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1、GUS组织化学染色1. 实验原理适宜的反应条件下，-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。2 实验材料1）转基因烟草叶片或试管苗2）非转基因烟草的叶片或试管苗（阴性对照）3 药品试剂1)X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液，分装成每管100L，保存于-20。2)底物溶液（染色液）：3)1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液（pH=7.0）,缓冲液中含10mM EDTA-Na2，1-5mM K3Fe(CN)6(铁氰化钾)，1-5mM K4Fe(CN)6(亚铁氰化钾)，0.001%（V
2、/V）Triton X-1004 实验器材小药瓶，培养皿，培养箱（37），微量移液器5 实验步骤1)将准备好的叶片放入小药瓶，加入染色液浸没试材，封好盖子；2)37培养箱中温育1小时至过夜；3)将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。6 结果叶片上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。 先用DMSO溶解X-GLUC 好像是100mg/2ml PBF 94ML+X-GLUC 0.1ML+TRITION X-100 2ML +FE2+ 2ML+ FE3+ 2ML http:/ag.udel.edu/plsc/labs/sherrierlab/
3、Methods_pdf/microscopy/Protocol%20for%20Fluorescent%20GUS%20Staining%20of%20Root%20Nodules.pdfhttp:/www.oardc.ohio-state.edu/stockingerlab/Protocols/GUS-HistochemicalStaining.pdfhttp:/dps.plants.ox.ac.uk/langdalelab/protocols/misc/Dex_induc_GUS_stain.pdfGus staining 1. Excise root and leaf segments,
4、 wash with 100mM potassiumphosphate buffer (pH7.0) for 3 times.2. Immerse in the Gus substrate solution, 37C, dark, 12-24h3. Rinse in phosphate buffer4. Fix for 4h or longer5. Rinse in the same buffer6. Observe as whole specimens or as sections.1M potassium phosphate buffer (pH7.0)K2HPO4: 34.8g -200
5、mlKH2PO4: 27.2g-200ml184.5ml K2HPO4+115.5ml KH2PO4- 300ml 1M potassium phosphate buffer(pH7.0)Gus substrate solutionVolume(500ml)Final concentrationPotassium ferricyanide 82mg0.5mMPotassium ferrocyanide105.6mg0.5mMPotassium phosphate buffer (pH7.0, 1M)50ml100mMStore at -20C. Add 1mM x-gulc (MW521.80
6、.5mg/ml) freshly when use.Fix solution2.5% glutaraldehyde200mM sodium cacodylate, pH7.2 共培养后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用GUS组织化学法测定.将待测定的材料,如愈伤或叶片,浸入适量X-Gluc溶液,于37 保温过夜后,在体视显微镜下观察,拍照记录.若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空,染色效果将更好.如材料存在色素干扰问题,染色后用酒精脱色,使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存.X-Gluc染色液：（20*）0.2mol/LNa3PO4缓冲液(62mL0.2mol/LNa2HPO4
7、;38mL0.2mol/LNaH2PO4)，pH7.0； 0.1 mol/L K3Fe(CN)6;0.1 mol/L K4Fe(CN)6.3H2O;1.0 mol/L Na2EPTA;0.1% X-Gluc. 1000mlx-gluc 1000mg （20ml dmso）Na2HPO4: 620*0.2*M=0.620*0.2*358（12H2O）=44NaH2PO4: 380*0.2*M=0.358*0.2*156（2H2O）=11 K3Fe(CN)6:1000*0.01*M=32926*0.01=3.3 K4Fe(CN)6:1000*0.01*M=42239（3H2O）*0.01=4.2T
8、riton 1MLNa2EPTA:1000*0.1*M=372.24(2H2O)=37 1. 取5 mg X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide)溶於100 l DMSO於中. 2. 加入10 ml reaction buffer (10 mM Na2EDTA, 100 mM NaH2PO4H2O, 0.1% Triton, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, pH 7.0). 3. 混合均匀后分装於eppendorf tube中,保存於-20冰箱内.
9、100ml x-gluc染液配制x-gluc 50mg加入溶入1ml dmso1ml triton 100Na2EDTA (20mM) 10mM 5ml ; K3Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5mlK4Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml ; Na2HPO4 (0.2M) 100mM 3.1mlNaH2PO4 (0.2M) 100mM 1.9ml X-Gluc 0.1% 10ul5染 % 原 00 0 反 条 0葡 糖 0（ . ) 将 ( 水( 成 0质) 此 0 部 或 呈 色配液 - 点.，箱0-肉,中 镜 观装均.。. 实 料 ）0, 转 叶 试0管 %.,）
10、基 草 0片 管 阴 入.照 0於) 药 剂 - - 用 = 二. .酰* 的 .液 .*装 = 000: 保.于=. 0 000 = 液 （ . 液 = 0 ） 0. = 0 加: 0 0磷 0缓 液 .=- . 冲 液 .)( 0 - ； . ; )/ .( 氰液冲 -*0液 染 存成使色的 使 精后,问素存铁如更色空抽，液0 -加0将照察镜 显,夜 液 - 量入片 如,测0将法织 定的 基以的性材达瞬愈药后 ，. , ， （ ） 量 . ( - 0 0 . .0 + + + 好 溶 。点或现呈部性 叶 色料对至，绿次 中%或 材过将)；过时中培 )；好，浸染入药片的将骤实 器 ( _ / / . ./ _ _ _/ / /. /: . / . / . - . ./: . 0 00% 0 0 % / . / 0 % % 0 % 0 / 0 0 - . 0-. - : . . . . 0 ,