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1、酪氨酸酶催化活性及其抑制剂的研究 摘要：酪氨酸酶（tyrosinase）又称多酚氧化酶，广泛存在于人、动物、植物和微生物中。当土豆、苹果、香蕉或蘑菇受损伤时，在空气作用下，很快变为棕色，这是因为它们的组织中都含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当内部物质暴露于空气中，在氧的参与下将发生反应，生成黑色素。它还能催化体内的酪氨酸羟化为多巴，进而氧化为多巴醌，最后聚合成黑色素分子，是体内黑色素生成过程中的主要限速酶【1】，其活性与黑色素的合成量成相关。缺乏此酶将导致代谢性病变：白化病；相反，如果该酶活力过高，又可形成黑色素瘤，最近人们还研究发现酪氨酸酶可能还与白癜风发病机制有关。同时，酪氨酸酶抑
2、制剂还能作为生物杀虫剂应用于农业的抗虫领域【2】。因此研究酪氨酸酶不仅有理论意义，而且还有一定的应用价值。本文主要对酪氨酸酶的影响因素、其抑制剂的来源、制备方法、抑制机理进行了综述。关键词：酪氨酸酶 催化活性 抑制剂Research in tyrosinase activity and its inhibitorYangxiaoyun(1002010119) (College of chemistry and molecular engineering, Qingdao University of Science & Technology of Applied Chemistry Class
3、101, Qingdao,26600)Abstract: Tyrosinase (tyrosinase) also known as polyphenol oxidase, exists widely in human, animal, plant and microorganism. When the potatoes, apples, bananas or mushroom by injury, in the air, soon turning brown, this is because their tissues contain tyrosine and tyrosinase, the
4、 enzyme present in the material, when the internal material is exposed to the air, the following will occur in response to oxygen participation, melanin. It can catalyze tyrosine hydroxylase in vivo into dopa, and oxidation of DOPA quinone, the final polymerization into black pigment molecules, is t
5、he main catalyst in the formation of melanin. The lack of this enzyme will lead to metabolic disease: albinism; on the contrary, if the activity of the enzyme is too high, and it can form melanoma, recently also found that tyrosinase might also be associated with the pathogenesis of vitiligo. So the
6、 research of tyrosinase has not only theoretical significance, but also has a certain application value. The main influence factors, the source of tyrosinase inhibitor, its preparation method, inhibition mechanism were summarizedKey word: tyrosinase catalytic activity inhibitor目前人们已经成熟地掌握了从马铃薯中提取酪氨酸
7、酶的方法，并探究出了马铃薯种酪氨酸酶的相关性质。其中酶的最适pH=7.5，最适温度为30。且该酶具有单酚酶和二酚酶活性【3】，其中以邻苯二酚为底物活性最高。Hg2+、Zn2+、Fe2+是激活剂，K+、Ga2+、Mg2+是抑制剂。Ga2+为非竞争性抑制，抑制常数ki 为116.8mmolL-1，K+为竞争性抑制，抑制常数ki 为10mmolL-1 。1、实验准备1.1、实验仪器：分光光度计，离心机，调温水浴锅，秒表，研钵。试剂：二羟基苯丙氨酸（多巴），硫酸氢二钠，盐酸，sephedex柱，材料：土豆（或苹果）。1.2、实验过程：一、溶液配制0.10 molL-1磷酸缓冲溶液（pH=7.2）：50
8、 mL 0.20 molL-1 +8 mol 0.1 molL-1盐酸，稀释到200 mL；0.10 molL-1 磷酸缓冲溶液（pH=6.2） :50 mL 0.20 molL-1+22 mL 0.1 molL-1盐酸，稀释到200 mL；0.010 molL-1多巴溶液，称取0.195 g多巴，用pH=6.0的磷酸缓冲溶液溶解并稀释到100 mL。二、酶的提取在研钵中放入10 g切碎了的土豆，加入7.5 mL pH=7.2的磷酸缓冲溶液，用力挤压。用两层纱布滤出提取物，立即离心分离（约3000 rpm,5 min）。倾出上层清液保存于冰浴或冰箱中。提取液为棕色，放置过程中不断变黑。有条件的
9、话，可以经sephedex柱进一步纯化。1.3、酶活性测量分别取0.1mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入2.9mL pH=6.0的缓冲溶液，再加入2.0mL多巴溶液，同时开始计时，用分光光度计在450nm处测定吸光度。开始6min内每分钟读一个数，以后隔2min读一个数，直至吸光度变化不大为止。取0.2，0.3,0.4ml已稀释过的提取液重复上述实验，【注意总体积为5ml，每次换溶液洗比色皿只能倒很少量溶液洗1次。】以吸光度对时间作图，从直线斜率求出酶的活性。表1.3酶活性随时间的变化测试时间0.1mL0.2mL0.3mL0.4mL1min0.0810.1390.1870.0152mi
10、n0.0860.1430.1960.0263 min0.0900.1520.2050.0194 min0.0960.1580.2130.0335 min0.1020,1680,2200.0376 min0.1090.1740.2280.0458 min0.1150.1820.2360.04410 min0.1230.1910.2490.05112 min0.1340.2000.2580.05814 min0.1330.2080.2600.07716 min0.1340.2070.2590.0923. 影响酶的活性的因素研究(1)温度的影响：取0.40 mL稀释过的提取液在沸水浴中加热5分，冷却
11、后配成测定溶液，观察现象。(2) 抑制剂的影响：取0.40 mL稀释过的提取液，加硫代硫酸钠、观察现象。(3) 取0.40 mL稀释过的提取液，加入少量固体Na2EDTA震动混合，反应一段时间后配成测定溶液，观察现象。六、数据记录及结果讨论1、绘制酶加入量的动力学曲线：以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，可得出在加入酶的作用下，酪氨酸转换的动力学过程，再由直线部分得出转换速率，即可计算酶的活性。图1.2酶活性的测量由直线斜率求出酶的活性：已稀释的提取液体积/ml活性/ A.min-1原提取液活性（mL -1）原料活性/g-10.10.00489.580.20.0065.980.30.00684.5
12、0.40.00512.53、影响酶的活性的因素研究：(1)温度的影响：取0.40 mL稀释过的提取液在沸水浴中加热5min，冷却后配成测定溶液，观察现象。沸水浴5min后溶液吸光值基本不变，这说明酶在此环境下已经失去活性，而丧失其催化效果。(2) 抑制剂的影响：取0.40 mL稀释过的提取液，加硫代硫酸钠、观察现象。加入硫代硫酸钠后，吸光度明显下降，使酶失去其催化效果。(3) 取0.40 mL稀释过的提取液，加入少量固体Na2EDTA震动混合，反应一段时间后配成测定溶液，观察现象。当加入少量EDTA后，吸光度明显下降。表3影响酶活性的因素时间/min沸水浴硫代硫酸钠EDTA10.1160.27
13、90.30020.1160.2790.23630.1170.2710.23340.1170.2650.22650.1170.2790.21160.1170.2790.211思考题1、影响酶活性的因素有哪些？答：影响酶活性的因素主要有温度、酸碱度以及抑制剂等。2、提取物在放置过程中为何会变黑？答：因为提取物在放置过程中与空气接触，在氧存在的条件下提取物中发生多巴转换反应生成了黑色素。3、热处理后酶的活性为何会显著降低？答：酶的催化作用，只有在一定温度下才能表现出来。酶的作用速度与温度的关系为：当酶蛋白没有因受热而变性时，温度每升高10，反应速度增加一倍左右。通常酶的作用速度随温度升高而加速，但温
14、度升高到一定限度后，蛋白质结构被破坏，导致酶变性失活，是一种不可逆的反应，因此活性显著降低。1KuboI,YokokawaY,Kinst-HoriI.TyrosinaseinhibitorsformbolivianmedicinalplantsJ.JNatProd,1995,58:739.2 张宗炳，冷逸夫，杀虫药剂毒理及应用M.北京：化学工业出版社，1993.3 SanchezFerrer A，RodriguezLopez J N，GarciaCanovas F，et alTyrosinase: a comprehensive review of its mechanismJ.BBAprotein and Molecular Enzymology，1995，1247(1)：1-11