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1、 分 类 号：学校代码：学 号：应用微波分离土壤放线菌 Application of Microwave for Actinomycetes Isolation from Soil 所在院： 学生姓名：指导教师： 研究起止日期：二一一年十二月至二一二年五月二一二年五月学位论文独创性声明本人郑重声明：1. 坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。2. 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。3. 本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。4. 本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。5. 其他同志对本研究所做的贡献均已在论
2、文中作了声明并表示了谢意。 作者签名：日 期：应用微波分离土壤放线菌 学生： 指导老师： 摘要：目的本文利用微波炉的微波对土样进行预处理，研究不同微波处理时间对分离放线菌效果的影响。方法土壤分别用微波处理0(CK）、3、6、9、12、15、18、21和24min。结果 1）微波处理能显著增加可培养放线菌数量,随着处理时间的增加，土壤放线菌比例呈先增后减的趋势。处理3、6、9、12和24min,高氏1号及高氏2号培养基上放线菌比例较对照均有提高；处理1521min，放线菌比例较对照均有降低。2）随着微波处理时间的增加，土壤中稀有放线菌比例显著增加。结论微波处理能够增加放线菌的种类，有效提高稀有放
3、线菌的比例。关键词：微波炉; 放线菌; 处理时间。Application of Microwave for Actinomycetes Isolation from SoilStudent : Lu YanSupervisor: Duan ShuRongAbstract: Objective To selectively isolate actinomycetes the research applied microwave to pretreat the soil samples. Methods The soil samples was respectively pretreated wi
4、th microwave in different time: 0 (CK), 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 and 24 min. Results 1) Microwave treatment can obviously increase cultivatable actinomyces quantity with the increase of processing time, at the same time the bacterial rate firstly increased and then decreased. Microwave treatment in 3
5、, 6, 9, 12 and 24 min, actinomycetes numbers on GAUZEs medium no. 1 and no. 2 medium are both more than control; Then Microwave treatment in 15 to 21 min, actinomyces numbers decreased considerably than control. 2) With the increase of microwave processing time, the rare actinomycetes rate increased
6、 significantly. Conclusion Microwave treatment can increase actinomyces variety and effectively improve rare actinomyces ratio.字典朗读显示对应的拉丁字符的拼音字典Key words：Microwave; Actinomycetes; Selective isolation.目录前言51、材料及方法61.1、实验器材61.2、实验样品61.3、实验试剂61.4、分离培养基61.5、研究方法71.51、培养基的配制71.52、土样预处理71.53、分离计数72、实验结果与
7、分析72.1、微波处理对放线菌数量的影响72.2、微波处理对稀有放线菌数量的影响92.4、结论12参考文献12致谢13前言放线菌因菌落呈放线状而得名，它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。放线菌是一类具有重要经济价值和多种用途的微生物，自从1943年Waksman第一次从链霉菌中发现链霉素以后，又相继从链霉菌中发现土霉素、金霉素、氯霉素、红霉素等有显著医疗价值的抗生素，从此筛选新抗生素的工作广泛展开。实
8、践证明，放线菌尤其链霉菌是产生抗生素种类最多的微生物。放线菌分类学伴随着抗生素事业的发展蓬勃发展起来，到现在已发现80多个属，仅链霉菌属就有1000多个种和变种。随着放线菌生物多样性研究的进展，放线菌仍然具有产生新的生物活性物质的极大潜力1。研究资料显示，目前人们分离到的放线菌仅占土壤所有放线菌的10%20%左右。放线菌在人工培养基上不生长的原因很多，例如培养基养分不能满足某些放线菌的需求,非目的菌的抑制作用等，为了要分离到更多的放线菌，需要不断的改进分离方法。目前，国内外在放线菌分离方法研究方面已取得了较大的进展2-8。研究发现，采用多种物理、化学刺激以及改变培养基成分等措施8-10 , 能
9、有效提高稀有放线菌的比例, 并分离出放线菌的新种属11-13。 微波是一种频率高、波长短的电磁波,其波长为1-1000mm，振荡频率为每秒24.5亿次, 微波的加热与杀菌作用已有大量研究,具有加热速度快、加热均匀性好、易于瞬时控制、选择性吸收和加热效率高的特点。 微波对生物体可以产生热效应、电效应、磁效应及化学效应等, 从而引起生物细胞多种生理生化变化或致死效应14。微波技术已被广泛应用各行业中，如灭菌、物料干燥等行业14-18。 从物理学和生物学原理可推知，适度微波处理可能会促进放线菌孢子的萌发，使部分难培养放线菌的孢子在接受了一定量的微波辐射后萌发，转化为可培养放线菌，增加可培养放线菌的种
10、类与数量。Bulina 等19将其应用于放线菌的分离,该研究发现，小功率、短时间微波处理效应对放线菌分离效果有一定影响，使用80W微波对土壤悬液处理30s 时能有效提高小单孢菌属、小多孢菌属、诺卡氏菌属及马杜拉菌属等稀有放线菌的比率。薛清等20研究了微波处理对钙质土壤放线菌分离效果的影响，发现微波处理对提高放线菌比例有促进作用。Li 等21使用1kHz以上的极高频射线（EHF）对土壤悬液进行照射，发现在波长8-11.5时，各稀有放线菌总数较对照提高了7.5倍。 Likhacheva等22用超高频辐射法（SHF）对几种链霉菌孢子悬液进行不同时间的预处理，发现不同处理时间链霉菌的生物量以及活性均受
11、到不同程度的影响。本文将微波炉的处理功率提高到800W，将处理时间设置为3、6、9、12、15、18、21和24 min，探讨了不同微波处理时间对放线菌分离效果的影响。1、材料及方法1.1、实验器材容量瓶、三角瓶、烧杯、试管、培养皿、量筒、移液枪及枪头、玻璃棒、涂布棒、玻璃珠、高、压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、摇床、微波炉、电炉、离心管、吸纸、纱布、棉线、胶头滴管、pH试纸、天平、称量纸、药匙、95%酒精、报纸，搪瓷缸。1.2、实验样品2011年9月采自江西大鄣山不同生态系统类型和不同有机质含量的土壤（表层020）：土样1（T1）：大鄣山卧龙谷山行300400米处山坡草地；土样2（T2
12、）：大鄣山乡东山坡枫香柏下1.3、实验试剂可溶性淀粉(Soluble starch) 国药集团化学试剂有限公司硝酸钾（KNO3） 上海久亿化学试剂有限公司磷酸氢二钾（K2HPO4） 上海久亿化学试剂有限公司七水合硫酸镁（MgSO47H2O） 江苏省连云港市化学试剂厂氯化钠（NaCl） 上海久亿化学试剂有限公司七水合硫酸亚铁（FeSO47H2O） 上海久亿化学试剂有限公司琼脂(Agar) 福建泉州市泉港化工厂葡萄糖(C6H12O6) 西陇化工股份有限公司重铬酸钾(K2Cr2O7) 上海浦江化工厂 蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司 胰胨 北京奥博星生物技术有限责任公司复合维生素 上海信谊黄河
13、制药有限公司1.4、分离培养基高氏1号培养基(1000ml)： 可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，七水合硫酸亚铁0.01g，琼脂 20g，重铬酸钾0.05g， pH7.27.4改良高氏2号培养基(1000ml)：葡萄糖1g,蛋白胨0.5g，胰胨0.3g，氯化钠0.5g，复合维生素(维生素B1、核黄素、烟酸、维生素B6、泛酸钙、肌醇、p-氨基苯甲酸各0.5 mg，生物素0.25 mg)，琼脂 20g，重铬酸钾0.05g， pH7.27.41.5、研究方法1.51、培养基的配制a.将包扎好的培养皿、涂布棒等置于高压蒸汽灭菌锅中121灭菌20mi
14、n。b.高氏1号培养基的配制：先将可溶性淀粉称好，在小烧杯内用50100ml水调成糊状。在瓷缸内加入900950ml热水，放在电炉上加热，将小烧杯内的淀粉倒入混匀。再分别称取其他药品，边搅拌边依次逐一加入，使之溶解，最后定容至 1000ml，调节pH7.27.4，分装。121高压蒸汽灭菌20min。高氏2号同上。c.在无菌超净台里，将培养基倒入事先灭过菌的平皿，待冷凝成平板。1.52、土样预处理土样自然风干21d23-24,用灭菌研钵将土样碾磨过筛（孔径1mm），装入无菌广口瓶中。分别称取土样1和土样2各9份，每份为0.3g，置于离心管中，加入0.3ml无菌水润湿，放置15min后将离心管放入
15、加有400ml自来水的烧杯中，置于800W，2450MHz的微波炉中，分别处理0(CK)、3、6、9、12、15、18、21和24min，用灭菌针管吸取无菌水冲洗土样，转入装有29.4ml无菌水的三角瓶中，震荡15min；制得10-2的土壤悬液。1.53、分离计数将处理好土壤悬液稀释成10-3倍 25，充分混匀，分别用移液枪吸取土壤悬液0.1ml吹入高氏1号和高氏2号培养皿中，用涂布棒将土壤悬液均匀涂布整个培养皿，设3个重复。然后将其放入恒温箱28倒置培养21d。每7天观察一次，观察菌落生长情况,并记录培养皿中菌落的数量。 2、实验结果与分析2.1、微波处理对放线菌数量的影响表1 微波处理后T
16、1各类微生物的数量Table.1 Numbers of all kinds of microorganism in T1 treated by microwave irradiation培养基处理时间(min）F(104个/g)B(104个/g)A(104个/g)A/SUM(%)高氏1号010.0 61.0 27.0 27.6 34.0 38.0 27.0 39.1 63.0 9.0 47.0 79.7 95.0 23.0 17.0 37.8 125.0 17.0 9.0 29.0 154.0 10.0 5.0 26.3 183.0 5.0 2.0 20.0 212.0 4.0 2.0 25.
17、0 242.0 0.0 2.0 50.0 高氏2号06.0 29.0 7.0 16.7 30.0 13.0 3.0 18.8 60.0 26.0 11.0 29.7 90.0 21.0 5.0 19.2 122.0 11.0 3.0 18.8 153.0 3.0 1.0 14.3 182.0 3.0 1.0 16.7 213.0 4.0 1.0 12.5 242.0 1.0 4.0 57.1 T1：一号土样 F:真菌菌落数 B：细菌菌落数 A：放线菌菌落数 SUM：平板上所有微生物菌落的总数由表1可见，在高氏1号培养基上，随着微波处理时间的增加，放线菌比例呈先增后减的趋势。处理6 min时，放
18、线菌总数明显高于对照，且达到最大值，为47.0104个/g，同时占总菌数比例也达到最高值，为79.7%，与对照相比提高了52.1%。处理3、6、9、12 和24min时，放线菌比例提高了1.5%52.1%。处理1521 min时，放线菌比例低于对照，其中处理18 min时放线菌比例最少，与对照相比减少了7.6%。在高氏2号培养基上也有着类似的趋势,但因高氏二号培养基上分离到的各类微生物数量均较少，故代表性不强。由实验结果可见，使用微波对土壤进行一定时间的预处理可以促进放线菌比例的提高，由于采用功率较低，可能使一部分本来难以萌发的放线菌孢子在接受了一定量的辐射后萌发，而长时间的微波处理可能使放线
19、菌孢子内的生物大分子及细胞结构受到破坏，导致孢子失活，放线菌的出菌率减少。 表2 微波处理后T2各类微生物的数量Table.2 Numbers of all kinds of microorganism in T2 treated by microwave irradiation培养基处理时间(min)F(104个/g)B(104个/g)A(104个/g)A/SUM(%)高氏1号012.0 47.0 23.0 28.0 33.0 34.0 11.0 22.9 61.0 37.0 46.0 54.8 91.0 18.0 2.0 9.5 125.0 11.0 2.0 11.1 152.0 2.0
20、1.0 20.0 182.0 1.0 1.0 25.0 212.0 1.0 1.0 25.0 243.0 1.0 2.0 33.3 高氏2号00.0 21.0 6.0 22.2 30.0 14.0 5.0 26.3 61.0 11.0 7.0 36.8 90.0 22.0 4.0 15.4 120.0 8.0 2.0 20.0 153.0 1.0 1.0 20.0 181.0 0.0 3.0 75.0 212.0 1.0 1.0 25.0 244.0 1.0 1.0 16.7 T2：二号土样 F:真菌菌落数 B：细菌菌落数A：放线菌菌落数 SUM：平板上所有微生物菌落的总数由表2可见，土样2经
21、过微波处理后放线菌比例变化不明显，在高氏1号培养基上，处理6 min时，放线菌总数明显高于对照。放线菌比例仅在处理6和24 min时提高了26.7%和5.3%。处理921 min时，放线菌比例明显低于对照。在高氏2号培养基上，放线菌比例在处理18 min时明显提高，达到了75.0%，其他处理没有明显的变化。这可能是由于土壤中放线菌数量少，能够被微波激活萌发的放线菌孢子较少的原因导致。2.2、微波处理对稀有放线菌数量的影响表3 微波处理后T1稀有放线菌数量Table.3 Rare actinomycete numbers in T1 treated by microwave irradiatio
22、n培养基处理时间(min）R(104个/g)A(104个/g)R/A(%)高氏1号05.0 27.0 18.52 311.0 27.0 40.74 618.0 47.0 38.30 96.0 17.0 35.29124.0 9.0 44.44 152.0 5.0 40.00 181.0 2.0 50.00 211.0 2.0 50.00241.0 2.0 50.00高氏2号01.0 7.0 14.2930.0 3.0 0.00 62.0 11.0 18.18 90.0 5.0 0.00 120.0 3.0 0.00 151.0 1.0 100.00 181.0 1.0 100.00 211.0
23、 1.0 100.00 243.0 4.0 75.00 T1：一号土样 R：稀有放线菌菌落数 A：放线菌菌落数 由表3可见，随着微波处理时间的增加，土壤中稀有放线菌的总数明显增加。在高氏1号培养基中，随着微波处理时间的增加，稀有放线菌总数呈先增后减的趋势。处理36 min时，稀有放线菌总数明显高于对照，并在处理6 min时达到最大值，为18.0104个/g，且占放线菌总数比例为38.30%。处理324min时，稀有放线菌比例提高了16.78%31.48%。虽然在处理1824 min时，稀有放线菌的比例达到了50.00%，但是此段处理时间的稀有放线菌数量少，种类单一。在高氏2号培养基上，随着处理
24、时间的增加，培养基上相继出现了稀有放线菌。处理24 min时稀有放线菌总数达到最大值，为3.0104个/g，占放线菌总数比例为75.00%，与对照相比提高了60.71%。表4 微波处理后T2稀有放线菌数量Table.4 Rare actinomycete numbers in T2 treated by microwave irradiation培养基处理时间(min)R(104个/g)A(104个/g)R/A(%)高氏1号03.0 23.0 13.04 32.0 11.0 18.18 616.0 46.0 34.78 91.0 2.0 50.00120.0 2.0 0.00 150.0 1.
25、0 0.00 180.0 1.0 0.00 210.0 1.0 0.00 241.0 2.0 50.00高氏2号01.0 6.0 16.6731.0 5.0 20.00 62.0 7.0 28.5792.0 4.0 50.00 121.0 2.0 50.00 150.0 1.0 0.00 180.0 3.0 0.00 210.0 1.0 0.00 240.0 1.0 0.00 T2：二号土样 R：稀有放线菌菌落数 A：放线菌菌落数 从表4可以看出，随着微波处理时间的增加，在一定时间内，稀有放线菌比例呈先增后减的趋势，在一定时间后，培养基上不再出现稀有放线菌。在高氏1号培养基上，微波处理6 mi
26、n时，稀有放线菌总数明显高于对照，达到了最大值，为16.0104个/g，且占放线菌总数比例为34.78%，相比对照提高了21.74%。处理1221 min时，培养基上没有稀有放线菌。在高氏2号培养基上，处理312 min时，稀有放线菌的总数没有明显的变化。处理1524 min时，培养基上也没有稀有放线菌。由于在低有机质土壤中稀有放线菌数量较少，故对放线菌分离效果的影响代表性不强。图1 T1-微波处理0分钟分离效果Fig 1 T1-Separation result after microwave pretreatment 0 minutes 图2 T1-微波处理3分钟分离效果 图3 T1-微波
27、处理6分钟分离效果Fig 2 T1-Separation result after microwave Fig 3 T1-Separation result after microwave pretreatment 3 minutes pretreatment 6 minutes2.4、结论综上所述，通过使用800W、2450MHz微波对土壤进行不同时间预处理，研究微波处理土壤时间的长短对放线菌分离的作用和影响。在处理6 min时放线菌数量最多，比例也达到最高；微波处理能够增加放线菌的种类，有效提高稀有放线菌的比例；随着微波处理时间的继续增加，抑制真菌和细菌等杂菌的效果明显，但是微生物种类单一
28、，不适用于放线菌的分离和研究。如果土壤中放线菌数量少、待激活的放线菌孢子少，那么放线菌数量无明显变化。未处理的土壤上能得到最多种类的菌落，但是细菌和真菌覆盖了放线菌，影响放线菌的出菌率和分离纯化。本研究可以进行进一步的深入研究，对分离纯化的放线菌，运用生理生化、分子生物学、培养特征等方法来鉴定放线菌种属。参考文献1 刘志恒, 放线菌微生物药物的重要资源J.微生物学通报. 2005,32(6):143-145.2 Suzuki S, Okuda T, Kom atsubara T.Appl Env iro M icrob io, 1999, 65 ( 5 ): 1930-1935.3 Suzuk
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36、y selective isolation of micromonospora and microbispora from soil. Journal of Fermentation and Bioenhineering. 1991, 72(5): 320-326.致谢在本论文完成之际，我要向所有帮助过我的老师、同学表示衷心的感谢！我要特别感谢我的指导老师段老师的热情关怀和悉心指导。在我撰写论文的过程中，段老师倾注了大量的心血和汗水。从开题报告的修改、论文的架构拟定到最终定稿，她给予了殷切的指导，提出了许多宝贵的意见。无论是在论文的选题、构思和资料的收集方面，还是在论文的研究方法以及成文定稿方面，我都得到了段老师悉心细致的教诲和无私的帮助，特别是她广博的学识、严谨的治学精神和一丝不苟的工作作风使我受益匪浅，在此表示真诚地感谢和深深的谢意。 14