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1、 芝麻渣提取物抑菌试验的研究摘要: 通过索氏提取法对芝麻渣脱脂3h，然后回流提取14h，得芝麻渣提取物，旋转蒸发和真空干燥得提取物干物质，以平板穿刺法和纸片扩散法研究提取物对大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌和黑曲霉的抑菌效果。结果表明：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌和黑曲霉均不受芝麻渣提取物的抑制。关键词：芝麻渣提取物，索氏提取法，纸片扩散法，平板穿刺法，抑菌性Study on antimicrobial activity of sesame dregs extract Abstract: Skimmed 3h by Soxhlet extractor for s
2、esame residue then extracted 14h, had sesame dregs extraction than did rotary evaporation,dried in vacuum and extracted dry matter.I also research antibacterial effect of Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, yeast and Aspergillus niger with the help of flat puncturing method a
3、nd disk diffusion method. The results show that: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida and Aspergillus niger were not affected by the inhibition of sesame dregs extracted extract.Error! No bookmark name given.Keyords: Soxhlet extractor, disk diffusion method, flat punct
4、uring method, antibacterial activity.芝麻（学名：Sesamum indicum）脂麻科，是胡麻的籽种。芝麻中含有丰富的油及营养物质，其中芝麻油61.7%，芝麻蛋白21.9%，芝麻木聚糖1%，以及丰富的芝麻素（很强的抗菌因子），芝麻油酚，卵磷脂，脂溶性维生素A、D、E等。在当今的研究中，从利用微生物发酵法处理芝麻渣提高粗蛋白，改善口性，从利用芝麻渣提取“抗高血压肽”，到研究芝麻渣抗氧化性能，他们涉及到芝麻渣的药用价值，营养价值以及保健价值。抑菌性是综合利用芝麻渣价值的一部分，然而在这方面的研究相对其他方面而言是非常少的。其中，有人研究表明：芝麻饼粕提取物最低
5、抑菌浓度MIC(体积浓度)分别为:大肠杆菌是0.08,枯草芽孢杆菌是0.06,金黄色葡萄球菌是1.00。各供试菌在芝麻素和甾醇的质量浓度分别达到2010-3g/mL和610-3g/mL时的抑制作用最为明显。这说明了不仅鲜芝麻中含有抗菌蛋白等抗菌因子，在芝麻渣中仍含有非蛋白抗菌因子。由于真实可靠的结果在于具有很好的重现性，加之在这方面的研究较少，为此进一步研究他的抑菌性是必要的，以使其达到检验和更完善的目的。另外，为抑菌实验的基本理论和实验技能进行总结和改善提供经验和数据。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 原料 黑芝麻渣1.1.2 菌种 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus au
6、reus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、酵母菌（saccharomycetes）、黑曲霉(Aspergillusniger)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1.1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：细菌培养；马铃薯-蔗糖琼脂培养基：真菌培养；1.1.4 试剂 氯仿(AR),Tween-80(CP)1.1.5 仪器 双目显微镜，恒温恒湿培养箱，灭菌锅，分析天平，电热鼓风干燥箱，旋转蒸发仪，粉碎机，脂肪抽提器，500ml、200ml、80ml三角烧瓶，25ml甘油瓶，玻璃珠，封口膜，烧杯，移液枪，培养皿，试管（带棉花塞），镊子，滤纸，剪刀，圆规，直尺，电炉。1.2
7、 实验方法1.2.1 工艺路线 芝麻渣粉碎，干燥装入滤纸筒25g80正己烷脱脂3h80氯仿回流提取14h旋转蒸发常温真空干燥提取物半固体低温冷冻保存备用1.2.2 芝麻渣提取物的提取 采用索氏抽提法4，称取粉碎的芝麻渣25.00g放入滤纸筒中，将滤纸筒置于索氏提取器中，加入200ml氯仿，冷凝回流14h，提取过程中提取液注意避免强光。提取结束后，终止加热并待其冷却。将混合提取液置于旋转蒸发器中，把提取液旋转蒸发得浓缩液，用吸管转移至小玻璃瓶中，真空干燥12d，得提取物固体，然后冷冻保藏备用。1.2.3 培养基的配制 PDA培养基制备马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g水1000mL，pH自
8、然。马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后在500ml烧杯上用8层纱布过滤，并把土豆泥中的残液挤压至烧杯内，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000mL。121灭菌30min。 牛肉膏蛋白胨培养基制备牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂 1520g，水 1000ml，pH 7.07.2。121灭菌20min。1.2.4 抑菌实验1.2.4.1 圆形滤纸片的制备把滤纸对折两次，在上面用圆规画适当数目直径为1cm的圆，然后用剪刀剪取下来，高温蒸汽灭菌（121下灭菌30min）,烘干后备用。1.2.4.2 供试菌种的复壮与纯化将所有供测试的怀疑有可能退化或污染的菌种从斜面转转接到平板上.细菌置
9、于37培养12h，真菌于28培养24h。从平板上刮取45环的适量的菌苔（菌苔直径12mm）加入到10ml无菌水中，制成菌悬液（估计菌悬液浓度至少为1010个/ml）。通过稀释涂布选择50100个菌落的平板，挑取具有该菌种典型特征的菌落，并镜检观察细胞特征是否唯一。如果符合这些条件，可判断为该菌达到菌种纯水平，挑至斜面培养，保藏备用，否则继续筛选。1.2.4.3 菌悬液的制备取适量已活化的待测菌于装有玻璃珠的无菌水小三角瓶中(霉菌采用玻片法制取孢子悬液),震荡摇匀,于4冰箱保存.细菌采用稀释涂布平板法计数,真菌采用显微镜直接计数法测菌体或孢子个数,从而计算出各菌悬液的浓度.然后,把菌悬液浓度稀释
10、为105106cfu/ml，备用。1.2.4.4 含菌平板的制作在无菌操作下将已融化且冷却到约50的无菌培养基(60恒温水浴锅预恒温)倾入无菌培养皿(操作过程中,使平皿倾斜再往其中倒入培养基,勿过多,15ml左右，以铺满皿底为准)，待培养基凝固后用移液枪注入0.1ml（100ul）菌悬液，然后用无菌玻璃涂棒将菌悬液均匀的涂布（多个方向连续涂布），即制得含菌平板，倒置于37培养箱内，空培养过夜，待用。1.2.4.5 供试样液的制备 取两个25ml甘油瓶，分别标记为5%样液（实验组）和1%吐温水（对照组）并向5%样液瓶内加入适量玻璃珠，高压灭菌。无菌操作，向两个25ml甘油瓶内用无菌的5ml移液管
11、注入5ml无菌1%吐温水。用接种环在酒精灯火焰侧挑去0.25g芝麻渣提取物半固体（不便于使用移液枪，因为枪头是有机塑料，很容易吸附芝麻渣提取物半固体，从而难以将其注入甘油瓶内），加入到5%样液瓶内，震荡，摇匀，使半固体溶解，并将其放入80恒温水浴锅巴士消毒20min。（巴士消毒法虽不能达到灭菌的目的，但可杀死大部分非休眠体状态的微生物，保证培养基至少23天内不受这些微生物的影响，这已经满足了本实验的要求。）1.2.4.6 抑菌圈的测定在无菌条件下，将圆形滤纸片分别放入5%样液瓶和1%吐温水瓶内，浸泡约15min后，取出自然沥干，贴含菌平板上，实验组和对照组每皿各放3片。真菌置于37恒温培养18
12、h，细菌置于28恒温培养12h。采用十字交叉法4，测量抑菌圈的直径并取3个抑菌圈的平均值作为抑菌圈的实验值。2 结果与分析2.1 微生物镜检图10倍镜黑曲霉菌丝体 40倍镜黑曲霉菌丝体 40倍镜黑曲霉孢子 100倍油镜大肠杆菌 40倍酵母菌 100倍金黄色葡萄球菌 40倍枯草芽孢杆菌2.2 细胞计数和菌悬液浓度计算结果 金黄色葡萄球菌 N=36个，B=10倍，V=0.1ml所以C=360.110=3.610cfu/ml 大肠杆菌N=186个，B=10倍，V=0.1ml所以C=1860.110=1.8610cfu/ml 枯草芽孢杆菌N=11个，B=10倍，V=0.1ml所以C=110.110=1
13、.110cfu/ml 酵母菌B=8倍 A1（左上） A2(右上) A3（右下） A4（左下） A5（中间）3 5 6 9 10 19 6 8 4 7 6 8 7 8 11 6 3 6 6 83 8 11 12 12 6 5 11 8 9 7 5 3 5 10 10 6 7 12 65 7 14 10 6 14 5 11 3 2 8 9 8 10 6 8 9 5 8 1012 9 10 18 10 6 5 11 6 3 5 8 8 8 6 5 12 6 7 11所以C=（A1+A2+A3+A4+A5）5108=2.48410cfu/ml 黑曲霉B=1倍 A1（左上） A2(右上) A3（右下）
14、A4（左下） A5（中间）3 1 4 3 4 5 4 5 5 7 6 5 3 3 5 4 7 2 10 81 7 2 3 2 2 7 1 4 3 3 3 5 5 3 0 5 4 3 74 1 4 5 2 4 4 4 3 3 2 3 2 2 1 2 4 2 3 45 4 6 2 2 2 5 4 5 6 4 4 2 4 3 2 3 4 3 3所以C=（A1+A2+A3+A4+A5）5101=1.4910cfu/ml2.3 抑菌圈（左侧为实验组，右侧为对照组） 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 黑曲霉 酵母菌 结果表明，在滤纸片周围没有抑菌圈或抑菌圈很不明显。另外，我们还会发现在黑曲霉和酵母菌
15、的平板上有可疑的模糊的圈，若进一步观察会发现它并不是抑菌圈，有两点事实作为依据：该圈是模糊的并不是透明的在该圈内有该菌的分布。可以认为大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌和黑曲霉不受芝麻渣提取物的抑制，反而还具有促进的作用。3 全面总结、分析与讨论3.1 抑菌实验的一般意义和菌种选择做抑菌实验，我们常用的方法是纸片扩散法和牛津杯法等，他们的共同特点是一个皿检测一种菌。我们的目的是从数量众多的微生物中选择具有対药液具有敏感的菌株。为了解决这个问题，我们需要把微生物进行分类，每一类中选出一个代表。分类的方法有很多，选择不同的标准，会有不同的分类结果。为了解决分类的问题我们需要进一步了解抑
16、菌实验。若一类药物对一中微生物具有抑制效果，我们说是这类药物中的有效成分或活性成分在起作用。微生物之所以受抑制是因为微生物的活性结构被破坏。因此，我们把含有各种活性结构的微生物的集合与药物发生作用，只要有其中一个活性结构被破坏，外在表现就是这个集合中一些菌受到了抑制。虽然，我们不能确定具体是那种活性结构受到破坏，但为进一步研究提供了依据。我们在研究抑菌实验时，我们可以单独的研究一种纯药物分子，也可以把几种分子放在一起来研究。前者是研究个体，后者是研究整体。总体表现的性质不仅是个体性质简单的机械的加和，还有个体彼此间的作用。这是单独研究个体所达不到的结果。我国传统的煎药法就是从整体的角度来考察中
17、药材的的治疗效果。所谓中药好，西药快，我们可以这样来理解：中药成分复杂，既有有效成分，又有辅助成分，彼此间既相互影响，又单独作用，体现了整体的优点，所以说“中药好”。西药成分单一，简单，纯度高，故针对性强，与病症作用迅速，发挥了个体的优点，所以说“西药快”。然而，整体法与个体法研究，又是密不可分的。整体法研究为个体法研究指明了方向，个体法研究为整体法研究给予了保证。本实验通过芝麻渣提取物的抑菌性研究，就是从整体的角度来做的。基于以上的分析思考，我以微生物的活性结构为分类依据，选取了低等真菌类： 酵母菌和丝状真菌霉菌黑曲霉；细菌类：革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌4
18、。3.2 芝麻渣提取物的提取方案和水浴锅加热问题3.2.1 提取方案通过查阅资料和思考得到这样的结论2: 提取不同极性的混合成分时，选择单一的溶剂把他们全部提取出来是困难的。 当原料中各成分的极性比较小时，选择亲脂性溶剂，如氯仿；当原料中各成分的极性比较大时，选择亲水性溶剂，如水；当原料中各活性成分有相当比例的大极性和小极性共存时，选择中性溶剂，如乙醇； 综合与的结论，得：抑菌试验中，为得到适当的提取物，用单溶剂提取时，选择合适极性的溶剂，以回流提取的方式，延长提取时间。 大多数蛋白质在中等温度短时间内加热，会发生可逆性变性；在较高温度长时间加热会发生不可逆变性。基于这一点以及芝麻油的生产流程
19、，有这样的结论：芝麻渣中的绝大部分蛋白质都已失去活性，被视为非活性部分。 芝麻中各成分及含量：芝麻油61.7%，芝麻蛋白21.9%，芝麻木聚糖1%，以及丰富的芝麻素，芝麻油酚，卵磷脂，脂溶性维生素A、D、E等。由此可知，芝麻渣中含有大量的小极性成分，这是基于种子的油性。 芝麻油是不具有抑菌活性的，它是一种营养成分，而芝麻中的芝麻素和甾醇等是抑菌物质。研究结果表明:芝麻含油率为46.48%58.28%,油中芝麻素的含量为0.1152%0.7773%,芝麻素含量与芝麻含油率呈正的显著相关,相关系数为0.556。白芝麻油的芝麻素平均含量比黑芝麻油的芝麻素平均含量高。用正己烷从芝麻油脚中提取出芝麻油;
20、以此芝麻油为原料,采用甲醇提取芝麻素。对芝麻素的提取工艺进行研究,确定最佳提取工艺条件为:提取温度60、萃取时间2.5h、料液比1:3;提取率83.7%,产品纯度为67.5%。采用乙醇对芝麻素粗提产品进行结晶纯化,确定最佳结晶纯化条件为:料液比(g/mL)1:40、养晶温度25、养晶时间2h。在上述结晶条件下,经过四次结晶,最终产品的纯度为91.2%6综合这些信息，我确定了芝麻渣提取物的提取方案： 将芝麻渣粉碎干燥，取25g装入滤纸筒中。 用200ml氯仿回流脱脂14h，对芝麻渣进行固液萃取(脱去非活性的芝麻蛋白)。 以提取温度60、萃取时间2.5h、料液比1:3的方案，对芝麻油进行液-液萃取
21、（脱去非活性的油脂）。 把上清液旋转蒸发得浓缩液，用吸管转移至小玻璃瓶中，真空干燥12d，得提取物固体，然后冷冻保藏备用。3.2.2 水浴锅加热问题5该实验中涉及到一个水浴锅加热的问题，尤其对于需要较高的温度较长的时间使用水浴锅更有必要进行研究，以确定多少水量多高温度能加热维持多长时间而不至于水浴锅蒸干。为此研究如下： 水的蒸发过程可用公式表示为： 液体的加热有三种方式，第一种是密闭式加热（上左图），第二种是开放式回流加热（上中图），第三种是开放式无回流加热（上右图）。当三种方式使液体维持在相同的温度时， 最终有不同的表现。密闭式容器中，V正=V逆，液体数量最终恒定；开放式回流加热容器中，烧瓶
22、内V正V逆，冷凝管内V正V逆，液体数量最终恒定；开放式无回流加热容器中，V正V逆，液体数量始终不断减少，直至蒸干为止。我所研究的液体便是第三种方式：开放式无回流加热。由于V正V逆，所以我把表观蒸发速率近似为真实蒸发速率。故我在研究水的加热蒸发过程中，只考虑 的正向变化过程。根据化学反应微观过程的碰撞理论，一个可能的化学反应能否实际发生取决于反应物分子的碰撞速度和碰撞方向;只有以适当的方向和适当的速度才可以使化学反应发生，这样的碰撞称为有效碰撞。水分子在液相和固相间的转化也有相似的过程。液体表面的水分子只有以适当的方向和适当的速度才可以使相变发生，即水分子挣脱液相进入气相。因此，我把物理变化中，
23、液相与气相间的转化类比于化学变化中反应物与产物间的转化。在化学反应动力学中，为了描述温度T对反应速率k（速率系数，在一定温度下，k有定值，与反应物的浓度无关，在数值上相当于反应物的浓度等于单位浓度时的化学反应速率）的影响，瑞典化学家S.A.Arrhenius 在Vant Hoff近似规律的基础上总结出了温度对速率系数影响的经验公式：，称为Arrhenius经验式 ,其中，A是指前因子，Ea是实验活化能，R是理想气体平衡常数。Arrhenius经验式最初是从气相反应中总结出来的，后来发现液相也适用。此公式不但适于基元反应，也适于非基元反应（总反应）。以上这些反应均是化学反应，那么Arrheniu
24、s经验式是否有可能也适于某些物理反应呢？例如纯物质的相变平衡？为进一步理解该公式，接下来讨论一下活化能。我们知道基元反应的活化能是有明确的物理意义的。目前比较统一的是采用托尔曼的统计的说法，即基元反应的活化能等于活化分子的平均能量与反应物分子平均能量的差值。所谓活化分子，即满足有效碰撞所需要的最低动能的反应物分子。类似的，对水分子来讲，液体表面的水分子只有达到一定的速度才有可能逃离液体的束缚，变为气态分子，这样的分子类似于化学反应中的活化分子。设这样的分子所具有的动能为，我称它为逸出能量。如果把液体表面的所有水分子从统计学上看，那么所有这些分子的平均能量类似于化学反应中反应物分子的平均能量。设
25、这样的分子所具有的动能为E，我称它为统计能量，则相当于活化能Ea，我称它为活物能。其中是与温度无关的值,E则随温度的增大而增大并且E0.在化学反应中，E0相当于Ea0。E=E表明活物能不是一个定值，它随温度的增大而减小，在大多数情况下，Ea的变化不大。根据Arrhenius经验式的不定积分式，反映在lnk-1/T直线上就是在温度区间很大时有时会发生较明显的弯折。为此，我设计进行了水的蒸发速率与温度关系的实验来粗略验证我的猜想:Arrhenius经验式有可能适于探究纯物质的蒸发速率与温度的关系。水的蒸发速率与温度关系的实验数据因素数 据温度T, 405060708090时间t,min161161
26、157139128105液面下降距离h,mm369142126蒸发速率k,mm/min0.01860.03730.05730.10070.16410.24761/T0.02500.020.01600.01430.01250.0111lnk-3.9846-3.2888-2.8595-2.2956-1.8073-1.39594090409040-606090实验结果表明：温度为60 时，lnk-1/T直线发生了明显的弯折，60 以上和60 以下很接近直线（R很接近1），整体较接近直线（R大约为1）。这与理论是相符的，从而证明了Arrhenius经验式应用于探究水的蒸发速率与温度关系的可行性，为应用
27、于探究纯物质的蒸发速率与温度的关系和进一步对Arrhenius经验式的应用推广提供了依据。于是有：当0T60时,当60T100时，.该实验中水浴加热的温度是80，水浴深度90mm,所以.故时间t=900.1651=545min=9h.所以，在本实验中水浴加满后80下能加热维持9h。为此，为了实现加热14h的目的并防止水熬干，我利用虹吸原理，可用一个橡皮管的一端连接加热的水浴锅，另一端连接供水的水浴锅，这样整个加热系统相当于拥有了2倍的水深，维持时间延长至18h，而且虹吸的作用使得冷水向热水中以极其缓慢的速度流动，故对热水的温度造成的影响可以忽略。从而，彻底解决水浴锅加热的问题。3.3 菌种的保
28、存、分离和鉴定1微生物在繁殖的过程中会发生自发突变。设微生物在群体中自发突变的频率率为P并以二分裂的形式周期繁殖并认为繁殖中无个体死亡，个体繁殖能力恒定。群体中有N个正常的，1个是突变的。并设此时为第0代。.则有： 正常 突变第0代 1第1代 第2代 第3代 第n代 则未突变的个体占总体的比例为 该结果表明：当一个纯种无限次的转接时菌种的未突变体比例逐渐减小，菌种的突变体比例逐渐增大，最终导致菌种质的变化。这种现象在微生物学上称为菌种的衰退。菌种的衰退是发生在微生物细胞群中一个由量变到质变的逐步演化过程。开始时，在一个大群体中仅个别细胞发生自发突变（一般均为负变或正变频率远大于负变频率），这时
29、如不及时发现并采取有效措施，而仍一味地移种传代，则群体中这种负变个体的比例就逐步增大，最后会发展成为优势群体，从而使整个群体表现出严重的衰退。所以，开始时的“纯”菌株实际上早已包含一定程度的不纯因素。但是，即使整个群体都已衰退时，其中仍有少数尚未衰退的个体存在其中。这一点是影响抑菌实验的一个重要因素。所以，我们在用传代培养法保存菌种时，要定期的对菌种进行分离纯化和镜检，以筛选具有典型特征的纯种。这个过程在微生物学上称为菌种的复壮。 为了保证我们所使用的菌种的纯度，接下来我们来进一步分析纯种分离法。我们知道，在衰退的或污染的菌种中，还存在着仍保持原有典型性状的个体。通过纯种分离法，设法把这种细胞
30、挑选出来即可达到纯化的目的。纯种分离法有很多，大体可分为两类：一类较粗放，可达到菌落纯（菌种纯）水平，另一类较精细，可达到菌株纯（细胞纯）水平 。 “菌落纯” 是形态学水平，它是从微生物集体形态菌落和微生物个体形态细胞来进行定义的；“菌株纯” 是遗传学水平，它是从一个细胞通过遗传繁殖扩增来获得微生物来进行定义的。菌落纯和菌株纯代表微生物纯度的两个等次，根据具体实验的要求，来选择微生物的纯度。本实验所要求的微生物纯度为菌落纯。在实验室中，我们常用稀释平板法和平板划线分离法都是通过把菌体稀释来达到分离目的的。平板划线分离法是一种固体性稀释，稀释平板法是一种液体性稀释。由于液体的流动性比固体的流动性
31、好，所以菌体在液体中更易于分散，因此，稀释平板法优于平板划线分离法。稀释平板法有涂布平板和倾注平板两种方法。涂布平板使菌体分布在二维平面上，倾注平板使菌体分布在三维空间上。另外，倾注平板要求菌体有一定的耐热能力。综合这两方面，抑菌实验常选用涂布平板法观察抑菌圈。 根据以上的分析，为了判断所用菌种是否达到菌落纯，可以这么去做：首先通过稀释涂布或划线分离观察菌落形态，然后通过镜检观察个体形态。接下来讨论镜检的问题：如何通过个体形态来判断菌种是否纯呢？首先，我们来分析细菌的繁殖问题。实验表明，绝大部分的细菌是以典型的二分裂方式进行的，它是一种对称的二分裂方式：由一个母细胞通过细胞伸长，隔膜的形成到最
32、后分裂为两形态、大小和构造完全相同的子细胞。这便是菌种个体形态镜检观察进行判断的一个重要依据。 3.4 抑菌实验的其他问题3.4.1 培养基的选择 马丁氏培养基是一种人工合成的适于真菌的选择性分离培养基。它具有分离能力的关键因素是培养基的营养成分和抑制剂。PDA（马铃薯蔗糖琼脂培养基）是一种天然的适于真菌的培养性培养基。故本实验选择PDA而不是马丁氏培养基来培养真菌。3.4.2 抑菌圈的影响因素 菌悬液浓度单位体积内含菌量越多，意味着与单位药物接触的菌越多，则单个菌所接触的药物就越少。另一方面，药物在滤纸片上扩散的结果是形成一个连续的浓度梯度。故距滤纸片中心越远的地方，药物浓度越小，受菌悬液浓
33、度的影响越明显。故选择合适的菌悬液浓度是必要的。什么样浓度的菌悬液才是合适的呢？如果微生物被培养一段时间后，一个培养平板的表面全部被单层的微生物所密铺，则符合此要求的的菌悬液浓度是理想的，合适的。如果微生物培养比较短的一段时间，会形成一个个很小的菌落，由于是短期培养，单个微生物沿平面方向繁殖的阻力很小，故菌落内的微生物大部分都是单层挤在一起的，故我们可视这样的菌落为单层菌落。假定细菌培养12h，真菌培养24h后，形成的微小菌落是单层菌落，菌落直径的范围是0.25mm1mm.常用的培养皿，皿底直径90mm,高15mm.做抑菌实验室，我们向皿内滴加0.1ml菌液。基于以上三点有：单层菌落面积为 所
34、以单菌落面积的范围 /64S/4又因为皿底面积为 所以若使所有菌落密铺整个皿底，需菌数为 因为我们向皿内滴加0.1ml菌液，所以菌悬液浓度为 所以菌悬液浓度范围是 在实际运用中，考虑到菌体的的系统损失和菌体间的抱团作用，菌悬液浓度一般取。 滤纸片大小滤纸片的大小反映了容纳药物量的大小。滤纸片越大，其含药量越多；滤纸片越小，其含药量越少，而含药量的多少会影响药物在滤纸片上及周围扩散的时间，从而影响药物梯度半径的大小。滤纸片越大，药物扩散越持久，梯度半径越大；反之，滤纸片越小，药物扩散越短暂，梯度半径越小。做抑菌实验时，我们要确保一个平板上的多个滤纸片的药物扩散不相互干扰。因此，选择合适大小的滤纸
35、片是必要的。 提取物极性4我们所使用的琼脂平板是水性的，即具有很大的极性。根据极性相似兼容的原理，提取物的极性与琼脂平板的极性越相似，提取物越易于在琼脂平板上扩散；反之，提取物的极性与琼脂平板的极性越不相似，提取物越不易于在琼脂平板上扩散。故对于极性小的提取物，我们要添加表面活性剂，与药物形成水包油（W/O）型，间接地增大提取物的极性，便于在琼脂平板上扩散，从而影响抑菌圈的大小。 培养基厚度因为菌体是涂布在培养基表面，我们要求的是药液沿有效方向（平面方向）作用于菌体，实际中药液不仅有平面方向的扩散，还有垂直于平面方向的扩散，故选择合适培养基的厚度是必要的。一般情况下，我们向皿底直径90mm,高
36、15mm（常用型号）的培养皿中注入15ml左右，在实际操作中，以培养基能铺满皿低为准。 培养时间微生物随着培养时间的增加，抑菌圈从无到有，然后一个稳定不变时期，最后逐渐变小直至消失。3.4.3 菌悬液的稀释菌悬液的稀释问题本质上属于分散系的稀释问题。分散系的稀释有两种方法：一次性稀释和梯度性稀释。在实际操作中，我们选择那种方法并不是任意选择的。当一种分散质的分散系浓度很高的时候，分散质在分散系中并不是均匀分散的，在高浓度的强电解质溶液中，离子间会聚集形成离子酚，在其它高浓度分散系中会有类似的不均匀现象。故较为科学的方法是梯度稀释，减小误差。当分散系的浓度比较小时，分散质在分散系中彼此间的影响就
37、会减弱，使分散质趋于均匀，这样我们就可以采用一次性稀释了。故具体选择哪种方法，要根据具体的情况。本实验中，菌悬液采用梯度稀释来计算菌悬液浓度并通过该法来获得终浓度。3.4.4 霉菌孢子液的制备3霉菌由菌丝体和孢子组成。组成菌丝体的微生物个体彼此紧密结合，不易于用接种环刮取，在溶液中也不易于分散和显微计数。相反，孢子则易于分散和显微计数。故霉菌菌悬液常用其孢子来制备。如何制备呢？如果按照制取细菌菌悬液的方法，则易把菌丝体，培养基连同孢子一起混合在溶液中，给显微计数带来困难甚至失败除非把上述混合液无菌过滤得其孢子悬液。在微生物学实验中，我们曾用印片法来观察丝状真菌的孢子。在实验过程中，把盖玻片稍稍
38、微热一下，盖在丝状真菌菌落上，片刻后取出玻片40倍镜检，我们会发现玻片上密密麻麻的沾满了孢子几乎没有菌丝体。正基于这一点，我觉得可以把这种方法用于丝状真菌孢子悬液的制备，从而解决上面的问题。我的具体方法是这样的：把真菌从斜面接到平板上，培养天，待其产生大量孢子。在大培养皿底部铺一张滤纸，把适量数目的干燥的盖玻片单个无重叠的分散在滤纸上，盖上皿盖，高温灭菌，之后40恒温干燥，备用。无菌操作，迅速把40恒温干燥好的盖玻片逐个盖在真菌菌落上并适当按压。片刻后，把适当数目的玻片放入装有玻璃珠的灭菌生理盐水三角瓶中（便于悬浮和分散均匀）并取出一片放在载玻片上，镜检，观察相邻孢子的间距，取平均值并测量载玻
39、片的边长，据此粗略估算每个玻片上的孢子数，从而根据溶液体积和目标悬液浓度确定向三角瓶加入适当数目的玻片。这样一来，孢子悬液制备的问题就解决了。我的实验证明，通过这种方法，孢子的得率远大于一般的方法，每个盖玻片上的孢子数达106107个，而且不含菌丝体和培养基碎屑。3.4.5 菌悬液的涂布 水在琼脂培养基表面的张力大于水在玻璃表面的张力。这意味着玻棒与琼脂培养基表面的水滴接触后，当玻棒从琼脂培养基表面移去时，水滴的大部分仍会附着在琼脂培养基表面。在实际操作中，你会发现水滴会随着玻棒的推动而随其移动，这主要是由于玻棒与琼脂培养基表面会形成微小的夹角，对液体产生了毛细作用，从而牢牢地束缚着液滴。夹角
40、大小取决于玻棒的粗细或玻棒截面的圆的曲率，曲率越小，玻棒越粗，玻棒与琼脂培养基表面形成的夹角越小，其毛细作用也越明显。根据以上的分析，为使菌悬液涂布均匀，应采用连续涂布或涂布时玻棒从哪里拿起接着从哪里继续涂布。总结起来是：玻棒的粗细，涂布次数，涂布方法，琼脂培养基表面平整与否都是菌液涂布是否均匀的影响因素。除此之外 ，还有一个涂布结果成功与否的关键因素，即琼脂培养基表面要保持一定的干湿程度。刚倒好的平板冷凝后琼脂培养基表面含有有很多水份，如果立即滴加菌液开始涂布，菌体未及时渗入培养基内，由于水份的蒸发，培养皿放置倾斜等因素，会导致已涂布均匀的菌液在放置培养时，琼脂培养基表面的菌液流动，最终出现
41、琼脂培养基表面一端菌落稀疏，另一端菌落致密甚至连成一片，致使涂布失败。如果正置平板恒温干燥，在皿盖上最终会形成水雾或水滴。当倒置培养时，皿盖上形成的水雾或水滴又会蒸发至培养基表面，使其可能形成水滴，在上面游走，使已涂布的平板失败。故一般情况下，涂布前应无菌吹干琼脂培养基表面（移去皿盖）过多的水份，或倒置一夜，第二天进行涂布。3.4.6 点的均匀分布在一维空间中，任意相邻两点之间间距相等，我们称这样的点在一维空间上的分布是均匀的，简称点均匀分布,这是点均匀分布的一个重要的基本性质。在二维及三维空间中，如果任意方向的一维上的点的分布是均匀的，我们可以定义点在二维及三维空间上的分布是均匀的。在一维中
42、，相邻两点之间形成一条线段。我们会发现，在这条线段内除了两个端点外，再无其他的点。我把这两个端点称为界点，这条线段称为基体。根据点均匀分布的基本性质，如果这些基体彼此之间可以相互平移而密铺于整个一维空间上，则这些点所形成的基体在一维上是分布均匀的。我称这个性质为点均匀分布的平移性。据此，我们可得到二维空间（三维空间）点均匀分布的情形：在二维空间（三维空间）中，若点中的有限个点形成一个封闭多边形（封闭凸多面体），除了封闭多边形（封闭凸多面体）的边（棱）上的端点外，它的内部再无其他的点，那么这有限个点就称为界点，这样的封闭多边形（封闭多面体）就就称为基体，并且基体可有不同的种类。如果点在在一维、二
43、维与三维空间中，存在一种基体，使得该种类的所有基体彼此间可通过平移而密铺于整个空间，则称点所形成的基体在一维、二维与三维空间上的分是均匀分布的,简称基体均匀分布.如果点在空间中是均匀分布的,则点必定在基体中也是均匀分布的.故点均匀分布的充要条件是基体在空间中是均匀分布的并且点在基体中也是均匀分布的. 点在基体中的均匀分布问题可以理解为顶点（端点）在线段、凸多边形、凸多面体上的分布问题.的的根据这个定义，我们可以很容易的设计出点在空间上均匀分布的不同种类的理想模型。3.4.7 菌体浓度的估算假设微生物在溶液中是分布均匀的，根据上面4.4中点均匀分布的定义，我设计了这样的微生物在三维空间上均匀分布的近似理想模型：8个微生物个体形成一个微小的正方体单元，其中8个微生物个体作为界点，正方体单元为基体。我们取一个很大体积的液体，其体积为V，液体中菌的浓度为C.为方便讨论，设其形状为正方体。于是，该正方体可以被看作由许许多多个正方体型的基体组成，基体的每个顶点代表一个菌体，基体的边长代表菌体间距L。根据上面的一系列假设，有：液体边长AB为 我在液体的每一个边上插入k个等分点（界点），则液体中等分点（界点）总数N为 所以 即 所以