时凝胶珠呈白色，过低时凝胶海藻酸钠溶液浓度过高时凝胶珠呈白色，过低时凝胶珠易成蝌蚪状珠易成蝌蚪状A A例：正确的是例：正确的是A.5%A.5%海藻酸钠比蒸馏水活化酵母细胞效果好海藻酸
20、钠比蒸馏水活化酵母细胞效果好B.B.酒精灯小火间断加热使海藻酸钠溶化后需要注意定容酒精灯小火间断加热使海藻酸钠溶化后需要注意定容C.C.将溶化后的海藻酸钠立即与活化的酵母菌混合将溶化后的海藻酸钠立即与活化的酵母菌混合D.D.以恒定速度将注射器中的胶液滴加到氯化钙溶液中即以恒定速度将注射器中的胶液滴加到氯化钙溶液中即可获得规则的凝胶珠可获得规则的凝胶珠B B例：人工种子部分流程图，正确的是例：人工种子部分流程图，正确的是A.A.胚状体是外植体在培养基上脱分化形成的一团愈伤组胚状体是外植体在培养基上脱分化形成的一团愈伤组织织B.B.该过程以海藻酸钠为营养成分，以氯化钙为凝固剂该过程以海藻酸钠为营养成分，以氯化钙为凝固剂C.C.可在海藻酸钠溶液中加蔗糖，为胚状体提供碳源可在海藻酸钠溶液中加蔗糖，为胚状体提供碳源D.D.包埋胚状体的凝胶珠能够隔绝空气，有利于人工种子包埋胚状体的凝胶珠能够隔绝空气，有利于人工种子的储藏的储藏C C