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1、关于免疫组织化学染色技术第一张，PPT共九十四页，创作于2022年6月第一节第一节常规组织学染色技术概述常规组织学染色技术概述 宏观宏观微观微观超微结构超微结构基因水平基因水平组织形态学研究技术的种类：组织形态学研究技术的种类：一、病理大体组织标本的染色方法一、病理大体组织标本的染色方法在在标标本本制制作作中中，为为了了某某种种特特殊殊目目的的，突突出出显显示示标标本本的的重重要要部部分分，借借助助组组织织切切片片的的特特殊殊染染色色方方法法对对标标本本进进行行染染色色，将将病病变变器器官官及及不不同同组组织织成成分分用用染染料料染染成成不不同同的的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特点
2、，如：颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特点，如：脂肪组织染色法脂肪组织染色法目目的的：主主要要用用于于心心、肝肝、肾肾脂脂肪肪变变性性，动动脉脉粥粥样样硬硬化化大大体标本的染色体标本的染色第二张，PPT共九十四页，创作于2022年6月 试剂：苏丹试剂：苏丹或苏丹或苏丹结果：病变处脂肪组织呈橙黄色结果：病变处脂肪组织呈橙黄色 早期心肌梗死染色法早期心肌梗死染色法目的：显示早期心肌梗死的区域目的：显示早期心肌梗死的区域试剂：试剂：0.1%NBT(硝基四唑蓝硝基四唑蓝)/0.2mol/LPBS(pH7.6)方法：将方法：将2-3mm厚新鲜心肌大片放入试剂中，厚新鲜心肌大片放入试剂中，37C孵
3、育孵育20min。结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。注意注意：新鲜标本，尸检心肌不超过：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。小时。第三张，PPT共九十四页，创作于2022年6月二、光学显微镜下的组织学染色方法二、光学显微镜下的组织学染色方法常规常规HE染色（染色（hematoxylinandeosinstaining）组织学特殊染色组织学特殊染色1.Mallory三染色、三染色、Masson三染色三染色2.神经纤维的镀银染色神经纤维的镀银染色3.其其他他的的特特殊殊染染色色，包
4、包括括钙钙、铁铁、铅铅、铜铜、黑黑色色素素和和脂脂褐褐素素、细细胞胞DNA和和RNA的染色等的染色等上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形态改变。上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形态改变。三、超微结构的观察三、超微结构的观察光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2 m有效放大倍数最高不超过有效放大倍数最高不超过2000倍。倍。电镜的分辨率最佳可达电镜的分辨率最佳可达0.14nm，放大倍率最高可达，放大倍率最高可达100万倍。万倍。第四张，PPT共九十四页，创作于2022年6月 第二节第二节免疫组织化学染色技术免疫组织化学
5、染色技术Immunohistochemicaltechnique该该技技术术主主要要是是用用于于研研究究和和观观察察细细胞胞中中的的某某些些结结构构或或分分子子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术。根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为：根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为：1.免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术2.免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术3.免疫铁蛋白技术免疫铁蛋白技术4.免疫金免疫金-银细胞化学技术银细胞化学技术5.免疫电子显微镜技术免疫电子显微镜技术第五张，PPT共九十四页，创作于2022年6月一
6、、免疫组织化学染色方法的原理一、免疫组织化学染色方法的原理抗原（抗原（antigen）1.定定义义：是是一一类类在在适适合合条条件件下下能能激激发发机机体体免免疫疫系系统统发发生生免免疫疫应应答答，并并能能与与免免疫疫应应答答产产生生的的效效应应物物质质（抗抗体体和和效效应应细细胞胞）在在体体内内或或体体外外发发生生特特异异性性结结合合反反应应的的物物质质。抗抗原具有两种性能原具有两种性能：（1）免免疫疫原原性性（immunogenicity）指指抗抗原原分分子子具具有有诱导机体产生免疫应答的特性。诱导机体产生免疫应答的特性。（2）反反应应原原性性（reactogenicity）指指抗抗原原分
7、分子子与与抗抗体体或或效效应应T细细胞胞等等免免疫疫应应答答产产物物发发生生特特异异性性反反应应的的特特性。性。第六张，PPT共九十四页，创作于2022年6月2.抗原的分类抗原的分类 完全抗原、半抗原完全抗原、半抗原免疫学分类免疫学分类胸腺依赖抗原与非依赖抗原胸腺依赖抗原与非依赖抗原外源性抗原：微生物、花粉等外源性抗原：微生物、花粉等内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等瘤相关抗原等临临床床分分类类同种异型抗原：人类白细胞抗原、同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原血型抗原异嗜性抗原：人与其他动物、植物异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原等之间存
8、在的共同抗原第七张，PPT共九十四页，创作于2022年6月抗体（抗体（antibody）1.定定义义：机机体体受受到到抗抗原原刺刺激激后后，通通过过体体液液免免疫疫应应答答，B淋淋巴巴细细胞胞活活化化、增增殖殖，分分化化为为浆浆细细胞胞，由由浆浆细细胞胞合合成成并并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。大大部部分分抗抗体体电电泳泳后后位位于于 区区带带，1972年年国国际际免免疫疫学学联联合合会会正正式式将将化化学学结结构构相相同同或或相相似似的的一一类类球球蛋蛋白白分分子子统统一一命命名名为为免疫球蛋白免疫球蛋白(immunogl
9、obin，Ig)。2.抗体的种类抗体的种类:五类，即五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM免免疫疫组组织织化化学学染染色色技技术术中中，使使用用的的抗抗体体主主要要是是IgG，个别情况下使用个别情况下使用IgG的亚型，多为的亚型，多为IgG1。第八张，PPT共九十四页，创作于2022年6月免疫组织化学染色的反应原理及显色原理免疫组织化学染色的反应原理及显色原理1.免疫组织化学染色的反应原理免疫组织化学染色的反应原理 染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。通通过过对对针针对对标标本本中中相相应应抗抗原原的的抗抗体体上上标标记记某某种种发发色色剂剂或或
10、酶酶类类，再再通通过过激激发发发发色色剂剂或或使使用用某某种种显显色色剂剂，在在显显微微镜镜下下使使标标本本中中抗抗原原抗抗体体反反应应的的部部位位产产生生肉肉眼眼可可观观察察到到的的颜颜色色以以确确定定所所要要检检测测的的抗抗原原是是否否存存在。在。通通过过免免疫疫组组织织化化学学染染色色技技术术，在在光光学学显显微微镜镜下下即即可可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在与否。检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在与否。第九张，PPT共九十四页，创作于2022年6月2.免疫组织化学染色的显色原理免疫组织化学染色的显色原理(1)基本原理基本原理 荧荧光光标标记记或或酶酶标标抗抗体体的的染染色色分分
11、为为直直接接法法和和间间接接法法。其其中中以以酶酶标标抗体法应用最为广泛。抗体法应用最为广泛。直直接接法法：是是将将酶酶直直接接标标记记在在第第一一抗抗体体上上，用用酶酶标标抗抗体体与与切切片片上上待待检检测测的的组组织织或或细细胞胞中中抗抗原原反反应应，再再用用底底物物显显色色，显显示示出出所所检测的目的抗原的部位。检测的目的抗原的部位。间间接接法法：是是将将酶酶标标记记在在第第二二抗抗体体或或与与第第二二抗抗体体具具有有亲亲和和性性的的某某种种分分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。间间接接法法中中所所用用的的一一抗抗是是针针对对组组织织或或细细
12、胞胞中中某某种种抗抗原原的的特特异异性性抗抗体体，多多数数抗抗体体是是由由家家兔兔制制备备的的多多克克隆隆抗抗体体或或由由小小鼠鼠制制备备的的单单克克隆隆抗抗体。体。第十张，PPT共九十四页，创作于2022年6月 第第二二抗抗体体是是第第一一抗抗体体的的抗抗体体，所所以以只只要要不不同同的的第第一一抗抗体体均均来来自自同同一一种种属属动动物物，与与标标记记的的第第二二抗抗体体结结合合就就能能用用来来显显示示不不同同特特异异性性抗抗原原的的存存在在。这这样样可可避避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。通通过过某某种种技技术术增增加加第第二二抗抗体体上上标标记记
13、酶酶的的含含量量，可可提高免疫组织化学染色的敏感度。提高免疫组织化学染色的敏感度。IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。技术中，绝大多数以间接法为常用。（2）显色的基本程序）显色的基本程序1抗抗孵孵育育切切片片或或细细胞胞涂涂片片2抗抗（酶酶标标抗抗体体）孵孵育切片育切片发色剂显色发色剂显色（核复染）（核复染）第十一张，PPT共九十四页，创作于2022年6月（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂）酶标抗体法的显色原理及显色剂辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）HRP+H2O2HRPH2O2HRPH2O2+DH2HRP+D+2H2OHRP催催化化的的酶酶
14、促促反反应应第第一一步步是是特特异异的的，其其余余反反应应是是非非特特异异的的，因因此此，可可选选用用各各种种供供氢氢体体作作为为显显色色剂剂，可可使使反反应应的的终产物呈现不同的颜色，如：终产物呈现不同的颜色，如：CN为蓝色为蓝色TMB为深蓝色为深蓝色AEC为红色为红色DAB为棕色为棕色第十二张，PPT共九十四页，创作于2022年6月碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)以以AS-Mx（色色酚酚AS-MX磷磷酸酸盐盐）为为底底物物，FB/FR(Fastblue/Fastred)为发色剂，生成蓝色为发色剂，生成蓝色/红色不容性沉淀物。红色不容性沉淀物。ALP标
15、标记记的的抗抗体体主主要要用用于于内内源源性性过过氧氧化化物物酶酶含含量量较较高高的的血血细胞、淋巴细胞等的细胞、淋巴细胞等的ICC染色。染色。由由于于组组织织细细胞胞内内含含有有内内源源性性ALP，在在显显色色液液中中需需加加入入终终浓浓度度为为2-4mol/L的左旋咪唑的左旋咪唑(levamisole)，大多数内源性，大多数内源性ALP活性可被抑制。活性可被抑制。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)以以葡葡萄萄糖糖为为底底物物的的酶酶，其其显显色色方方法法为为-D-葡葡萄萄糖糖67mg、NBT6.7mg、PMS(吩吩嗪嗪硫硫酸酸甲甲酯酯,phenazinemet
16、hyl-sulfate)0.167mg、0.05mol/LPBS(pH8.2)10.0ml，37C孵孵育育1小小时时，生生成成蓝蓝色色不不溶溶性性沉沉淀淀物物，该该终终产产物物不不溶溶于于有有机机溶溶剂剂，切切片片可可经经脱脱水水、透透明明后后封封片片，长期保存。长期保存。第十三张，PPT共九十四页，创作于2022年6月（4）核复染）核复染在在显显色色后后，特特别别是是用用DAB显显色色后后，切切片片可可用用苏苏木木素素染染料料进进行行核核复复染染，经经水水化化后后细细胞胞核核显显示示蓝蓝色色，与与胞胞质质中中的的DAB棕棕色色形形成成对对比比。但但用用AEC显显色色后后不不能能用用苏苏木木素
17、素做做核核复复染染，因因为为配配制制苏苏木木素素染染料料中中使使用用酒酒精精作作为为介介质质，可可使使AEC的的红红色色终终产产物物褪褪色色，且且AEC显显色色后后只只能能用用水水溶溶性封固剂封片。性封固剂封片。第十四张，PPT共九十四页，创作于2022年6月第三节第三节免疫组织化学染色步骤免疫组织化学染色步骤（一）（一）ABC或或SP法进行石蜡切片染色的主要步骤法进行石蜡切片染色的主要步骤 1.组织材料的采取；组织材料的采取；2.组织块的固定；组织块的固定；3.组织块的脱水、透明及石蜡包埋；组织块的脱水、透明及石蜡包埋；4.石蜡切片的制备；石蜡切片的制备；5.石蜡切片的脱蜡及水化；石蜡切片的
18、脱蜡及水化；6.抑制内源性过氧化物酶活性；抑制内源性过氧化物酶活性；7.PBS洗涤切片；洗涤切片；8.抗原修复或蛋白酶消化切片，修复或暴露抗原；抗原修复或蛋白酶消化切片，修复或暴露抗原；9.PBS洗涤切片；洗涤切片；第十五张，PPT共九十四页，创作于2022年6月10.用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清（或同时用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清（或同时加入加入BSA）孵育切片，防止抗体的非特异性吸附；）孵育切片，防止抗体的非特异性吸附；11.用特异性一抗用特异性一抗(单克隆、多克隆单克隆、多克隆)孵育切片；孵育切片；12.PBS（可加入（可加入Tween20#，PBST）洗涤切片；）洗涤切
19、片；13.用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片；用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片；14.用用PBS或或PBST洗涤切片；洗涤切片；15.滴加滴加SP试剂或试剂或ABC试剂；试剂；16.PBS或或PBST洗涤切片；洗涤切片；17.DAB或或AEC显色；显色；18.自来水洗涤切片，终止显色；自来水洗涤切片，终止显色；19.用苏木素做核复染；用苏木素做核复染；20.切片脱水、透明，树胶封片。切片脱水、透明，树胶封片。第十六张，PPT共九十四页，创作于2022年6月（二）各染色步骤的具体操作及注意事项（二）各染色步骤的具体操作及注意事项1.组织材料的采取组织材料的采取 活检组织活检组织组织标本组织标本
20、手术切除标本手术切除标本尸检标本尸检标本实验组织或培养细胞实验组织或培养细胞活检组织活检组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内窥镜钳取的组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内窥镜钳取的组织体体积积小小，因因活活检检钳钳直直接接钳钳取取，常常受受压压过过度度而而变变性性，因因此此，活检钳的刃口必须锐利，以免组织受压，活检时应采取主要的病灶区。活检钳的刃口必须锐利，以免组织受压，活检时应采取主要的病灶区。抗抗原原在在组组织织中中的的分分布布不不均均一一，故故病病灶灶较较大大的的切切除除标标本本应应考考虑虑切切取取主主要要病灶。病灶与正常组织交界区及远距病灶的正常区。病灶。病灶与正常组织交界区及远距病灶
21、的正常区。第十七张，PPT共九十四页，创作于2022年6月尸检组织尸检组织 由由于于取取材材时时一一般般均均已已超超过过死死亡亡后后2小小时时以以上上，组组织织有有不不同同程程度度自自溶溶，其其抗抗原原或或变变性性消消失失或或有有严严重重的的弥弥散散现现象象。法法医医尸尸检检一一般般多多在在24小小时时以以上上，甚甚至至数数月月后后，检检材材受受死死后后变变化化影影响响严严重重，而而影影响响染染色色结结果果。手手术术切切除除的的组组织织较较新新鲜鲜，取取材材后后应应立立即即固固定定，以以保保存存组组织织结结构和抗原。构和抗原。实验动物标本实验动物标本新新鲜鲜，可可按按需需要要取取材材；很很多多
22、情情况况下下是是在在灌灌流流固固定定后后取取材材，组组织织结结构和抗原保持良好，非常适用于免疫组织化学染色。构和抗原保持良好，非常适用于免疫组织化学染色。取材标本的大小取材标本的大小尸尸检检组组织织材材料料大大小小以以1cm 1cm 0.2cm为为宜宜。实实验验动动物物常常用用大大鼠鼠或或小小鼠鼠，其其脏脏器器体体积积小小，有有利利于于取取材材。一一般般标标本本体体积积不不宜宜过过大大，防防止止固定不透，影响抗原的保存，也浪费试剂。固定不透，影响抗原的保存，也浪费试剂。第十八张，PPT共九十四页，创作于2022年6月2.组织块的固定、水洗组织块的固定、水洗（1）固定液：）固定液：种类较多，常用
23、的有以下种类较多，常用的有以下2种：种：4%甲醛甲醛/PBS(pH7.2-7.4)配制方法：配制方法：10ml40%甲醛甲醛(formalin)+90mlPBS使用新鲜甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀使用新鲜甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛多聚甲醛)，还可形，还可形成甲酸，影响染色结果。成甲酸，影响染色结果。(可以用粉笔溶可以用粉笔溶)4%多聚甲醛多聚甲醛/PBS(pH7.2-7.4)配制方法：配制方法：40g多聚甲醛多聚甲醛(paraformaldehyde)+500ml0.1mol/LPB(pH7.2-7.4)，搅拌、加热至，搅拌、加热至60C，同时滴入，同时滴入1NNaOH
24、至溶液完全透至溶液完全透明。冷却后用明。冷却后用1NHCl调调PH值至值至7.2-7.4，再用，再用0.1mol/LPB将溶液加至将溶液加至1000ml。固定时间：固定时间：一般根据组织块大小及性质，固定一般根据组织块大小及性质，固定2-24小时。小时。固定原理：固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应，并能保存脂类和类脂体。甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应，并能保存脂类和类脂体。不利作用：不利作用：甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体的结
25、合。抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体的结合。第十九张，PPT共九十四页，创作于2022年6月（2）水洗）水洗 冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定时冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定时间长短有关。尸检组织和大动物组织一般冲洗间长短有关。尸检组织和大动物组织一般冲洗24小时，小动物组织冲洗小时，小动物组织冲洗2-10小时。小时。新鲜标本固定时间短，冲洗时间也相应缩短，固新鲜标本固定时间短，冲洗时间也相应缩短，固定时间长的标本，冲洗时间也需延长。定时间长的标本，冲洗时间也需延长。冲洗时组织放在广口瓶中，瓶口用纱布罩好并扎冲洗时组织放在广口瓶中，瓶口用纱布罩好并扎紧，防止组织块漏出。用一根适
26、当的胶管，一端紧，防止组织块漏出。用一根适当的胶管，一端接自来水，一端插入瓶底，使水缓慢流出，或将接自来水，一端插入瓶底，使水缓慢流出，或将组织块放入洗涤筐中，放在水盆内冲洗。组织块放入洗涤筐中，放在水盆内冲洗。对于过小组织或穿刺组织和小动物组织多次换水对于过小组织或穿刺组织和小动物组织多次换水浸泡即可。浸泡即可。第二十张，PPT共九十四页，创作于2022年6月3.组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋（1）脱水）脱水脱水剂：酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇，最常用酒精。脱水剂：酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇，最常用酒精。酒酒精精可可以以与与水水以以任任何何比比例例混混合合，脱脱水
27、水能能力力强强，并并可可硬硬化化组组织织。酒酒精精对对组组织织的的穿穿透透速速度度很很快快，对对组组织织有有较较明明显显的的收收缩缩作作用用。为为避避免免组组织织过过度度收收缩缩，应应从从低低浓浓度度开开始始，然然后后再再依依次次增增加加其其浓浓度度。在在常常温温下下或或4C下下进进行行，以以减减少抗原的损失。少抗原的损失。70%80%90%95%100%100%第二十一张，PPT共九十四页，创作于2022年6月（2）透明）透明为为使使石石蜡蜡能能浸浸入入组组织织块块，组组织织经经脱脱水水后后，必必须须经经过过一一种种既既能能与与酒酒精精相相溶溶，又又能能溶溶解解与与石石蜡蜡的的溶溶剂剂。通通
28、过过溶溶剂剂的的媒媒介作用而达到石蜡浸入组织块的目的。介作用而达到石蜡浸入组织块的目的。透透明明剂剂：二二甲甲苯苯、苯苯、甲甲苯苯、氯氯仿仿等等，最最常常用用二甲苯。二甲苯。一一般般经经过过23次次纯纯二二甲甲苯苯溶溶液液透透明明，每每次次1015分分钟钟，同同时时应应根根据据组组织织的的种种类类和和组组织织块块大大小小以以及及二二甲甲苯苯的的新新鲜程度加以调整，不应机械照搬。鲜程度加以调整，不应机械照搬。第二十二张，PPT共九十四页，创作于2022年6月（3）浸蜡）浸蜡组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。为使石蜡充分渗入组织只，常需经过
29、为使石蜡充分渗入组织只，常需经过2-3次石蜡浸渍。次石蜡浸渍。用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温蜡，在用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温蜡，在60C以下浸透。以下浸透。（4）包埋）包埋浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡到入包浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡到入包埋盒，冷却后取出，修块。埋盒，冷却后取出，修块。第二十三张，PPT共九十四页，创作于2022年6月4.石蜡切片的制作石蜡切片的制作（1）载玻片涂片的制作）载玻片涂片的制作防防 脱脱 片片 剂剂：3-氨氨 基基 丙丙 基基 三三 乙乙 氧氧 基基 硅硅 烷烷（3-aminopropyltriethoxy si
30、lane,APES）、多多聚聚赖赖氨氨酸酸（Poly-L-lysine）、甲醛）、甲醛-甘油明胶。甘油明胶。APES涂片的制作涂片的制作原原理理：APES是是一一种种新新型型玻玻片片粘粘附附剂剂，与与一一般般的的粘粘附附剂剂不不同同，它它是是通通过过对对玻玻璃璃表表面面起起化化学学修修饰饰作作用用，改改变变其其表表面面的的化化学学物物理理特特性性，使使组组织织切切片片牢牢固固地地贴贴于于玻玻璃片上，不易脱落，保留时间较久。璃片上，不易脱落，保留时间较久。具体操作方法具体操作方法：将将载载玻玻片片用用酸酸处处理理后后，用用95%酒酒精精浸浸泡泡，再再用用绸绸布布擦擦干，清除表面的污渍；干，清除表
31、面的污渍；第二十四张，PPT共九十四页，创作于2022年6月将干净的载玻片放入丙酮内将干净的载玻片放入丙酮内5min；将载玻片用镊子夹住浸入将载玻片用镊子夹住浸入APES试剂（试剂（1mlAPES+50ml丙酮）丙酮）1-2次；次；纯丙酮内洗纯丙酮内洗2次后，次后，37C过夜，干燥；过夜，干燥；用铝箔包好，室温下存放，可存放半年。用铝箔包好，室温下存放，可存放半年。多聚赖氨酸（多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，PLL）试剂配制：试剂配制：PLL0.5g+蒸馏水蒸馏水100ml也也可可根根据据提提供供的的方方法法配配制制。可可于于4C或或-20C保保存存备备用，可反复冻存，效果无明显影响。
32、用，可反复冻存，效果无明显影响。涂涂片片前前将将其其稀稀释释10-50倍倍，均均匀匀涂涂在在处处理理后后干干净净的的载载玻玻片上，片上，37C下干燥过夜。下干燥过夜。第二十五张，PPT共九十四页，创作于2022年6月甲醛甲醛-甘油明胶甘油明胶试剂：试剂：40%甲醛甲醛2.5ml，明胶，明胶0.5g，蒸馏水加至，蒸馏水加至100ml。配制方法：用一部分蒸馏水（约配制方法：用一部分蒸馏水（约80ml）加热溶解明）加热溶解明胶，待完全溶化后加入甲醛，最后补充蒸馏水至胶，待完全溶化后加入甲醛，最后补充蒸馏水至100ml，混匀即可。，混匀即可。粘附切片的效果较上述两种方法差，特别是切片经抗原粘附切片的效
33、果较上述两种方法差，特别是切片经抗原热修复或酶消化后，有时易脱片。热修复或酶消化后，有时易脱片。（2）制做切片）制做切片切片机：旋转式或滑动式切片机。切片机：旋转式或滑动式切片机。切片厚度：切片厚度：5-7 m。展片：切片放入玻璃平皿中的温水中展展片：切片放入玻璃平皿中的温水中展开切片（水浴锅上加热平皿）。开切片（水浴锅上加热平皿）。捞片：用涂有防脱片剂的载玻片捞取切片。捞片：用涂有防脱片剂的载玻片捞取切片。切片干燥：切片干燥：37C过夜，干燥。过夜，干燥。第二十六张，PPT共九十四页，创作于2022年6月5石蜡切片的脱腊及水化石蜡切片的脱腊及水化 脱蜡：脱蜡：将切片放入将切片放入染色筐染色筐
34、中，二甲苯中，二甲苯、各各15分钟脱腊，分钟脱腊，水化：水化：100%酒精酒精、中各中各10分钟、分钟、95%ALC5分分钟、钟、90%ALC5分钟、分钟、80%ALC5分钟、分钟、70%ALC5分钟，蒸馏水浸洗。分钟，蒸馏水浸洗。6清除内源性过氧化物酶活性清除内源性过氧化物酶活性由由于于常常规规免免疫疫组组织织化化学学染染色色的的最最后后显显色色是是用用辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶(horseradishperoxidase,HRP)和和DAB(3,3-diaminobenzidinetetrahydrochloride)，而而组组织织中中常常含含有有内内源源性性过过氧氧化化物物酶酶，为为防
35、防止止出出现现假假阳阳性性反反应应和和减减少少背景染色，需要先清除内源性过氧化物酶活性。背景染色，需要先清除内源性过氧化物酶活性。第二十七张，PPT共九十四页，创作于2022年6月染染色色框框第二十八张，PPT共九十四页，创作于2022年6月具体方法：具体方法：将切片置入甲醇将切片置入甲醇(PBS)-H2O2液中液中2030分钟分钟试剂：试剂：纯甲醇纯甲醇99ml30%，H2O21ml充分混匀，使最后浓充分混匀，使最后浓度为度为0.3%，或，或0.01mlPBS(pH7.27.4)99ml30%H2O21ml7PBS洗涤切片洗涤切片经经甲甲醇醇-H2O2或或PBS-H2O2处处理理后后的的切切
36、片片先先用用蒸蒸馏馏水水洗洗一一次次5min，再用，再用PBS洗洗5min3次。次。0.01mol/LPBS(pH7.27.4)的配制：的配制：NaH2PO42H2O0.45gNa2HPO412H2O3.23gNaCl8.0g蒸馏水蒸馏水加至加至1000ml为为防防止止抗抗体体与与组组织织发发生生静静电电吸吸附附而而产产生生非非特特异异性性染染色色，可可在在PBS中中加加入入Tween20#，制制成成含含0.1%Tween20#的的PBS。Tween20#为为一一种种除污剂，可清除和封闭组织中的静电荷。除污剂，可清除和封闭组织中的静电荷。第二十九张，PPT共九十四页，创作于2022年6月8抗原
37、修复（抗原修复（antigenretrieval,AR）某某些些抗抗原原的的免免疫疫组组化化染染色色不不需需要要此此步步骤骤即即可可染染色色，如如横横纹纹肌肌中中的的myoglobin(Mb)、actin、myosin、脑脑组组织织中中的的S-100蛋蛋白白、GFAP、血血型型抗抗原原A、B、H、生生长长激激素素(growthhormone)、胰胰岛岛素素、波波形形蛋蛋白白(vimentin)、降降钙钙素素(calcitonin)等等。但但有有一一部部分分抗抗原原物物质质或或检检测测的的因因子子等等由由于于组组织织经经甲甲醛醛固固定定后后，因因蛋蛋白白质质的的交交联联，将抗原封闭或发生变性，因
38、此需要热修复或蛋白酶消化。将抗原封闭或发生变性，因此需要热修复或蛋白酶消化。目目前前机机理理清清楚楚，但但是是以以高高温温、高高压压对对常常规规固固定定的的石石蜡蜡切切片片进进行行抗抗原原修修复复处处理理经经验验表表明明，可可以以提提高高抗抗原原抗抗体体阳阳性性检检测测率率，同同时时也也会会出出现现假假阳阳性性，现现已已广广泛泛用用于于技技术术中中。尤尤其其对对原原来来仅仅表表达达在在冰冰冻冻切切片片上上的的抗抗原，利用后大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上。原，利用后大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上。第三十张，PPT共九十四页，创作于2022年6月（1）抗原热修复）抗原热修复 方
39、方法法微波中微波中961020min直接加热法直接加热法10010min高压锅高压锅/消毒锅消毒锅12010min其他：水浴锅其他：水浴锅10010min2及真空加热及真空加热10min等。等。热修复的介质热修复的介质0.01mol/LpH6.0柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液0.05mol/LTris-HCl缓冲液缓冲液(pH112)0.01mol/LpH7.0PBS2%硫酸铝硫酸铝2%硝酸铅硝酸铅生理盐水生理盐水蒸馏水蒸馏水 溶溶液液的的摩摩尔尔浓浓度度对对修修复复效效果果无无任任何何影影响响，而而pH值值则则影影响响较较大大，缓缓冲冲液液以以柠柠檬檬酸酸缓缓冲冲液液和和Tris-HCl缓冲液较常
40、用。缓冲液较常用。第三十一张，PPT共九十四页，创作于2022年6月 温度与修复时间的关系：温度与修复时间的关系：许许多多的的实实验验结结果果表表明明：温温度度高高修修复复时时间间短短，如如Ki-67和和P-gp的的检检测测，利利用用同同一一切切片片，达达到到相相同同染染色色结结果果需需要要：10020min；9030min；8050min；7020h操作流程操作流程微微波波处处理理：将将切切片片插插入入25片片塑塑料料架架上上，在在250ml塑塑盒盒内内加加入入200ml缓缓冲冲液液，将将微微波波高高档档加加温温缓缓冲冲液液至至90+，取取出出后后自自然然冷冷却却至至室室温温后后蒸蒸馏水洗，
41、馏水洗，PBS洗。洗。水水浴浴锅锅法法：一一种种传传统统的的抗抗原原修修复复方方法法，首首先先调调节节水水温温达达95左左右右，将将切切片片置置入入内内含含200ml缓缓冲冲液液的的塑塑料料盒盒或或烧烧杯杯内内，放放入入水水浴浴锅锅，温温度度平衡后开始计算时间平衡后开始计算时间20min，取出容器后自然冷却到室温。，取出容器后自然冷却到室温。压压力力锅锅法法：不不锈锈钢钢高高压压锅锅内内加加入入一一定定量量的的缓缓冲冲液液，加加热热锅锅使使液液体体煮煮沸沸，将将切切片片加加入入切切片片架架并并置置入入锅锅内内，盖盖上上锅锅盖盖，不不加加阀阀，开开始始冒冒气气计计时时50min，关关闭闭气气阀阀
42、，使使之之加加压压10min。再再将将压压力力锅锅置置于于流流水水槽槽中中冲冲洗洗10min，冷却后取出切片，冷却后取出切片，PBS洗。洗。第三十二张，PPT共九十四页，创作于2022年6月 最佳修复方法的选择最佳修复方法的选择 选择最佳的修复方法设计表选择最佳的修复方法设计表 柠檬酸 Buffer pH 12 pH 6 pH 10-11Tris-HCl Buffer pH 12 pH 7-8 pH 10-11微波100 10min2 slide 1 slide 2 slide 3压力锅120 10min slide 4 slide 5 slide 6微波或水浴90 30min slide 7
43、 slide 8 slide 9 slide 10 作对照，不作任何处理 第三十三张，PPT共九十四页，创作于2022年6月 抗原热修复应注意的问题抗原热修复应注意的问题 有有些些抗抗体体在在石石蜡蜡或或冰冰冻冻切切片片上上呈呈阴阴性性反反应应，但但石石蜡蜡切切片片用用抗抗原原修修复复后后却却能能很很好好显显示示，对对某某些些应应表表达达在在胞胞浆浆或或膜膜上上的的抗抗原原，经经修修复复后后，绝绝大大部部分分表表达达在在核核内内。而而有有些些表表达达在在核核内内的的抗抗原原经经修修复复后后会会出出现现在在胞胞浆浆内内，因因此此，在在使使用用该该方方法法时时一一定定要要小小心心，对对结结果果的的
44、判判定定也也要要做做出出客客观观的的分分析析，同时在操作过程中还同时在操作过程中还注意以下问题：注意以下问题：第三十四张，PPT共九十四页，创作于2022年6月热处理后应自然冷却切片。热处理后应自然冷却切片。不能煮干修复液。不能煮干修复液。不要任何抗原的检测都使用该方法。不要任何抗原的检测都使用该方法。一批抗原的检测其温度和时间应保持一致。一批抗原的检测其温度和时间应保持一致。一一般般经经高高温温修修复复后后胞胞浆浆无无明明显显的的破破坏坏，但但对对细细胞胞核核的的影影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染现象。响较大，会出现核破裂，苏木素淡染现象。如如果果在在常常用用的的缓缓冲冲（修修复复）液液中
45、中无无法法实实现现抗抗原原修修复复，得得不不出出好好的的染染色色结结果果，或或经经修修复复后后，抗抗原原定定位位发发生生改改变变，可可改改用用一一些些不不常常用用的的缓缓冲冲液液或或加加一一些些鳌鳌合合剂剂，如如EDTA或或EGTA等等可可能能取得较好的效果。取得较好的效果。第三十五张，PPT共九十四页，创作于2022年6月 （2）蛋白酶消化法）蛋白酶消化法原原理理：蛋蛋白白酶酶消消化化可可以以去去除除覆覆盖盖在在抗抗原原决决定定簇簇表表面面的的杂杂蛋蛋白白，更更为为重重要要的的是是因因甲甲醛醛固固定定而而引引起起的的交交联联被被酶酶消消化化打打开开而而引引起起暴暴露露抗抗原原决决定定簇簇的的
46、作作用用，使使第第一抗体能与抗原部分结合，提高阳性检测率。一抗体能与抗原部分结合，提高阳性检测率。注注意意事事项项：用用于于IHC切切片片消消化化的的酶酶有有多多种种，所所选选择择酶酶的的种种类类、使使用用的的浓浓度度、pH值值、消消化化时时间间及及温温度度等等均均要要视视组组织织固固定定的的不不同同、所所检检测测抗抗原原的的性性质质、组组织织类类型型的的不同而异，通过预实验确定。不同而异，通过预实验确定。第三十六张，PPT共九十四页，创作于2022年6月常用的消化酶类：常用的消化酶类：胰胰蛋蛋白白酶酶和和蛋蛋白白酶酶K：检检测测细细胞胞内内抗抗原原切切片片的的消消化化，如如Keratin、C
47、EA、GFAP等。等。胃胃蛋蛋白白酶酶：细细胞胞间间质质抗抗原原检检测测切切片片的的消消化化，如如纤纤连蛋白连蛋白(fibronectin)，各型胶原等。，各型胶原等。消消化化时时间间及及温温度度：一一般般消消化化时时间间与与组组织织固固定定的的长长短短呈呈正正比比。蛋蛋白白酶酶的的消消化化时时间间51020min，视视切切片片固固定时间的长短而定。定时间的长短而定。第三十七张，PPT共九十四页，创作于2022年6月（3）酶消化液的配制）酶消化液的配制 除除了了商商业业销销售售的的成成品品，可可按按说说明明书书使使用用外外，还还可可自行配制。自行配制。0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶0
48、.1g0.1%氯化钙氯化钙(pH7.8)100ml配配制制方方法法：先先配配制制0.1%的的CaCl2，用用0.1mol/L的的NaOH将将其其pH调调至至7.8，然然后后加加入入胰胰蛋蛋白白酶酶0.1g，溶溶解解之之。用用前前将将胰胰蛋蛋白白酶酶液液过过滤滤，并并在在水水浴浴中中预预热热至至37，室室温温下下消消化时间化时间530min，多用于细胞内抗原的暴露。，多用于细胞内抗原的暴露。第三十八张，PPT共九十四页，创作于2022年6月0.4%胃蛋白酶胃蛋白酶 胃蛋白酶胃蛋白酶400mg0.1NHCl100ml多多用用于于间间质质组组织织免免疫疫组组化化染染色色切切片片的的消消化化，37下下
49、消消化化时时间间约约30min。0.06%蛋白酶蛋白酶K 蛋白酶蛋白酶K0.06g0.05mol/LTris-HCl(PH7.5)100ml用法同上。用法同上。在在免免疫疫组组化化染染色色中中，有有时时经经过过度度固固定定的的标标本本，影影响响一一抗抗与与抗抗原原的的结结合合，用用蛋蛋白白酶酶溶溶液液消消化化，起起到到暴暴露露抗抗原原部部分分的的作作用用。消消化化时时间间应应根根据据不不同同组组织织而而异异。总总之之，在在保保持持组组织织形形态态不不破破坏坏的的前前提提下下，宜宜尽尽量量消消化化时时间间延长。以上三种酶消化液，以第一种最为常用。延长。以上三种酶消化液，以第一种最为常用。第三十九
50、张，PPT共九十四页，创作于2022年6月9.经热修复抗原或蛋白酶消化的切片经洗涤后进行下一步。经热修复抗原或蛋白酶消化的切片经洗涤后进行下一步。10.用用与与制制备备二二抗抗相相同同的的动动物物非非免免疫疫血血清清孵孵育育切切片片防防止止一一抗抗的的非非特特异异性性吸吸附。附。组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色非特异性背景染色。最最常常见见的的原原因因是是蛋蛋白白(第第一一抗抗体体)吸吸附附于于高高电电荷荷的的胶胶原原和和结结缔缔组组织成分上。织成分上。最最有有效效的的方方法法是是在在用用第第一一抗抗体体孵孵育育切切片片前前，用用与与