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1、第六章第六章 重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定 将目的基因与载体连接形成重组子将目的基因与载体连接形成重组子, ,然后通过各种然后通过各种方法将重组子导入宿主细胞方法将重组子导入宿主细胞, ,得到所需要的带有重组得到所需要的带有重组DNADNA的转化子是基因工程的目的所在的转化子是基因工程的目的所在. . 何谓转化子何谓转化子? ? 所谓所谓转化子转化子就是导入外源就是导入外源DNADNA后获得了新的遗传标后获得了新的遗传标志的志的细菌细胞细菌细胞或或其他受体细胞其他受体细胞. . 为什么对重组子要进行鉴定筛选为什么对重组子要进行鉴定筛选? ? 在转化反应中在转化反应中, ,并非所有的细胞
2、中都转入重组并非所有的细胞中都转入重组DNADNA分子分子, ,即使所有的受体细胞都变为转化体即使所有的受体细胞都变为转化体, ,所获得的转所获得的转化子仍是多种类型的化子仍是多种类型的DNADNA分子分子, ,原因是在连接反应中会原因是在连接反应中会有以下几种情况发生有以下几种情况发生: :载体和一个或数个串联目的基因连接载体和一个或数个串联目的基因连接载体发生自连载体发生自连目的目的DNADNA分子发生自连分子发生自连未发生连接反应的载体和目的未发生连接反应的载体和目的DNADNA片段片段( (更多更多) ) 为什么对重组子要进行鉴定筛选为什么对重组子要进行鉴定筛选? ? 因此因此, ,在
3、成千上万个转化子中，真正含有期望的在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组重组DNADNA分子的分子的比例很少比例很少，为了将，为了将含有含有外源外源DNADNA的宿的宿主细胞和主细胞和不含不含外源外源DNADNA的宿主细胞的宿主细胞分开分开，以及将含有，以及将含有正确重组子正确重组子的宿主细胞和含有的宿主细胞和含有其他外源其他外源DNADNA的宿主细的宿主细胞胞分开分开，就需要设计出最易于筛选重组子克隆的方，就需要设计出最易于筛选重组子克隆的方案并加以验证。案并加以验证。 常用的重组子筛选和鉴定方法常用的重组子筛选和鉴定方法 重组子大小的鉴定重组子大小的鉴定( (质粒质粒DNADNA的快速提
4、取鉴定的快速提取鉴定) ) 重组子酶切图谱鉴定重组子酶切图谱鉴定(限制性核酸酶酶切片段限制性核酸酶酶切片段 大小鉴定大小鉴定) DNA序列分析序列分析 同源性分析鉴定同源性分析鉴定(原位杂交原位杂交) 质粒载体的抗性标记筛选质粒载体的抗性标记筛选 噬菌体包装容量的正性筛选噬菌体包装容量的正性筛选 质粒载体的质粒载体的互补筛选互补筛选( (蓝白色斑筛选法蓝白色斑筛选法) ) 标记补救筛选标记补救筛选 翻译产物翻译产物( (Western blot) ) 转录产物转录产物( (Norther blot) ) 其他方法其他方法( (报告基因报告基因)DNADNA鉴定鉴定载体载体筛选筛选直接直接筛选筛
5、选间接间接筛选筛选重组重组子的子的筛选筛选第一节第一节 遗传学检测法遗传学检测法一、根据载体表型特征的筛选一、根据载体表型特征的筛选 根据载体分子所提供的表型特征根据载体分子所提供的表型特征, ,选择重组体选择重组体DNADNA分子的遗传选择法分子的遗传选择法, ,可适用于大量群体的筛选可适用于大量群体的筛选, ,因此是因此是一种一种比较简单而又十分有效比较简单而又十分有效的方法。在的方法。在基因工程基因工程中使中使用的所有载体分子用的所有载体分子, ,都都至少含有一个选择标记至少含有一个选择标记。质粒质粒常常有有抗生素抗性基因抗生素抗性基因, ,如如氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（A
6、mpAmpr r）、四环素抗性基因（四环素抗性基因（TetTetr r）、卡那霉素抗性基因（）、卡那霉素抗性基因（KanKanr r）根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选, ,是获得重是获得重组体组体DNADNA分子必不可少的条件之一。分子必不可少的条件之一。 在实际操作中在实际操作中, ,最典型最典型的方法是使用抗药性标记的的方法是使用抗药性标记的插插入失活入失活作用作用, ,或是或是- -半乳糖苷酶基因的显色反应半乳糖苷酶基因的显色反应, ,将重将重组体组体DNADNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来.
7、 .而对于而对于噬菌体的置换型载体噬菌体的置换型载体来说来说, ,噬菌体头部外壳蛋噬菌体头部外壳蛋白容纳白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控的能力是有一定限度的。其包装能力应控制在野生型制在野生型DNADNA长度的长度的75%-105%75%-105%之间（之间（36-51kb36-51kb），这），这样才能样才能形成噬菌斑形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了。因此，包装限制这一特性，保证了体外重组所形成的有活性的体外重组所形成的有活性的重组体分子，一般都应带重组体分子，一般都应带有外源有外源DNADNA的插入片段，的插入片段，噬菌斑噬菌斑的形成本身就是的形成本身就是重组体重
8、组体的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选，的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选，所以又称为所以又称为平板筛选法平板筛选法。一、根据载体表型特征的筛选一、根据载体表型特征的筛选（一）抗药性标记插入失活筛选法（一）抗药性标记插入失活筛选法检测外源检测外源DNADNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。插入作用的一种通用方法是插入失活效应。1.1.以以pBR322质粒为例质粒为例（1 1）pBR322质粒的一般特性质粒的一般特性 在在pBR322pBR322质粒上有质粒上有两个两个抗生素基因，抗生素基因，AmpAmpr r基因内有基因内有一个一个PstPst限制性核酸内切酶
9、的限制性核酸内切酶的唯一唯一识别位点，识别位点，TetTetr r基基因内有因内有BamHBamH和和SalSal两种限制性核酸内切酶两种限制性核酸内切酶单一单一识别识别位点。位点。一、根据载体表型特征的筛选一、根据载体表型特征的筛选（一）抗药性标记插入失活筛选法（一）抗药性标记插入失活筛选法1.1.以以pBR322质粒为例质粒为例（2 2）筛选重组体的原理筛选重组体的原理 在在Ampr和和Tetr这两个基因内的任一插入作用，这两个基因内的任一插入作用，都会导致都会导致Ampr基因基因或或Tetr基因基因出现功能性出现功能性失活失活，于是，所形成的重组质粒都将具有于是，所形成的重组质粒都将具有
10、AmpsTetr或或Amprtets的表型。的表型。 当当外源外源DNADNA片段插入片段插入pBR322质粒质粒DNADNA的的BamH或或Sal位点时，位点时，抗四环素基因失活抗四环素基因失活（Tetr Tets ），重），重组体转化子必定具有组体转化子必定具有AmprTets表型表型。因此，将转化菌。因此，将转化菌先涂布在含有先涂布在含有Amp的琼脂平板上的琼脂平板上，并将存活的，并将存活的Ampr菌菌落落原位影印原位影印到另一个含有到另一个含有Tet的琼脂平板上的琼脂平板上，凡是在，凡是在Amp平板上生长平板上生长，而，而不在不在Tet平板上生长的菌落平板上生长的菌落，就，就必必定是定
11、是已经插入了外源已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆片段的重组质粒转化子克隆. .如下图所示如下图所示同样同样, ,在在pBR322pBR322质粒的质粒的AmpAmpr r基因序列中基因序列中, ,利用利用PstPst限制性核酸内切酶识别位点限制性核酸内切酶识别位点, ,插入外源插入外源DNADNA片段片段, ,也也能应用插入失活作用检测重组质粒能应用插入失活作用检测重组质粒, ,当然当然, ,所挑选所挑选的菌落就应该是具有的菌落就应该是具有AmpAmps sTetTetr r的表型的表型一、根据载体表特征的筛选一、根据载体表特征的筛选（一）抗药性标记插入失活筛选法（一）抗药性标记插
12、入失活筛选法pBR322pBR322pBR322AmprTetrAmprTetrAmprTets+ +菌落原位影印菌落原位影印Amp琼脂平板琼脂平板Tet琼脂平板琼脂平板图图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体一、根据载体表特征的筛选一、根据载体表特征的筛选（二）（二）- -半乳糖苷酶显色反应半乳糖苷酶显色反应筛选法筛选法1.1.乳糖操纵子的结构乳糖操纵子的结构阻遏蛋白阻遏蛋白- -半乳半乳糖苷酶糖苷酶- -半半乳糖苷乳糖苷透过酶透过酶- -半乳糖半乳糖苷乙酰基苷乙酰基转移酶转移酶mRNAmRNAlacAlacYlacZlacOPZYAlacIPIRNA聚
13、聚合酶合酶一、根据载体表特征的筛选一、根据载体表特征的筛选（二）（二）- -半乳糖苷酶显色反应半乳糖苷酶显色反应筛选法筛选法2.2.- -半乳糖苷酶显色反应筛选法原理半乳糖苷酶显色反应筛选法原理 有许多质粒载体具有有许多质粒载体具有- -半乳糖苷酶显色反应的检半乳糖苷酶显色反应的检测功能测功能. . 应用这些载体系列，当外源应用这些载体系列，当外源DNADNA插入插入到它的到它的lacZlacZ基基因因上时，可造成上时，可造成- -半乳糖苷酶的失活效应半乳糖苷酶的失活效应，就可通过，就可通过大肠杆菌转化子菌落在添加大肠杆菌转化子菌落在添加X-gal-IPTGX-gal-IPTG培养基中的培养基
14、中的颜颜色变化色变化鉴别出重组子和非重组子。鉴别出重组子和非重组子。一、根据载体表特征的筛选一、根据载体表特征的筛选（二）（二）- -半乳糖苷酶显色反应半乳糖苷酶显色反应筛选法筛选法3.3.举例举例 pUC质粒质粒：带有：带有- -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控）的调控序列序列和和- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端端146个氨基酸的编码序列个氨基酸的编码序列。这。这个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位点的多克隆位点，但并点的多克隆位点，但并没有破坏没有破坏lacZ的阅读框架。的阅读框架。 大肠杆菌菌株：大肠杆菌菌株：带有
15、带有- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分序列的端部分序列的编码信息。编码信息。 在各自独立的情况下，在各自独立的情况下，pUC质粒和大肠杆菌编码的质粒和大肠杆菌编码的- -半乳糖苷酶片段都没有活性。半乳糖苷酶片段都没有活性。一、根据载体表特征的筛选一、根据载体表特征的筛选（二）（二）- -半乳糖苷酶显色反应半乳糖苷酶显色反应筛选法筛选法3. 3. 举例举例 当质粒转化大肠杆菌后当质粒转化大肠杆菌后, ,可形成可形成具有酶活性具有酶活性的蛋白的蛋白质质, ,它在生色底物它在生色底物X-gal的存在下被的存在下被IPTG( (异丙基异丙基- -D-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷）诱导形成）诱导形成蓝色
16、菌落蓝色菌落。当外源片段。当外源片段插入插入到到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导致质粒的多克隆位点上后，则会导致读码框架改读码框架改变变，表达蛋白，表达蛋白失活失活，因此，在同样条件下含重组质粒，因此，在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落白色菌落。因。因此，根据这种此，根据这种- -半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质粒与自身环化的载体粒与自身环化的载体DNADNA分开。分开。二、根据插入基因遗传性状的筛选二、根据插入基因遗传性状的筛选( (一一) )原理原理 重组体重组体DNADNA分子转化到大肠杆菌
17、受体细胞后分子转化到大肠杆菌受体细胞后, ,如果如果插入在载体分子上的外源基因插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表能够实现其功能性的表达达, ,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成形成互补互补, ,那么就可以利用营养突变株进行筛选那么就可以利用营养突变株进行筛选. .( (二二) )举例举例 当外源目的基因为合成当外源目的基因为合成亮氨酸的基因亮氨酸的基因时时, ,将该基因将该基因重组后转入重组后转入缺少缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中亮氨酸合成酶基因的菌株中, ,在仅仅在仅仅缺缺少少亮氨酸的基本培养基上筛选亮氨酸的基本培养基上筛选
18、, ,只有只有能利用能利用表达产物亮表达产物亮氨酸的细菌才能氨酸的细菌才能生长生长, ,因此因此, ,获得的获得的转化子转化子都是都是重组子重组子. .将噬菌体感染形成的噬菌斑将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性影印在硝酸纤维膜上变性 带带有目的基因的放射性有目的基因的放射性DNADNA或或cDNAcDNA作探针进行杂交作探针进行杂交放射性自显放射性自显影影 杂交信号（杂交信号（黑点）黑点）对应的对应的噬菌斑噬菌斑即为阳性克隆即为阳性克隆。第二节第二节 核酸分子杂交检测法核酸分子杂交检测法一、菌落印迹原位杂交一、菌落印迹原位杂交 菌落印迹原位杂交的菌落印迹原位杂交的优点优点是：适于是
19、：适于高密度高密度菌落的菌落的筛选筛选, ,对于噬菌斑平板对于噬菌斑平板, ,它可以连续影印几张同样的硝它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜酸纤维滤膜, ,获得数张同样的获得数张同样的DNA印迹。因此，能够进印迹。因此，能够进行行重复筛选重复筛选，效率高效率高，可靠性强可靠性强，而且可以连续使用，而且可以连续使用两种两种或或数种探针数种探针筛选筛选同一套同一套重组体重组体DNADNA，是一种最常规，是一种最常规的检测手段。的检测手段。. . 核酸分子杂交：核酸分子杂交：.Southern.Southern杂交分析：杂交分析：由英由英国国SouthernSouthern（19751975）发明，
20、）发明，将琼将琼脂糖中脂糖中DNADNA转移到转移到尼龙膜尼龙膜进行进行DNADNA分子杂交分子杂交分析的方法。分析的方法。筛选基因库得到筛选基因库得到阳性克隆阳性克隆将限制性酶酶切与将限制性酶酶切与SouthernSouthern杂交杂交结合结合绘制限制性酶图谱绘制限制性酶图谱。.Northern.Northern杂交分析：杂交分析： 与与SorthernSorthern杂交的原理和杂交的原理和程序相同。程序相同。用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，平，检测检测mRNAmRNA的存在的存在。第三节第三节 物理检测法物理检测法重组质粒的快速提
21、取与酶切鉴定重组质粒的快速提取与酶切鉴定 经过遗传筛选得到的阳性克隆还必须进一步进行经过遗传筛选得到的阳性克隆还必须进一步进行鉴定，鉴定，酶切鉴定酶切鉴定是最常用的方法之一。是最常用的方法之一。 通过提取通过提取“阳性克隆阳性克隆”的质粒，酶切分析的质粒，酶切分析“阳性阳性克隆克隆”中质粒的中质粒的大小大小和和酶切图谱酶切图谱，通过这种方法鉴定，通过这种方法鉴定载体中是否含有外源载体中是否含有外源DNADNA片段，载体中是否含有正确的片段，载体中是否含有正确的目的目的DNADNA片段。这种方法判断的片段。这种方法判断的标准标准是目的是目的DNADNA分子和分子和载体的分子大小及酶切图谱。载体的
22、分子大小及酶切图谱。Mr12345678910Mr:DNA分子分子Marker; ;1 1: :目的目的DNA片段片段; ;2 2: :目的目的DNA片段片段EcoR酶切酶切; ;3 3: :空载体空载体EcoR酶切酶切; ;4-104-10: :为不同为不同”阳性克隆阳性克隆”质粒的质粒的EcoR酶切分酶切分析析; ; 从图中可看出从图中可看出: :4 4、5 5泳道泳道为不含插入片段的空载体；为不含插入片段的空载体；6 6、9 9泳道泳道虽然含虽然含有外源有外源DNADNA片段，但因为插入片段的大小和酶切图谱与目的片段不同，所片段，但因为插入片段的大小和酶切图谱与目的片段不同，所以为以为假
23、阳性假阳性；7 7、8 8、1010泳道泳道和和2 2泳道泳道的电泳图谱相同（除空载体对应的条的电泳图谱相同（除空载体对应的条带外），所以是带外），所以是阳性克隆阳性克隆。酶酶 切切 鉴鉴 定定 克克 隆隆 图图此外，还有其他方法，此外，还有其他方法，如：如：Western Western 杂交分析、杂交分析、核酸序列分析核酸序列分析、免疫化学检测法等免疫化学检测法等.Western .Western 杂交分析：杂交分析：用于用于蛋白质蛋白质的分析的分析。. . 核酸序列测定核酸序列测定：测定克隆后的测定克隆后的DNADNA片段核酸序列片段核酸序列 。采用采用SangerSanger（1977
24、1977）发明的）发明的双脱氧核糖核酸双脱氧核糖核酸终止法终止法测定核酸序列。测定核酸序列。在在SangerSanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记：. . 核酸序列分析：核酸序列分析：测定的核酸序列是否为测定的核酸序列是否为基因、有什么功能，需用计基因、有什么功能，需用计算机软件或生物学实验进一算机软件或生物学实验进一步分析。步分析。. .同源序列的分析：同源序列的分析：l 同源性比较：同源性比较：将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的比较基因间的同源性同源性，将序列发送到将序列发送到BlastB
25、last等等DNA DataDNA Data数据库进行比数据库进行比较。较。无任何同源性的新序列无任何同源性的新序列( (进行进行基因功能性研究基因功能性研究的方法的方法) ) 将基因导入生物体进行将基因导入生物体进行基因失活基因失活或或过量表达过量表达，根据，根据表型表型推测基因作用；推测基因作用； 用用噬菌体显现噬菌体显现（phage displayphage display）技术）技术； 酵母双杂交酵母双杂交系统进行蛋白质的功能分析。系统进行蛋白质的功能分析。 同源序列的分析：同源序列的分析：l阅读框架的分析：阅读框架的分析：一个一个ORFORF是一条能编码一条多肽链的是一条能编码一条多肽链的DNADNA序列，具有序列，具有翻译起始信号和终止信号等。翻译起始信号和终止信号等。