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1、实验pH对酶活性的影响和最适pH的测定一、 实验目的1、了解pH对酶的活性的影响机理；2、掌握如何选择酶催化反应的最适pH和获得最适pH条件的确定。二、 实验原理酶的生物学特征之一是它对酸碱的敏感性，这表现在酶的活性和稳定性易受环境pH的影响。pH对酶的活性的影响极为显著，通常各种酶只在一定的pH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH值下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。各种酶在特定条件下都有它各自的最适pH。在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其他条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横坐标，反应速度为纵坐标作图。由此曲线
2、，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适pH。三、 实验器材与试剂1、试剂：磷酸氢二钠、乙酸钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、乙酸。2、器材：可见分光光度计、恒温水浴锅、试管、酸度计四、 操作步骤1. 配置缓冲溶液按下表配置缓冲溶液，其溶液pH值以酸度计测定值为准。管号0.2mol/L磷酸氢二钠（ml）0.1mol/L柠檬酸钠(ml)缓冲液pH14.304.525.154.845.036.613.396.247.722.286.859.080.927.469.720.288.02. 反应液的配方准备二组各6支试管，第一组6支试管中，在每支都加入4.5ml上表中相应的缓冲液，然后加入
3、一定量浓度的6.5%蔗糖酶溶液1.0ml（此时的蔗糖酶只能用H2O稀释，酶的稀释倍数和加入量要选择适当，以便在当时的实验条件下能得到0.6-1.0的光吸收值A520。另一组6支试管也是每支都加入4.5ml上表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分别作为测定时的空白对照管。所有的试管都用水补足到5.0ml。3. 终止反应所有的试管按一定时间间隔加入0.5ml蔗糖（6.5%）开始反应，反应5min后分别加入5.0ml0.1mol/LNaOH溶液，在按测定酶活力的程序操作，测出A520。五、 结果与分析以反应速度（葡萄糖量.min-1）为纵坐标，以pH为横坐标，绘制下蔗糖酶活性与pH的关系曲线。分析曲线并确定蔗糖酶的最适pH或pH范围。2性 围范 和适的适定线。的曲测 与活下标为 坐）-.量（分 作序活测，溶 .入后 应应始%（ .加间一管反 到水管有管对的为别水离入酶不液的中 入每管试一 吸0 .下件时便当选入和稀， 能的（ .糖 浓入后液的相 加每管 一试 配的. . 0. . . . 檬/ （二磷 管准为计酸 溶溶缓溶溶步度、管水恒度见：酸、柠氢二钠钠氢：试材 适的以且情变 速解可，曲由坐度应，为以速应定条 ，恒其保，的性 一制一学进 最自有件定种 最称 时性其，的表 的酶种性表内 定只各著极的的对响的环性和的在，敏的它之物原定的件适获 应化选握理响的酶 目